Trotz erheblicher Fortschritte auf dem Gebiet der Strahlentherapie ist es bis heute noch nicht möglich, die Strahlenempfindlichkeit eines Individuums bereits vor Therapiebeginn vorherzusagen. Diese Tatsache führt dazu, dass es einerseits bei einem Teil der Patienten zu starken Nebenwirkungen infolge einer Bestrahlung kommt und andererseits die Therapie oftmals nicht in ausreichendem Maße anspricht. Die Entwicklung eines verlässlichen prädiktiven Tests stellt daher ein wichtiges Ziel der strahlentherapeutischen Forschung dar und stand auch im Zentrum dieser Arbeit. Methodisch kam dabei der Koloniebildungstest sowie die fluoreszenzmikroskopische Detektion und Bildanalyse des Histons gamma-H2AX, einem relativ neuen Marker für DNA-Doppelstrangbrüche, zum Einsatz. Untersucht wurde eine sehr heterogene Gruppe aus 5 Fibroblasten- sowie 5 Tumorzelllinien. Unter den Fibroblastenzelllinien befanden sich 2 normale Hautfibroblasten, 2 Hautfibroblasten von Brustkrebspatientinnen mit überdurchschnittlich starken Hautreaktionen nach der Bestrahlung sowie eine Zelllinie mit bekannter AT-Mutation. An Tumorzelllinien kam ein Adenokarzinom der Brust, ein Malignes Melanom, ein Fibrosarkom und zwei isogene aber unterschiedlich strahlensensible Glioblastomzelllinien, die sich in Hinblick auf ihre Proteinkinasenaktivitäten unterscheiden, zum Einsatz. Durch den Koloniebildungstest konnte eine große Bandbreite der klonogenen Überlebensraten erkannt werden, wobei Zelllinien mit Proteinkinasedefekten die größte Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung aufwiesen. Der Verlauf des Histons gamma-H2AX in Hinblick auf die Induktion, die Abbaukinetiken, die verbliebenen Reste nach 18 Stunden Reparaturdauer sowie die dosisabhängigen Kurvensteigungen zeigten jeweils einen charakteristischen Verlauf für jede untersuchte Zelllinie. Interessanterweise war die Hintergrundfluoreszenz bei Tumorzelllinien signifikant höher als diejenige bei Fibroblastenzelllinien. Die strahlensensible Glioblastomzelllinie mit Proteinkinasedefekten zeigte eine deutlich protrahierte Phosphorylierung des Histons H2AX. Zwischen den Überlebensraten der Koloniebildungstests und den Ergebnissen der gamma-H2AX-Detektion wurden keine Korrelationen gefunden. Wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, stellt der Verlauf des Histons gamma-H2AX einen stark zelllinienabhängigen Parameter dar. Das Histon gamma-H2AX besitzt dadurch ein hohes Potential um individuelle Mechanismen einer Zelllinie nach Einwirkung äußerer Noxen, wie beispielsweise ionisierende Strahlung, zu untersuchen. Es bietet interessante Ansatzpunkte zur Beurteilung neuer Therapieregimes als auch zur Entwicklung und Bewertung strahlenmodulierender Chemotherapeutika. / Despite of the efforts of modern radiotherapy, about 5-10% of tumor patients develop severe side effects of normal tissue after radiotherapy treatment. Therefore, there is a growing interest to establish a reliable method to predict a normal tissue’s radiosensitivity. On the other hand, some tumors did not respond adequately to the standard irradiation protocols. The development of a predictive test for radiotherapy is therefore one of the important goals of radiation research. The present study used two different methods to evaluate cellular reactions after irradiation – the colony forming test and digital image analysis of histone gamma-H2AX, a marker of DNA double strand breaks. Ten different cell lines derived from normal and malignant tissues were examined. Among them were 2 normal skin fibroblast lines, 2 fibroblast cell lines derived from the skin biopsies of tumor patients with adverse early skin-reactions to radiotherapy, and one fibroblast cell line with a known mutation of the AT gene. The five examined tumor cell lines included a fibrosarcoma (HT 1080), a breast carcinoma (MCF7), a melanoma (Colo-800) and two isogenic glioblastoma (MO59J and MO59K) cell lines. The results of the colony forming test for the 10 