Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist der am häufigsten vorkommende maligne Hirntumor mit äußerst ungünstiger Prognose für die betroffenen Patienten. Typisch für die Tumore ist eine hohe Aktivität der Glykolyse zur Generierung von ATP und zur Bereitstellung von Makromolekülen für die Zellproliferation, während die oxidative Phosphorylierung auch in Gegenwart von Sauerstoff praktisch keine Bedeutung für die Generation von ATP hat, was auch als Warburg Effekt bekannt ist. Das natürlich vorkommende Carnosin (β-Alanyl-LHistidin) wirkt sich antiproliferativ auf Tumorzellen aus, was mit einer Inhibition der glykolytischen ATP Produktion einhergeht. Der Mechanismus der Inhibition ist weitgehend unverstanden und ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Im Rahmen der durchgeführten Arbeit wurde der Einfluss von Carnosin auf die mRNA Expressionen von für die Glykolyse relevanten Genen untersucht, wobei eine starke Induktion der Pyruvatdehydrogenase Kinase (PDK) 4 in drei GBM Zelllinien beobachtet wurde. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass L-Histidin den gleichen Effekt wie Carnosin zeigt, nicht jedoch β-Alanin, L-Alanin oder L-Alanyl-L-Histidin. Da Tumorzellen die intrazelluläre Gewebscarnosinase aber kaum die extrazelluläre Serumcarnosinase exprimieren, liegt die Vermutung nahe, dass die antineoplastische Wirkung des Carnosins auf die enzymatische Spaltung von Carnosin und die daraus resultierende Freisetzung von L-Histidin zurückzuführen ist. In weiteren Untersuchungen wurden Hinweise erbracht, dass Carnosin durch eine Beeinflussung von Histon-Deacetylasen, die endogene PDK4 mRNA Expression steigern könnte. Zusätzlich wurden die Proteinexpressionen der PDK1 und 4 unter dem Einfluss von Carnosin untersucht.

Da hochgradige Gliome nur eine geringe Tendenz zur Metastasierung aufweisen, beschränkte sich das klinische Wissen über diesen seltenen Krankheitsverlauf bisher im Wesentlichen auf die Erkenntnisse aus Einzelfallberichten und kleineren Fallserien. Eine detaillierte Analyse der beschriebenen Fälle war bisher nicht verfügbar. Die vorliegende Arbeit stellt eine systematische Auswertung der wissenschaftlichen Literatur über Patienten mit metastasierten Glioblastomen oder Gliosarkomen dar. Unser Ziel war es, sämtliche Publikationen zu berücksichtigen, welche bis April 2013 veröffentlicht worden sind. Mit Hilfe einer systematischen Literaturrecherche in den beiden Datenbanken PubMed und Web of Science konnten 215 Arbeiten identifiziert werden, welche insgesamt 357 Fallberichte enthielten. Die Prognose nach Diagnose einer Metastasierung ist infaust. In der untersuchten Patientenkohorte betrug die mediane Überlebenszeit lediglich 3.0 ± 0.4 Monate. Eine univariate Datenanalyse ergab, dass Geschlecht, Alter, der histologische Subtyp und das Zeitintervall zwischen der Diagnose des Primärtumors und der Metastasen die Überlebenszeit nicht beeinflussten. Im Gegensatz dazu war eine Metastasierung, die ausschließlich außerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS) auftrat, mit längeren Überlebenszeiten verbunden. In den letzten Jahrzehnten wurden offenbar keine entscheidenden therapeutischen Fortschritte erzielt. Fälle, die in Publikationen bis zum Jahr 2000 Erwähnung fanden, wiesen keine schlechteren Überlebenszeiten auf als die nach der Jahrtausendwende publizierten Fälle. Aktuell gibt es keinen Datensatz, der geeignet wäre, die vielfältigen Therapieansätze systematisch auf ihre Wirksamkeit hin zu überprüfen. Wir sehen hier die Notwendigkeit, ein zentrales Register zu etablieren.:1. Bibliographische Beschreibung 2 2. Abkürzungsverzeichnis 3 3. Tabellenverzeichnis 4 4. Abbildungsverzeichnis 4 5. Einführung 5 5.1.1. Klassifikation und Epidemiologie 5 