Ein LOH (loss of heterozygosity, Heterozygotieverlust) im Bereich des kurzen Arms des Chromosoms 10 tritt sehr häufig in hochgradigen Gliomen auf. Vornehmlich konzentriert sich der allele Verlust auf die Region 10p14-p15. Die chromosomale Instabilität dieser Region deutet auf die Existenz eines oder mehrerer Tumorsuppressorgene hin. Bis jetzt konnte der Krüppel-like Transkriptionsfaktor 6 (KLF6) als mögliche Zielstruktur eines LOH in 10p15 identifiziert werden. Das Gen des regulatorischen Glykolyseenzyms PFKFB3 ist im Bereich 10p15.1 lokalisiert. Die Spleißvariante 4 (UBI2K4) des PFKFB3-Gens hat eine hemmende Wirkung auf das dreidimensionale Wachstum von U87 Glioblastomzellen. Folglich könnte der PFKFB3 Genlocus Zielstruktur eines LOH in Glioblastomen sein. In dieser Arbeit wurden 40 Glioblastome mit der Mikrosatellitenanalyse basierend auf PCR-Technik untersucht. Bei 55 % (22/40) der Glioblastome zeigte sich ein LOH des PFKFB3 Gens. Der LOH des KLF6 Locus, 2,5 cM telomerisch zur PFKFB3 lokalisiert, wurde in 60 % (21/35) der Glioblastome festgestellt und korrelierte nicht mit dem PFKFB3-LOH. Die Deletion eines Allels des PFKFB3-Gens führt zu einer signifikanten Abnahme der PFKFB3 mRNA- und Proteinkonzentration. Die Expression der das Glioblastomzellwachstum hemmenden Spleißvariante UBI2K4 war in der Gruppe der LOH PFKFB (+) Glioblastome deutlich erniedrigt im Vergleich zur PFKFB3-LOH (-) Gruppe und korrelierte mit der totalen PFKFB3 Expression. Die Prognose der Glioblastom-Patienten verschlechtert sich durch den PFKFB3-LOH und die daraus resultierende niedrigere UBI2K4 Expression. Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass der für Glioblastome typische LOH der Region 10p14-p15 auf die PFKFB3 und speziell auf die Spleißvariante UBI2K4 als Tumorsuppressorprotein abzielt.

Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist der am häufigsten vorkommende maligne Hirntumor mit äußerst ungünstiger Prognose für die betroffenen Patienten. Typisch für die Tumore ist eine hohe Aktivität der Glykolyse zur Generierung von ATP und zur Bereitstellung von Makromolekülen für die Zellproliferation, während die oxidative Phosphorylierung auch in Gegenwart von Sauerstoff praktisch keine Bedeutung für die Generation von ATP hat, was auch als Warburg Effekt bekannt ist. Das natürlich vorkommende Carnosin (β-Alanyl-LHistidin) wirkt sich antiproliferativ auf Tumorzellen aus, was mit einer Inhibition der glykolytischen ATP Produktion einhergeht. Der Mechanismus der Inhibition ist weitgehend unverstanden und ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Im Rahmen der durchgeführten Arbeit wurde der Einfluss von Carnosin auf die mRNA Expressionen von für die Glykolyse relevanten Genen untersucht, wobei eine starke Induktion der Pyruvatdehydrogenase Kinase (PDK) 4 in drei GBM Zelllinien beobachtet wurde. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass L-Histidin den gleichen Effekt wie Carnosin zeigt, nicht jedoch β-Alanin, L-Alanin oder L-Alanyl-L-Histidin. Da Tumorzellen die intrazelluläre Gewebscarnosinase aber kaum die extrazelluläre Serumcarnosinase exprimieren, liegt die Vermutung nahe, dass die antineoplastische Wirkung des Carnosins auf die enzymatische Spaltung von Carnosin und die daraus resultierende Freisetzung von L-Histidin zurückzuführen ist. In weiteren Untersuchungen wurden Hinweise erbracht, dass Carnosin durch eine Beeinflussung von Histon-Deacetylasen, die endogene PDK4 mRNA Expression steigern könnte. Zusätzlich wurden die Proteinexpressionen der PDK1 und 4 unter dem Einfluss von Carnosin untersucht.