cell lines studied showed a wide range of the SF2-values (surviving fraction at 2 Gray). Cell lines with defects in the protein kinases, MO59J and AT, showed the lowest surviving fractions, 0.06 and 0.17, respectively. Interestingly, the background level of gamma-H2AX was significantly higher in malignant cell lines compared with non-malignant ones. We found that the glioblastoma cell line MO59J which is deficient in the protein kinases DNA-PK and ATM showed a delayed phosphorylation of H2AX. Comparison between the parameters of the colony-forming test and of histone gamma-H2AX revealed no correlation between the SF2-values and the induction and disappearance of histone gamma-H2AX for the cell sample tested. However, the induction, the kinetics of disappearance, residual and background parameters of histone gamma-H2AX showed a strong cell line specific behaviour. Our results suggest that histone gamma-H2AX seems to be a very useful cell-type-specific marker for DNA double-strand breaks which could be used as a patient specific molecular marker to assess the effect of radiosensitizers or different radiotherapy schedules in order to optimize the tumor treatment.

Hintergrund: Die Überexpression von Hypoxia Inducible Factor 1 (HIF-1) wird mit Tumorprogression und schlechter Prognose in Zusammenhang gebracht. Wir untersuchten, ob die pharmakologische Hemmung des Transkriptionsfaktors HIF-1 mittels Chetomin, einem Inhibitor der Interaktion von HIF-1 mit dem Koaktivator Protein p300, die Hypoxie-induzierte Strahlenresistenz menschlicher Fibrosarkomzellen vom Typ HT 1080 beeinflusst. Methoden: Die optimale Dosis von Chetomin wurde durch Versuchsreihen mit Hypoxie-sensiblem Promotor in mit destabilisiertem EGFP-Vektor transfizierten HT 1080 HRE-Zellen bestimmt. HT 1080 Zellen wurden mittels RT-PCR sowie Western Blot auf die Transkription der HIF-1-regulierten Gene Carboanhydrase IX (CA9) und Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) untersucht. Außerdem wurden sie zur Erstellung klonogener Assays unter normoxischen sowie hypoxischen (0,1% O2, 12 Stunden) Bedingungen in vitro mit 0, 2, 5 oder 10 Gy bestrahlt mit oder ohne Chetominbehandlung (150 nM, 12 Stunden, Vorbehandlung 4 Stunden). Ergebnisse: In der RT-PCR zeigte sich eine signifikante Reduktion (Signifikanzniveau p<0,05) der mRNS-Expression von CA9 und VEGF unter Chetomin und Hypoxie auf 44,4 +/- 7,2% beziehungsweise 39,6 +/- 16,0%, im Western Blot supprimierte Chetomin auch die Downstream-Genprodukte von CA9 und VEGF. In den Überlebenskurven erhöhte Chetomin die Wirksamkeit der Bestrahlung wesentlich, der modifizierte Sauerstoffeffekt (modified Oxygen Enhancement Ratio, OER') war mit Ausnahme der 50% SF in Bezug auf die Kontrollen bei 50%, 37% und 10% Relativem Überleben (SF) von 1,57 auf 1,58, von 1,56 auf 1,42 und von 1,38 auf 1,22 reduziert. Schlussfolgerung: Die HIF-1-Hemmung durch Chetomin reduziert effektiv die Hypoxie-abhängige Transkription und verstärkt die Strahlensensibilität von hypoxischen HT 1080 Fibrosarkomzellen in vitro. / Background: Hypoxia inducible factor 1 (HIF-1) overexpression has been linked to tumor progression and poor prognosis. We investigated whether targeting of HIF-1 using chetomin, a disrupter of the interaction of HIF-1 with the transcriptional coactivator p300, influences the radiosensitivity of hypoxic HT 1080 human fibrosarcoma cells. Methods: Optimal dose of chetomin was determined by EGFP-HRE gene reporter assay in stably transfected HT 1080 cells. Cells were assayed for expression of the hypoxia-inducible genes carbonic anhydrase IX (CA9) and vascular endothelial growth factor (VEGF) by RT-PCR and Western blot. For clonogenic survival they were irradiated with 0, 2, 5 or 10 Gy, under normoxic or hypoxic (0.1% O2, 12h) conditions in the presence or absence of chetomin (150 nM, 12h, pre-treatment of 4h). Results: Chetomin treatment significantly reduced CA9 and VEGF mRNA expression in hypoxic cells to 44.4 +/- 