5.1.2. Ätiologie 5 5.1.3. Diagnose 5 5.1.4. Molekularpathologie 7 5.1.5. Therapie 7 5.2. Metastasierung 9 5.2.1. Wege der Metastasierung eines Glioblastoms 9 5.2.2. Therapie im Fall einer Metastasierung 12 5.3. Zielsetzung 13 6. Publikationen in Originalsprache 15 6.1 An individual patient data meta-analysis on characteristics, treatments and outcomes of the glioblastoma/ gliosarcoma patients with central nervous system metastases reported in literature until 2013 15 6.2 An individual patient data meta-analysis on characteristics, treatments and outcomes of glioblastoma/ gliosarcoma patients with metastases outside of the central nervous system 23 7. Zusammenfassung der Arbeit 38 8. Anhang I 8.1. Übersicht über klinische Charakteristika I 8.2. Übersicht über die Prozedur der Literaturrecherche V 8.3. Literaturverzeichnis der Publikationspromotion VI 8.4. Verzeichnis der Patientenkohorte XI 8.5. Literaturverzeichnis der individuellen Patientendaten-Metaanalyse XXIII 8.6. Danksagung XXXIII 8.7. Lebenslauf XXXIV 8.8. Publikationen XXXVI 8.8.1 Erstautorenschaften XXXVI 8.8.2 Coautorenschaften XXXVI 8.8.3 Kongressbeiträge XXXVI 8.9. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit XXXVII

Title Complex preoperative brain tumor imaging Abstract The differentiation of glioblastoma, metastases and brain lymphoma using modern diagnostic imaging methods has a major impact on the strategy of further diagnostic examinations and treatment. In a group of 67 patients with glioblastoma and 31 with cerebral metastasis, the ability to differentiate them according to the evaluation of perfusion parameters changes in peritumoral white matter by T1 dynamic post-contrast magnetic resonance imaging was verified, with the positive predictive value in glioblastoma detection up to 91%. In a group of 36 brain lymphoma patients the importance of imaging submodalities and contribution of a complex magnetic resonance imaging protocol to detect lymphoma up to 80% were evaluated. Key words brain, glioblastoma, lymphoma, magnetic resonance imaging, neoplasm metastasis

So far, glioblastomas cannot be cured by standard therapy and have an extremely poor median survival of about 15 months. The photodynamic therapy (PDT) with next generation photosensitizers, reaching a higher therapeutic depth, might offer a new, adjuvant treatment strategy in brain cancer therapy. Here, we investigated the effect of THPTS-PDT combined with ionizing irradiation (IR) on glioblastoma cells in vitro and in vivo. Results: THPTS colocalized to mitochondria and was not found in the nucleus. THPTS (2–20 μg/ml)-PDT significantly reduced the proliferation, metabolic activity and clonogenic survival and induced cell death mainly through apoptosis and autophagy. THPTS-PDT combined with IR decreased the clonogenicity significantly compared to single treatments. THPTS (≤ 300 μg/ml) alone showed no dark toxicity. The maximum therapeutic depth of THPTS-PDT in C6 glioblastomas was 13 mm. Materials and Methods: Three human glioblastoma cell lines (U-87 MG, A-172, DBTRG-05MG) were incubated with THPTS (1–300 μg/ml) 3–24 hours before laser treatment (760 nm, 30 J/cm²). THPTS localization and effects on metabolic activity, proliferation, cell death mechanisms and long-term reproductive survival were assessed. IR was conducted on an X-ray unit (0.813 Gy/min). Results were verified in vivo on a subcutaneous C6 glioblastoma model in Wistar rats. Conclusions: This study demonstrated efficient THPTS-PDT in glioblastoma cells, in vitro and in vivo. The combinatorial effects of THPTS-PDT and IR are of specific clinical interest as enhanced eradication of infiltrating glioblastoma cells in the tumor surrounding tissue might possibly reduce the commonly occurring local relapses.