University, Diss., 2006--Frankfurt (Main). / Zsfassung in dt. und engl. Sprache.

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Glioblastomas are the most common and the deadliest types of brain tumours. Due to their highly invasive behaviour, they are incurable by convencial therapeutical strategies. It was shown that some components of microtubules, namely class III β-tubulin, γ-tubulin and microtubule severing protein spastin are overexpressed in glioblastoma cell lines as well as glioblastomas. This diploma thesis is focused on the expression, subcellular distribution and function of katanin, another microtubule-severing enzyme, in gliobastoma cell lines. Katanin is formed by catalytic (p60) and regulatory (p80) subunits. Expression and cellular localization of both katanin subunits was studied in panel of human glioblastoma cell lines isolated form adults (T98G, U87MG, U118MG and U138 MG) and child (KNS42). Data presented in this thesis demonstrated that katanin subunits were overexpresed both on transcript and protein levels in T98G, U87MG and KNS42 cell lines, but not in U138MG and U118MG cell lines when compared to normal non- transformed human astrocytes. Immunofluorescence microscopy revealed that both katanin subunits were diffusively distributed in cytoplasm and concentrated on spindle poles of mitotic cells and on leading edges of migrating cells. Examination of cell motility revealed that velocities in...

TTFields sind eine zugelassene Therapie für die Behandlung von Glioblastom IDH-Wildtyp. Es handelt sich dabei um elektrische Wechselfelder niedriger Intensität und mittlerer Frequenz, die therapeutisch aus zwei Richtungen durch ein tragbares, nicht-invasives Gerät appliziert werden. Sie verhindern die Spindelfaserbildung während der Mitose. Die Wirkung vieler effektiver Chemotherapeutika ist im ZNS durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS) eingeschränkt. Die BHS wird nach TTFields Applikation bei 100 kHz in einem murinen cerebEND-Zell-Modell vorübergehend geöffnet. Dieser Effekt wurde in dieser Arbeit zunächst mit Hilfe von Immunfluoreszenzmikroskopie und dann durch einen fraktionierten Western-Blot bestätigt, dass der mutmaßliche Wirkungsmechanismus von TTFields in der Delokalisierung des tight junction Proteins Claudin-5 von der Membran in das Zytoplasma liegt. TEER-Messungen zeigten, dass sich die Integrität der BHS durch 100 kHz TTFields nach 72 h verringerte und 48 h - 72 h nach Ende der Behandlung wieder normalisierte, auch wenn statt eines Behandlungsendes auf 200 kHz TTFields umgeschaltet wurde. Der zweite Teil der Untersuchung bestand darin, ein BHS-Modell aus humanen HBMVEC Zellen zu etablieren, um die Auswirkungen von TTFields im humanen System verifizieren zu können. Zunächst konnten keine Effekte von TTFields unterschiedlicher Frequenz auf eine HBMVEC-Monokultur festgestellt werden. In einer Kokultur mit Perizyten gab es eine erhöhte Expression von Claudin-5, Occludin und PECAM-1. Allerdings zeigten die TEER-Messungen und ein Permeabilitätsassay keine Unterschiede zwischen den Mono- und Kokultur-Modellen der BHS auf. Durch eine transiente Öffnung der BHS könnte eine höhere Dosis von Therapeutika, die normalerweise die BHS nicht überwinden können, im ZNS erreicht werden. Damit könnten TTFields eine innovative Methode zur Behandlung von Hirntumoren und anderen Erkrankungen des ZNS darstellen. Die hier präsentierten Daten geben erste Hinweise in diese Richtung, müssen aber noch optimiert und verifiziert werden. / TTFields are an approved therapy for the treatment of glioblastoma IDH-wildtype. They are low intensity, medium frequency alternating electric fields which are applied therapeutically from two directions by a portable, non-invasive device. TTFields prevent spindle fiber formation during mitosis by aligning the strongly polar tubulin subunits in the electrical fields. The achievement of effective chemotherapy of glioblastoma IDH-wildtype and other central nervous system (CNS) disorders is limited by the blood-brain barrier (BBB). Application of TTFields at 100 kHz at the mouse cell line cerebEND temporarily opens the BBB. This TTFields effect was observed in fluorescence microscopy. Fractionated Western-Blots revealed delocalisation of the TJ-Protein Claudin-5 from the membrane to the cytoplasm due to the application of TTFields. The integrity of the BBB has been shown in TEER measurements to be interrupted by 72 h TTFields application at 100 kHz. This effect was reversible and repeatable. In addition, if TTFields at 200 kHz were applied after BBB-opening at 100 kHz the cells recovered. The second part of this project was to establish a human cell culture BBB model (HBMVEC) to investigate TTFields effects on human cells. There were no effects of TTFields at different frequencies on HBMVEC cells detectable. HBMVEC cells had lower expression of Claudin-5, Occludin and PECAM-1 compared to their co-culture with pericytes. However, TEER measurements and permeability assays revealed no differences between such mono- and co-cultures. By overcoming the BBB a higher dose of the drugs could be achieved in a more controlled manner in the CNS. As a result, TTFields could be an innovative method for the treatment of brain tumours and other diseases of the CNS. The presented experiments provide a first rationale in this direction but require optimisation and verification.