7.2% and 39.6 +/- 16.0% respectively, of untreated hypoxic controls. Chetomin suppressed as well downstream gene products of CA9 and VEGF (Western blot). Chetomin clearly radiosensitized hypoxic cells and reduced the modified oxygen enhancement ratio (OER') compared to untreated cells except at 50% survival fraction, from 1.57 to 1.58, from 1.56 to 1.42 and from 1.38 to 1.22 at the 50%, 37% and 10% clonogenic survival levels, respectively. Conclusions: HIF-1 inhibition by chetomin effectively reduces hypoxia-dependent transcription and radiosensitizes HT 1080 human fibrosarcoma cells in vitro.

Den aktuellen Forschungsgegenstand dieser Arbeit bildet der in Glioblastomen häufig überaktivierte PI3K/AKT/mTOR-Signalweg. Eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung des Signalwegs spielt das Tumorsuppressorprotein PTEN. Ein mutiertes PTEN sorgt für die zuvor genannte Überaktivierung des PI3K/AKT/mTOR-Signalwegs und korreliert mit einer Radioresistenz. In der vorliegenden Arbeit wurde die strahlensensibilisierende Wirkung des neuartigen dualen PI3K/mTOR-Inhibitors NVP-BEZ235 an zwei humanen Glioblastomzelllinien mit unterschiedlichem PTEN-Status (GaMG: PTEN wt und U373-MG: PTEN mut) analysiert. Vergleichend dazu erfolgten Untersuchungen mit dem mTOR-Inhibitor Rapamycin und dem PI3K-Inhibitor LY294002. Untersucht wurden die Auswirkungen auf die Zellproliferation, die Strahlensensibilität, das Proteinexpressionsmuster, die Zellzyklusverteilung, die Induktion und Reparaturfähigkeit des DNS-Schadens sowie die Einleitung des programmierten Zelltods. U373-MG stellte sich im Vergleich zu GaMG als die strahlensensiblere Zelllinie heraus. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die mTOR-Inhibition durch NVP-BEZ235, unabhängig vom PTEN-Status, für die Einflussnahme auf Proliferation und Proteintranslation vordergründig ist. Es kam zu keinen radiosensibilisierenden Effekten durch Zugabe von NVP-BEZ235, Rapamycin und LY294002 24 Stunden vor Bestrahlung, was auf das Ausbleiben eines erhöhten DNA-Schadens und einer verzögerten DNA-Reparatur, einen G1-Arrest und der Aktivierung des PI3K-Signalwegs zum Zeitpunkt der Bestrahlung sowie der Unterdrückung der Apoptose zurückzuführen ist. Trotz Ausbleiben radiosensibilisierender Effekt, konnte durch die Testsubstanzen eine starke zytostatische Wirkung gezeigt werden. / The current research topic of this work is the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway, which is often overactivated in glioblastomas. The tumor suppressor protein PTEN plays a decisive role in the activation of the signaling pathway. A mutated PTEN provides the overactivation of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway and correlates with radiation resistance. In the present paper, the radiosensitizing effect of the novel dual PI3K/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 on two human glioblastoma cell lines with different PTEN status (GaMG: PTEN wt and U373-MG: PTEN mut) was analyzed. Comparative studies were carried out with the mTOR inhibitor rapamycin and the PI3K inhibitor LY294002. The effects on cell proliferation, radiation sensitivity, protein expression pattern, cell cycle distribution, induction, and repairability of DNA damage as well as the initiation of programmed cell death were investigated. U373-MG turned out to be more radiosensitive compared to GaMG. Furthermore, it has been shown that mTOR-Inhibition by NVP-BEZ235 is essential for the influence on proliferation and protein translation, regardless of the PTEN status. The addition of NVP-BEZ235, rapamycin and LY294002 24 hours prior to irradiation did not lead to any radiosensitizing effect. This is due to the absence of increased DNA damage and delayed DNA repair, a G1 arrest and the activation of the PI3K signaling pathway at the time of irradiation and the suppression of apoptosis. Despite the lack of radiosensitizing effects, the test substances showed strong cytostatic effects.