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Fehlregulationen von nichtkodierenden RNAs können Einfluss auf die Tumorgenese, Proliferation und Invasion verschiedenster Tumortypen, unter anderen auch auf das Glioblastom, nehmen. Das Glioblastom stellt nicht nur den häufigsten, sondern mit einer mittleren Überlebensrate von lediglich 14 Monaten auch den tödlichsten Hirntumor dar. Ein tieferes Verständnis der molekularen Grundlagen, die hinter dem hochinvasiven Verhalten dieses aggressiven Tumors liegen, ist folglich von großer Bedeutung, um neue gezielte Therapieansätze entwickeln zu können. In der vorliegenden Arbeit wurde die lange nichtkodierende RNA STAiR18 als möglicher Regulator der zellulären Funktionen von Glioblastomzellen strukturell und funktionell charakterisiert. STAiR18 zeigt eine ubiquitäre Expression in allen untersuchten humanen Geweben, wobei es durch zelltypspezifische, alternative Spleißvorgänge zu einer hohen Anzahl verschiedener Transkriptvarianten kommt, deren Expressionslevel einer strikten Regulation unterliegen. Die für dasGlioblastom spezifische Transkriptstruktur von STAiR18 wurde mit Hilfe der neuartigen MinIONTM Sequenzierung aufgeschlüsselt und ausgewählte Transkriptvarianten mittels in situ Hybridisierung visualisiert. Die erhöhten Expressionslevel von STAiR18 in jedem untersuchten Tumortyp im Vergleich zum Normalgewebe könnten auf eine umfassende Rolle von STAiR18 während der Tumorgenese hindeuten. Zur Analyse der physiologischen Funktion wurde STAiR18 mittels RNAi in Glioblastomzellen ausgeschaltet, was sich auf die Adhärenz sowie das Migrations- und Invasionsverhalten der Zellen auswirkte. Im Rahmen globaler Transkriptomanalysen konnte eine Vielzahl von infolge des STAiR18-Knockdowns unterdrückten oder induzierten Zielgenen identifiziert werden, wobei die einzelnen Transkriptvarianten von STAiR18 unterschiedliche Gensets zu regulieren scheinen. Durch weiterführende Interaktionsstudien konnten direkte Bindungspartner von STAiR18 detektiert und die zentrale Rolle von STAiR18 bei der Regulation der Zellmigration untersucht werden. Die erhobenen Daten sollen damit Einblicke in die komplexen Regulationsnetzwerke des Glioblastoms gewähren und Zusammenhänge zwischen langen nichtkodierenden RNAs und Tumorerkrankungen aufschlüsseln.

Einleitung: Glioblastoma multiforme (GBM) gehören zu den häufigsten und bösartigsten Hirntumoren. Eine vollständige Heilung ist derzeit noch nicht möglich. Ziele: Es wurde ein orthotopes GBM-Xenotransplantat-Modell in der Maus etabliert, optimale Durchführungsprotokolle wurden erstellt und die Wachstumskinetik der Tumoren charakterisiert. Außerdem erfolgte eine lokale therapeutische Intervention mit Komplexen aus Polymeren und siRNAs (small interfering RNAs) bzw. AntimiRs (Anti-micro-RNAs) und der Verlauf wurde mittels Biolumineszenz-imaging (BLI) überwacht. Die tumortragenden Hirne wurden immunhistochemisch untersucht. Neben der Therapie wurden erstmals Tissue Slice Cokulturen aus Maushirnen mit orthotopen Xenotransplantaten hergestellt und durch immunhistochemische Untersuchungen bezüglich des Tumorwachstums und der Invasivität in das umliegende Normalgewebe charakterisiert. Des Weiteren wurde ein subkutanes (s.c.) Xenotransplantat-Modell etabliert, dessen Tumorwachstum mittels BLI überwacht wurde, welches eine therapeutische Applikation von PEI-komplexierten siRNAs enthielt und deren Tumoren mittels