Den aktuellen Forschungsgegenstand dieser Arbeit bildet der in Glioblastomen häufig überaktivierte PI3K/AKT/mTOR-Signalweg. Eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung des Signalwegs spielt das Tumorsuppressorprotein PTEN. Ein mutiertes PTEN sorgt für die zuvor genannte Überaktivierung des PI3K/AKT/mTOR-Signalwegs und korreliert mit einer Radioresistenz. In der vorliegenden Arbeit wurde die strahlensensibilisierende Wirkung des neuartigen dualen PI3K/mTOR-Inhibitors NVP-BEZ235 an zwei humanen Glioblastomzelllinien mit unterschiedlichem PTEN-Status (GaMG: PTEN wt und U373-MG: PTEN mut) analysiert. Vergleichend dazu erfolgten Untersuchungen mit dem mTOR-Inhibitor Rapamycin und dem PI3K-Inhibitor LY294002. Untersucht wurden die Auswirkungen auf die Zellproliferation, die Strahlensensibilität, das Proteinexpressionsmuster, die Zellzyklusverteilung, die Induktion und Reparaturfähigkeit des DNS-Schadens sowie die Einleitung des programmierten Zelltods. U373-MG stellte sich im Vergleich zu GaMG als die strahlensensiblere Zelllinie heraus. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die mTOR-Inhibition durch NVP-BEZ235, unabhängig vom PTEN-Status, für die Einflussnahme auf Proliferation und Proteintranslation vordergründig ist. Es kam zu keinen radiosensibilisierenden Effekten durch Zugabe von NVP-BEZ235, Rapamycin und LY294002 24 Stunden vor Bestrahlung, was auf das Ausbleiben eines erhöhten DNA-Schadens und einer verzögerten DNA-Reparatur, einen G1-Arrest und der Aktivierung des PI3K-Signalwegs zum Zeitpunkt der Bestrahlung sowie der Unterdrückung der Apoptose zurückzuführen ist. Trotz Ausbleiben radiosensibilisierender Effekt, konnte durch die Testsubstanzen eine starke zytostatische Wirkung gezeigt werden. / The current research topic of this work is the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway, which is often overactivated in glioblastomas. The tumor suppressor protein PTEN plays a decisive role in the activation of the signaling pathway. A mutated PTEN provides the overactivation of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway and correlates with radiation resistance. In the present paper, the radiosensitizing effect of the novel dual PI3K/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 on two human glioblastoma cell lines with different PTEN status (GaMG: PTEN wt and U373-MG: PTEN mut) was analyzed. Comparative studies were carried out with the mTOR inhibitor rapamycin and the PI3K inhibitor LY294002. The effects on cell proliferation, radiation sensitivity, protein expression pattern, cell cycle distribution, induction, and repairability of DNA damage as well as the initiation of programmed cell death were investigated. U373-MG turned out to be more radiosensitive compared to GaMG. Furthermore, it has been shown that mTOR-Inhibition by NVP-BEZ235 is essential for the influence on proliferation and protein translation, regardless of the PTEN status. The addition of NVP-BEZ235, rapamycin and LY294002 24 hours prior to irradiation did not lead to any radiosensitizing effect. This is due to the absence of increased DNA damage and delayed DNA repair, a G1 arrest and the activation of the PI3K signaling pathway at the time of irradiation and the suppression of apoptosis. Despite the lack of radiosensitizing effects, the test substances showed strong cytostatic effects.