Brustkrebs ist die häufigste maligne Erkrankung der Frau. Die Therapie setzt sich in der Regel individuell aus den Bausteinen der chirurgischen Tumorexzision, der Bestrahlung und der systemischen Therapie zusammen. Daneben gewinnt die ketogene Diät als supportiver Therapieansatz immer mehr an Aufmerksamkeit und Forschungsinteresse. Diese Ernährungsform imitiert durch starke Restriktion der Kohlenhydratzufuhr den Fastenstoffwechsel, da Blutzucker- und konsekutiv auch Insulinspitzen im Blut vermieden werden. Eine tragende Rolle kommt dabei der Bildung von Ketonkörpern, allen voran Betahydroxybutyrat, zu, die sowohl in den Tumorstoffwechsel als auch in immunologische Prozesse eingreifen können. In dieser Arbeit wurde ausgewählten Brustkrebszellen 3 mM Betahydroxybutyrat zugesetzt und ihr Wachstumsverhalten, ihre Chemo- und Radiosensitivität im Vergleich zu Kontrollzellen erfasst. Die Kontrollzellen wurden identisch behandelt, jedoch wurde Ihnen kein Betahydroxybutyrat zugefügt. Es zeigte sich dabei kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den beiden Zellgruppen. / Breast cancer is the most common malignant disease in women. The therapy usually includes surgical tumor excision, radiation and systemic therapy. In addition, the ketogenic diet is gaining more and more attention as a supportive therapeutic approach. This form of nutrition mimics the fasting metabolism by strongly restricting the carbohydrate intake, since peaks in blood glucose levels and consequently in insulin levels are avoided. The formation of ketone bodies, especially Beta-hydroxybutyrate, plays a key role in this, since ketone bodies can intervene both in tumor metabolism and in immunological processes. In our experiment, selected breast cancer cells were treated with 3 mM Beta-hydroxybutyrate and their proliferation, chemo- and radiosensitivity compared to control cells were examined. Control cells were treated identically but were not exposed to Beta-hydroxybutyrate. It can be stated that there was no statistically significant difference between the two groups.