Messung der Proteinkonzentration und der Lumineszenz charakterisiert wurden. Mit dieser Arbeit wurden durch die Verwendung von siRNAs bzw. AntimiRs im Rahmen der RNA-Interferenz Strategien entwickelt, mit denen eine Grundlage für die spezifisch auf ein bestimmtes Gen gerichtete GBM-Therapie geschaffen werden konnte. Tiere, Material, Methoden: In insgesamt 190 immundefizienten Mäusen wurden s.c. und orthotope Xenotransplantate aus der Reporterzelllinie G55T2-Luc-GFP hergestellt. Eine Behandlungsgruppe mit s.c. Xenotransplantaten bestand aus 7-8 Tieren. Die Behandlungsgruppe erhielt intraperitoneale (i.p.) Injektionen des PEI-siRNA-Komplexes LP10Y-siLuc3 (LP10Y: AG Aigner, Universität Leipzig, Deutschland, siLuc3: Eurogentec, Belgien), während die Negativkontrollgruppe (NC) i.p. Injektionen mit dem Komplex LP10Y-siLuc2 erhielt. Diese Behandlung erfolgte 3 x wöchentlich über 6-12 d. Das Wachstum der Tumore wurde mit BLI in vivo verfolgt und die Lumineszenz im zeitlichen Verlauf gemessen. Die Tumore wurden lysiert und deren Lumineszenz bezogen auf die Proteinkonzentration gemessen. Für das orthotope Xenotransplantat wurde eine Schraube mit Führungskanal (Screw guide, Plastics One, USA) 1 mm rostral und 2 mm lateral des Bregmas stereotaktisch implantiert. Mit einer Mikroinfusionspumpe und einer Mikrodosierspritze wurden die Zellen über den Führungskanal mit 12 µl/ h in das rechte Striatum injiziert. 5-7 d nach der Inokulation der Zellen erfolgte das Einbringen von 3 µl der PEI-AntimiR bzw. siRNA-Komplexe PEI/antimiR-155-Komplex (PEI: AG Aigner, Universität Leipzig, Deutschland, AntimiR 155-ZEN: Integrated DNA Technologies, USA) bzw. LP10Y-siPLK1 (PLK1: Eurogentec, Belgien). Die Tiere der NC wurden mit den Komplexen PEI/antimiR-NC5-Komplex bzw. LP10Y-siLuc3 behandelt. Zum Vergleich wurde eine Gruppe gar nicht behandelt. Die Behandlung erfolgte 3 x wöchentlich über 12 d. Eine Behandlungsgruppe bestand aus 10 randomisiert verteilten Tieren. Das Wachstum wurde in vivo mit BLI verfolgt. Die Hirne wurden entnommen und mit einem Vibratom Gewebeschnitte erstellt, die mit Kresylviolett gefärbt und an denen mit einer Bildbearbeitungssoftware die Tumorflächen ausgemessen wurden. Außerdem wurden mit einem Mikrotom Paraffinschnitte hergestellt und diese immunhistochemisch beurteilt. Es wurden Tissue Slice Cokulturen aus unbehandelten Tumoren und gesundem Gewebe des Striatums bzw. Cortex erstellt und aus diesen ebenfalls Paraffinschnitte hergestellt, welche immunhistochemisch beurteilt wurden. Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass ein Tumorwachstum s.c. injizierter GBM-Zellen in vivo mit BLI verfolgt werden kann und dass die siRNA siLuc3 mit LP10Y erfolgreich in G55T2-Luc-GFP eingeschleust wurde. Bei der Untersuchung der Luciferaseaktivität bezogen auf die Proteinkonzentration der lysierten s.c. Tumoren konnte eine Reduktion der Lumineszenz in der Behandlungsgruppe nachgewiesen werden. Das orthotope Xenotransplantat-Modell wies eine Tumoranwuchsrate von bis zu 96 % und eine Mortalitätsrate von bis zu 0 % auf. Das Tumorwachstum konnte nicht in vivo mit BLI verfolgt werden, da die umliegenden Gewebe die Lumineszenz vollständig abschirmten. Bei den Behandlungen mit LP10Y-siPLK1 und dem PEI/antimiR-155-Komplex konnte histologisch eine Reduktion der Tumorgröße und immunhistochemisch Apoptose und eine Tendenz zur Reduktion der Proliferation und Migration nachgewiesen werden. In