Gene therapy has received much attention the last decade as a method to correct a number of disorders arising from a defective gene. Gene therapy can be defined as the introduction of a functional genetic element into a cell for a therapeutic purpose. This is a very broad term and gene therapy can be applied to a wide range of diseases from genetic diseases such as cystic fibrosis to infectious diseases or even acquired genetic diseases such as cancers. Adenoviruses (Ad) are the second most common vector for gene therapy in clinical trials today, and these vectors are mostly based on serotype 2 or 5 (Ad2 and Ad5). It has been shown that Ad2 and Ad5 use a receptor that is often downregulated in malignant cells and they also suffer from shortcomings because of the high levels of pre-existing immunity against these serotypes in the society. Hence, new and improved vectors serving as alternatives to these serotypes need to be developed to make gene therapy a successful treatment option. The work presented herein is devoted to analyse what alternative adenovirus vectors could be used for treatment of glioma brain tumours. A number of different adenovirus serotypes were screened for their ability to infect human glioma tumour cells in vitro. Established cell lines as well as low-passage glioma cells from different donors were used. Adenovirus serotype 11p (Ad11p) proved to be a promising vector candidate because of its capacity to efficiently infect the glioma cells and its low prevalence in the society. The complete genome of this serotype was sequenced to further develop this as an alternative adenovirus vector. Furthermore, a number of cell lines were produced to generate E1 deleted Ad11p vectors. Other promising vector candidates were Ad16 and a chimpanzee adenovirus called CV23. Ad16 was the most efficient human serotype to infect human low-passage glioma cells and the prevalence for this serotype is also very low. The overall most efficient virus was surprisingly the non-human CV23 virus. This adenovirus has no prevalence in humans, but efficiently infects human cells in vitro. The first analysis was made on established glioma cell lines and was followed up by using low passage glioma cells from a number of different patients. The glioma cells were analysed when subjected to <20 passages (low passage) and then again at >40 passages (high passage). The cells at a higher passage number were significantly more permissive to Ad5 than the cells analysed at a low passage number. This could in part explain why some of the promising in vitro data for Ad5 have shown a limited success in vivo. In contrast, CV23 infected the low and high passage gliomas equally. This indicates that CV23 uses an internalisation mechanism subjected to less variation than the mechanism used by Ad5. We further characterised the receptor interaction of CV23 and found that none of the previously known primary receptors for adenoviruses were of importance for binding. We found that bovine serum albumin present in the growth medium was responsible for the high binding capacity to cells. Binding is a criterion for the first step of the infection, but not necessarily a good correlate to the infection capacity. CV23 infected human cells efficiently also in the absence of bovine serum albumin.

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Dipeptidyl peptidase-IV (DPP-IV) is a multifunctional transmembrane glycoprotein removing X-Pro dipeptide from the amino-terminus of the peptide chain. This evolutionary conserved sequence protects a number of biologically active peptides against the unspecific proteolytic cleavage. DPP-IV belongs into the group of "Dipeptidyl peptidase-IV Activity and/or Structure Homologues" (DASH), which, except the canonical DPP-IV, comprises fibroblast activation protein-α/seprase (FAP), and several other molecules. However several of DASH molecules are the enzymes, they execute at least some of their biological functions by non-proteolytic protein-protein interactions. DASH molecules, their substrates and binding partners are parts of "DASH system" which is affected in several pathological process including a cancer. Specifically DPP-IV and its closest structural relative FAP are among others expected to be involved in the development and progression of malignant glioma. In this study we showed the expression and colocalization of DPP-IV and FAP in glioma cells in vitro and in human high grade gliomas. In addition to the DPP-IV/FAP double positive transformed glial cells, we also identified a subpopulation of FAP positive mesenchymal cells located in the perivascular compartment. Moreover we described the...