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Neben chemotherapeutischen und chirurgischen Maßnahmen ist die Bestrahlung integraler Bestandteil multimodaler Therapiekonzepte bei malignen Tumorerkrankungen. In diesem Zusammenhang spielt der Einblick in physiologische und pathophysiologische Abläufe in menschlichen Zellen und auf molekularer Ebene  eine zunehmende Rolle. Auf diese Weise werden komplexe Stoffwechselwege mit ihren unterschiedlichen Funktionen und ihren aus einzelnen Proteinen bestehenden Komponenten immer besser verstanden. Allerdings entstehen durch die Kenntnis dieser Stoffwechselwege neue Fragen, die Gegenstand medizinischer Forschung sind.  Der TGFβ-Signalweg ist ein wesentlicher intrazellulärer Signalweg, der neben zahlreichen anderen Funktionen einen Einfluss auf die Entstehung bestimmter Tumorerkrankungen hat. Eine Vielzahl an Einzelnukleotid-Polymorphismen (single nucleotide polymorphisms, SNP) ist bekannt sowie die Erkenntnis darüber, dass die Anwesenheit von verschiedenen Varianten eines SNP einen Einfluss auf die Zellvitalität hat je nach Behandlungsbedingung. Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss von Keimbahn-Polymorphismen in Genen des TGFβ-Signalwegs und der DNA-Reparatur auf die Strahlenempfindlichkeit lymphoblastoider Zellen zu untersuchen. Hierzu wurden 54 käuflich erworbene lymphoblastoide Zellen angezüchtet. Jede dieser Zelllinien wurde sechs parallelen Behandlungsbedingungen unterworfen. Neben der unbehandelten Kontrolle und einer mit anti-TGFβ behandelten Kontrolle wurden Zellen einer alleinigen Bestrahlung mit 3 Gy ausgesetzt. Darüber hinaus wurden Zellen 16 Stunden vor der Bestrahlung mit TGFβ1 oder anti-TGFβ vorinkubiert oder unmittelbar nach der Bestrahlung mit TGFβ1 behandelt.  Nach Ablauf einer 24-stündigen Inkubationszeit erfolgte die Zellvitalitätsmessung mittels FACS (fluorescence activated cell sorting)–Analyse. Die Ergebnisse wurden mit Daten von insgesamt 1656 polymorphen Positionen (aus HapMap Datenbank) aus 21 Kandidatengenen korreliert. Auf diese Weise sollte der Einfluss dieser Polymorphismen auf die Zellvitalität ermittelt werden. Sowohl bei SMAD3 als auch bei SMAD7 fanden sich jeweils 2 SNP, die ein perfektes bzw hohes Kopplungsungleichgewicht (linkage disequilibrium) aufwiesen. Insgesamt waren zwölf Polymorphismen aus acht Genen (TGFBR1, SMAD2, SMAD3, SMAD7, BRCA2, MSH2, MSH6 und XRCC1) mit signifikanten Veränderungen der Zellvitalität assoziiert. Das Variantenallel scheint bis auf wenige Ausnahmen einen zytoprotektiven Effekt zu haben. Ausnahmen sind 3 SNP der Gene BRCA2, SMAD3 und SMAD 7, bei denen der Wildtyp mit höherer Zellvitalität einhergeht. Bei alleiniger Bestrahlung wirkten sich SNP aus SMAD3, SMAD7, MSH2 und MSH6 modulierend auf die Zytotoxizität aus, wenn auch statistisch nicht signifikant. Interessanterweise zeigten sich bei Betrachtung der Auswirkung einer Stimulation mit TGFβ1 vor und nach Bestrahlung mit 3 Gy dieselben SNP als statistisch signifikante Modellprädiktoren wie auch bei alleiniger Bestrahlung mit Ausnahme eines SNP aus SMAD3.  Bei Vorinkubation mit TGFβ1 wirkte sich die MSH2-Variante stärker aus. Hier entstand beim Wildtyp ein zusätzlich zytotoxischer Einfluss im Vergleich zur Stimulation nach Bestrahlung. Bei Inhibition durch anti-TGFβ vor der Bestrahlung zeigte noch ein SNP aus MSH6 und ein SNP aus SMAD7 einen zytoprotektiven Effekt.  Einige Ergebnisse dieser Arbeit könnten, sofern sie im Verlauf durch nachfolgende Studien bestätigt bzw. erweitert werden helfen Therapiekonzepte maligner Tumoren zu optimieren und eine individuelle Radiotherapie zu ermöglichen.

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