der Behandlungsgruppe mit LP10Y-siPLK1 konnte außerdem eine verminderte Expression von PLK1 im Tumorgewebe und eine gesteigerte Überlebensrate nachgewiesen werden. Mit den Tissue Slice Cokulturen konnte festgestellt werden, dass die Xenotransplantate in den verschiedenen Hirnabschnitten unterschiedliches Migrationsverhalten zeigen. Die auf dem Cortex wachsenden Tumore waren kleiner als die auf dem Striatum wachsenden Tumore, wiesen jedoch mehr Migration in das umliegende Hirngewebe und mehr raumforderndes Wachstum im Verhältnis zum nicht raumfordernden Wachstum auf. Das Verhältnis der migrierenden Zellen zur Länge des Tumors des Xenotransplantats im Cortex wies höhere Werte auf als das im Striatum. Schlussfolgerungen: LP10Y eignet sich zur Einschleusung von siRNA und könnte ein vielversprechendes Nano-Therapeutikum darstellen. Das BLI von Luciferase exprimierenden, s.c. Tumoren ist ein gutes Verfahren zur Verfolgung der Wachstumskinetik. Es scheint sich jedoch nicht zur Untersuchung der Transfektionseffizienz von PEI-Komplexen zu eignen, da die Erscheinungsform von Glioblastomen mit Einblutungen, Nekrosen und Zysten sehr verschieden sein kann. Es ist also möglich dass die Tumoren unterschiedlich viele lebende Zellen pro Volumen mit entsprechender Luciferaseaktivität aufweisen. Alternativ dazu ist das Untersuchungsmodell der Lumineszenz bezogen auf die Proteinkonzentration lysierter Tumoren ein geeignetes Verfahren für die Quantifizierung der Luciferaseaktivität und der Transfektionseffizienz von PEI-Komplexen in GBM. Das im Zuge dieser Arbeit etablierte orthotope Xenotransplantat-Modell ist ein valides Modell mit verschiedenen Eigenschaften humaner GBM. Die Ergebnisse aus den Behandlungen der orthotopen GBM mit den PEI-siRNA bzw. AntimiRKomplexen sprechen für eine gute biologische Aktivität, niedrige Zytotoxizität, eine gute Knockdowneffizienz und somit auch therapeutische Effizienz der Komplexe in vivo. Das orthotope Xenotransplantat-Modell und die Tissue Slice Cokulturen stellen geeignete, gut reproduzierbare und genetisch unmanipulierte Modelle dar, welche die Untersuchung von Wachstums- und Migrationsverhalten mit und ohne therapeutische Intervention, sowie des Behandlungserfolges erlauben. Beide Polymere könnten vielversprechende Nano-Therapeutika darstellen. Ein neues exvivo-Modell, in dem die GBM in ihrer natürlichen Umgebung gewachsen sind und sich in der Cokultur weiterhin sehr ähnlich der Originalsituation verhalten können, wurde etabliert. Für die Statistiken wurde, zum Vergleich von Gruppen, der One-Way ANOVA-Test von SigmaPlot 13 verwendet.

Glioblastome sind die aggressivsten und häufigsten Hirntumore beim Menschen und entziehen sich weiterhin einem kurativen Therapieansatz. Wie die meisten malignen Tumore zeigen Glioblastome den sogenannten Warburg Effekt, eine gesteigerte aerobe Glykolyse. Ein Schlüsselenzym der Glykolyse ist die 6-Phosphofrukto-1-kinase (PFK-1), deren stärkster allosterischer Aktivator Fruktose-2,6-bisphosphat (F2,6BP) ist. Die zelluläre Konzentration von F2,6BP wird von dem bifunktionalen Enzym 6-Phosphofrukto-2-kinase/Fruktose-2,6-bisphosphatase (PFK-2) reguliert. Im Menschen existieren vier PFK-2-Isoenzyme (PFKFB1-4), die gewebespezifisch exprimiert werden. Die PFKFB3 hat das höchste Kinase/Bisphosphatase- Aktivitätsverhältnis von 710:1 innerhalb der PFK-2-Familie und wird in Tumorzelllinien und verschiedenen malignen Tumoren überexprimiert. In humanem Hirngewebe wurden sechs alternative Spleißvarianten der PFKFB3-mRNA (UBI2K1–6) beschrieben, welche sich in der C-terminalen Region unterscheiden. Neuere Untersuchungen im Verlauf dieser Arbeit ergaben, dass es auch Spleißvarianten gibt, die in der N-terminalen Region variieren, sodass insgesamt 10 Spleißvarianten der PFKFB3 bekannt sind. Die spezifischen Funktionen im Zellstoffwechsel wurden bisher nur für die Spleißvariante UBI2K5 untersucht, die der anderen Spleißvarianten sind weitestgehend unbekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Bedeutung der PFKFB3 Spleißvariante UBI2K4 in Glioblastomen für den Stoffwechsel und das Wachstum dieser Tumore am Modell der humanen U87-Glioblastomzelllinie aufzuklären und die These, dass die UBI2K4 eine proliferationshemmende Funktion hat, zu überprüfen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde mittels stabiler Transfektion von HEK-293-Zelllen mit einem pTER-Vektor und gleichzeitiger transienter Transfektion bei U87- und HEK-293-Zellen mit synthetischer siRNA ein Knockdown der UBI2K4 mRNA und des Proteins erzielt. Es stellte sich heraus, dass der UBI2K4 Knockdown in beiden Zelllinien zu einer reduzierten Viabilität und Zellproliferation führte. Die Verdopplungszeiten waren prolongiert und auch das dreidimensionale Wachstum in Soft-Agar-Kulturen war reduziert. Bei HEK-293-Zellen wurde der UBI2K4 Knockdown durch einen signifikanten Anstieg der UBI2K5 mRNA Expression kompensiert. Die UBI2K6 Expression blieb unverändert. Bei U87-Zellen, deren native UBI2K4 mRNA Expression sehr gering ist, wurde eine UBI2K5 mRNA Reduktion bei gleichzeitiger Hemmung der UBI2K4 Expression festgestellt, während die UBI2K6 mRNA leicht zunahm. Weiterhin konnte im Western Blot gezeigt werden, dass in HEK-293-Zellen neben der Spleißvariante UBI2K4, auch als Variante 4 bezeichnet, auch die neu entdeckte Variante 5 exprimiert wird. In U87-Zellen konnte nur die Expression der Variante 4 nachgewiesen werden. In einem Antikörper-Mikroarray wurde gezeigt, dass die UBI2K4 die Expression insbesondere von Proteinen mit immunmodulatorischen Eigenschaften, apoptose-induzierenden Proteinen und Proteinen der Zellkommunikation und des Metabolittransports beeinflusst. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das native Protein der UBI2K4 in HEK-293- und U87-Zellen überexprimiert. Die Zellen mit einer gesteigerten UBI2K4 Proteinkonzentration konnten schneller proliferieren und zeigten eine gesteigerte Zellviabilität. DIese Ergebnisse korrelieren mit den bereits beschriebenen Ergebnissen des UBI2K4 Knockdowns im ersten Teil dieser Arbeit. Die vermutete inverse Korrelation der UBI2K4 Konzentration und der Proliferationsrate konnte hier nicht bestätigt werden. Vielmehr scheint die UBI2K4 so wie die Spleißvariante UBI2K5 der PFKFB3 ebenfalls in höheren Konzentrationen proliferationsfördernd zu wirken. Dies scheint überaus wahrscheinlich, da die im Antikörper-Mikroarray beeinflussten Proteine auch darauf hindeuten.:1 EINFÜHRUNG UND AUFGABENSTELLUNG 8 1.1 GLIOBLASTOME 8 1.2 DIE GLYKOLYTISCHE AKTIVITÄT IN TUMORZELLEN – DER WARBURG-EFFEKT 12 1.2.1 REGULATION DER GLYKOLYSE IN TUMORZELLEN 16 1.2.2 DIE 6-PHOSPHOFRUKTO-2-KINASE/FRUKTOSE-2,6-BISPHOSPHATASE ISOENZYME 18 1.3 AUFGABENSTELLUNG 26 2 MATERIAL UND METHODEN 27 2.1 LABORAUSSTATTUNG 27 2.2 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 27 2.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN 29 2.4 STANDARDS 29 2.5 ENZYME 29 2.6 ANTIKÖRPER 29 2.7 REAGENZIENSYSTEME 30 2.8 BAKTERIENSTÄMME 30 2.9 ZELLLINIEN 31 2.10 PLASMIDE 31 2.11 OLIGONUKLEOTIDE 31 2.12 RIBONUKLEINSÄUREN 34 2.13 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 34 2.13.1 KULTIVIERUNG UND PASSAGIEREN VON ZELLEN 34 2.13.2 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 35 2.13.3 KONSERVIERUNG VON ZELLEN 35 2.13.4 TRANSFEKTION UND SELEKTION 35 2.13.5 PROLIFERATIONSTESTS 38 2.14 MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN 40 2.14.1 ARBEITEN MIT BAKTERIENKULTUREN 40 2.14.2 PRÄPARATION VON NUKLEINSÄUREN 42 2.14.3 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSÄUREN 43 2.14.4 AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE 43 2.14.5 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 44 2.14.6 REVERSE TRANSKRIPTION 45 2.14.7 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR 45 2.14.8 DNA-SEQUENZIERUNG 47 2.14.9 GEN-SILENCING DURCH SIRNA 48 2.14.10 ÜBEREXPRESSION DER SPLEIßVARIANTE UBI2K4 51 2.14.11 MYCOPLASMENTEST 52 2.15 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 53 2.15.1 ZELLLYSE UND BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 53 2.15.2 SDS-PAGE 53 2.15.3 WESTERNBLOT-ANALYSE 54 2.16 ANTIKÖRPER MIKROARRAY 55 2.17 STATISTISCHE ANALYSEN 55 2.18 SOFTWARE 56 3 ERGEBNISSE 57 3.1 AUSWAHL DER ZELLLINIE 57 3.2 KNOCKDOWN DER UBI2K4 DURCH STABILE UND TRANSIENTE TRANSFEKTION 59 3.2.1 KLONIERUNG DER PTER-EXPRESSIONSPLASMIDE FÜR DIE STABILE TRANSFEKTION 59 3.2.2 STABILE TRANSFEKTION MITTELS PTER-PLASMIDEN 62 3.3 NACHWEIS DES KNOCKDOWN DER UBI2K4 AUF DIE MRNA EXPRESSION 64 3.3.1 KNOCKDOWN DER UBI2K4 IN STABIL TRANSFIZIERTEN HEK-293-ZELLEN 64 3.3.2 KNOCKDOWN DER UBI2K4 IN STABIL TRANSFIZIERTEN HEK-293-ZELLEN MIT ZUSÄTZLICHER TRANSIENTER TRANSFEKTION MITTELS SIRNA 65 3.3.3 KNOCKDOWN DER UBI2K4 IN TRANSIENT TRANSFIZIERTEN U87-ZELLEN 67 3.4 EXPERIMENTE MIT ZELLEN BEI KNOCKDOWN DER UBI2K4 70 3.4.1 EINFLUSS DES KNOCKDOWN DER UBI2K4 AUF DAS WACHSTUM VON HEK-293-ZELLEN 70 3.4.2 EINFLUSS DES KNOCKDOWN DER UBI2K4 AUF DIE KOLONIEBILDUNG VON HEK-293-ZELLEN IN SOFT-AGAR-KULTUREN 71 3.5 KOLORIMETRISCHE TESTS BEI KNOCKDOWN DER UBI2K4 73 3.5.1 EINFLUSS DES UBI2K4 KNOCKDOWN AUF DIE VIABILITÄT UND DIE PROLIFERATION VON HEK-293-ZELLEN 73 3.5.2 EINFLUSS DES UBI2K4 KNOCKDOWN AUF DIE VIABILITÄT UND DIE PROLIFERATION VON U87-ZELLEN 74 3.6 ERGEBNISSE DES ANTIKÖRPER MIKROARRAY 75 3.7 ÜBEREXPRESSION DER UBI2K4 DURCH STABILE / TRANSIENTE TRANSFEKTION 78 3.7.1 KLONIERUNG DER PCDNA3.1-EXPRESSIONSPLASMIDE 78 3.8 NACHWEIS DER ÜBEREXPRESSION DER UBI2K4 AUF DIE MRNA EXPRESSION 79 3.9 KOLORIMETRISCHE TESTS BEI ÜBEREXPRESSION DER UBI2K4 81 3.9.1 EINFLUSS DER UBI2K4 ÜBEREXPRESSION AUF DIE VIABILITÄT UND DIE PROLIFERATION VON HEK-293-ZELLEN 81 3.9.2 EINFLUSS DER UBI2K4 ÜBEREXPRESSION AUF DIE VIABILITÄT UND DIE PROLIFERATION VON U87-ZELLEN 82 4 DISKUSSION 85 4.1 AUSWAHL DER ZELLLINIEN 85 4.2 GENERIERUNG STABILER ZELLLINIEN MIT UBI2K4-, UBI2K5- UND UBI2K6-KNOCKDOWN 87 4.2.1 KNOCKDOWN DER PFKFB3 SPLEIßVARIANTEN DURCH STABILE TRANSFEKTION IN HEK-293- UND U87-ZELLEN 89 4.3 KNOCKDOWN DER UBI2K4 IN HEK-293- UND U87-ZELLEN MITTELS TRANSIENTER TRANSFEKTION 90 4.4 ÜBEREXPRESSION DER UBI2K4 IN HEK-293 UND U87-ZELLEN 95 4.5 MIKROARRAY 97 4.5.1 PROTEINE MIT EINER SIGNIFIKANTEN KONZENTRATIONSERHÖHUNG 98 4.5.2 PROTEINE MIT EINER SIGNIFIKANTEN KONZENTRATIONSERNIEDRIGUNG 100 5 ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT 104 6 LITERATURVERZEICHNIS 107 7 ANLAGEN 129 7.1 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 129 7.2 TABELLENVERZEICHNIS 131 8 ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT 132 9 LEBENSLAUF 133 10 DANKSAGUNG 134

Dipeptidyl peptidase-IV (DPP-IV) is a multifunctional transmembrane glycoprotein removing X-Pro dipeptide from the amino-terminus of the peptide chain. This evolutionary conserved sequence protects a number of biologically active peptides against the unspecific proteolytic cleavage. DPP-IV belongs into the group of "Dipeptidyl peptidase-IV Activity and/or Structure Homologues" (DASH), which, except the canonical DPP-IV, comprises fibroblast activation protein-α/seprase (FAP), and several other molecules. However several of DASH molecules are the enzymes, they execute at least some of their biological functions by non-proteolytic protein-protein interactions. DASH molecules, their substrates and binding partners are parts of "DASH system" which is affected in several pathological process including a cancer. Specifically DPP-IV and its closest structural relative FAP are among others expected to be involved in the development and progression of malignant glioma. In this study we showed the expression and colocalization of DPP-IV and FAP in glioma cells in vitro and in human high grade gliomas. In addition to the DPP-IV/FAP double positive transformed glial cells, we also identified a subpopulation of FAP positive mesenchymal cells located in the perivascular compartment. Moreover we described the...

Ein LOH (loss of heterozygosity, Heterozygotieverlust) im Bereich des kurzen Arms des Chromosoms 10 tritt sehr häufig in hochgradigen Gliomen auf. Vornehmlich konzentriert sich der allele Verlust auf die Region 10p14-p15. Die chromosomale Instabilität dieser Region deutet auf die Existenz eines oder mehrerer Tumorsuppressorgene hin. Bis jetzt konnte der Krüppel-like Transkriptionsfaktor 6 (KLF6) als mögliche Zielstruktur eines LOH in 10p15 identifiziert werden. Das Gen des regulatorischen Glykolyseenzyms PFKFB3 ist im Bereich 10p15.1 lokalisiert. Die Spleißvariante 4 (UBI2K4) des PFKFB3-Gens hat eine hemmende Wirkung auf das dreidimensionale Wachstum von U87 Glioblastomzellen. Folglich könnte der PFKFB3 Genlocus Zielstruktur eines LOH in Glioblastomen sein. In dieser Arbeit wurden 40 Glioblastome mit der Mikrosatellitenanalyse basierend auf PCR-Technik untersucht. Bei 55 % (22/40) der Glioblastome zeigte sich ein LOH des PFKFB3 Gens. Der LOH des KLF6 Locus, 2,5 cM telomerisch zur PFKFB3 lokalisiert, wurde in 60 % (21/35) der Glioblastome festgestellt und korrelierte nicht mit dem PFKFB3-LOH. Die Deletion eines Allels des PFKFB3-Gens führt zu einer signifikanten Abnahme der PFKFB3 mRNA- und Proteinkonzentration. Die Expression der das Glioblastomzellwachstum hemmenden Spleißvariante UBI2K4 war in der Gruppe der LOH PFKFB (+) Glioblastome deutlich erniedrigt im Vergleich zur PFKFB3-LOH (-) Gruppe und korrelierte mit der totalen PFKFB3 Expression. Die Prognose der Glioblastom-Patienten verschlechtert sich durch den PFKFB3-LOH und die daraus resultierende niedrigere UBI2K4 Expression. Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass der für Glioblastome typische LOH der Region 10p14-p15 auf die PFKFB3 und speziell auf die Spleißvariante UBI2K4 als Tumorsuppressorprotein abzielt.