Orientador: Paula Regina Kuser Falcão / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T04:08:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caminha_IsabelPereira_M.pdf: 3436107 bytes, checksum: b845e4fcef68195720f058be396caa68 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A capacidade de Gluconacetobacter diazotrophicus produzir ácidos orgânicos representa uma das suas potenciais aplicações biotecnológicas. Entretanto, a via metabólica do gluconato é bastante complexa e, muitas vezes, inviável economicamente. Este estudo tem como objetivo buscar uma maneira de otimizar a síntese do produto de interesse. A opção sugerida é alterar as enzimas envolvidas na conversão de gluconato em cetogluconatos, visando aumentar a concentração de ácido glicônico. A mutagênese dirigida é uma técnica utilizada neste tipo de estudo, entretanto, realizar e avaliar diversos tipos de mutações exige grande demanda de tempo e recursos financeiros. A biologia computacional pode ajudar a encurtar o caminho dos processos experimentais, por isto foi utilizada neste estudo. Após uma busca no genoma de G. diazotrophicus, foram selecionadas oito ORFs relacionadas com a produção de ácido glicônico. Como nenhuma delas possui uma estrutura resolvida experimentalmente, foi utilizada uma técnica de predição, a modelagem por homologia, com o objetivo de inferir a respeito do funcionamento de cada proteína. Uma estratégia de substituição de resíduos selecionados por alaninas aliada à modelagem molecular foi utilizada para avaliar o impacto dessa mutação. Um estudo da via metabólica do gluconato em diversos organismos forneceu dados suficientes para eleger os dois melhores alvos para a mutagênese, uma gluconato 5-desidrogenase e uma putativa gluconato quinase, ambas relacionadas com a conversão de ácido glicônico em cetogluconatos. A partir de um estudo do mecanismo catalítico das enzimas, foi possível selecionar os possíveis resíduos críticos para a atividade enzimática. Estes foram substituídos, in silico, por alaninas, e as consequências das alterações foram analisadas. As mutações que acusaram um impacto no funcionamento da enzima foram Arginina 106 e Serina 152 na gluconato 5-desidrogenase, e Histidina 133 na gluconato quinase. Espera-se que, ao substituirmos estes resíduos, o potencial catalítico seja minimizado ou até mesmo inativado, diminuindo a quantidade de gluconato convertido em outros produtos. Estes resultados serão testados experimentalmente por colaboradores. / Abstract: The ability of Gluconacetobacter diazotrophicus to produce organic acids represents one of its potential biotechnological applications. However, the metabolic pathway of gluconate is quite complex and often impracticable economically. This study aims to find a way to optimize the synthesis product of interest. The suggested option is to alter the enzymes involved in the conversion of gluconate into cetogluconates, to increase the concentration of gluconic acid. Site directed mutagenesis is a technique used in this type of study, however, implement and evaluate various types of mutations requires a great deal of time and financial resources. The computational biology can help shorten the path of experimental processes, so it was used in this study. After a search in the genome of G. diazotrophicus, eight ORFs were selected related to the production of gluconic acid. As there is little physical or structural information available for this enzyme, we used a technique of prediction, homology modeling, in order to infer about the function of each protein. A molecular modeling approach with an amino acid replacement by alanines strategy was employed to assess the impact of this mutation. A study of the metabolic pathway of gluconate in several organisms has provided sufficient data to choose the two best targets for mutagenesis, a gluconate 5-dehydrogenase and a putative gluconate kinase, both related to the conversion of gluconic acid in cetogluconates. From a study of the catalytic mechanism of enzymes, it was possible to select any residues critical for enzymatic activity. These were replaced in silico by alanines, and the consequences of changes were analyzed. Detailed analysis of the modeled structures reveals that the mutations that may cause an impact on the functioning of the enzyme were Arginine 106 and Serine 152 in gluconate 5- dehydrogenase, and Histidine 133 in gluconate kinase. It is expected that, in replacing these residues, the catalytic potential is minimized or even inactivated, reducing the amount of gluconate converted into other products. These results will be experimentally tested by collaborators, and once proved right our findings may be applicable in the use of this bacteria in biotechnological processes / Mestrado / Bioinformatica / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Submitted by Haroudo Xavier Filho (haroudo.xavierfo@ufpe.br) on 2016-04-22T16:20:14Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese_Renata_Almeida_PPGG_041115.pdf: 4144409 bytes, checksum: 709008675e5c4c4efeeb7b0b06e8e4ee (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-22T16:20:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese_Renata_Almeida_PPGG_041115.pdf: 4144409 bytes, checksum: 709008675e5c4c4efeeb7b0b06e8e4ee (MD5) Previous issue date: 2015-07-30 / CAPES / Reuni / CNPq / A cana-de-açúcar tem papel relevante na economia brasileira, apesar de estar sucetível a fatores bióticos e abióticos que influenciam para redução de produtividade agrícola e industrial. Apesar de existirem organismos como agentes causais de doenças que contribuam com danos à cana-de-açúcar, micro-organismos simbiontes interagem com a cultura conferindo benefícios no processo, tais como a fixação de Nitrogênio. Dessa forma, a análise das proteínas envolvidas na resposta a fatores bióticos pode auxiliar no desenvolvimento de novas variedades. No presente trabalho, foi analisado o proteoma da interação da cana-de-açúcar com patógeno (Leifsonia xyli subsp. xyli; Lxx) e/ou com o simbionte (Gluconacetobacter diazotrophicus; Gd) por 2-DE (Eletroforese bidimensional) seguida de MS (Espectrometria de massa). Os resultados da eletroforese bidimensional com a interação cana-de-açúcar/Gd mostraram que 173 spots foram diferencialmente expressos. A análise por espectrometria de massa identificou 65 proteínas. Tais proteínas foram principalmente associadas com produção de energia, componentes de fotossistemas e indução de resposta a estímulos ambientais. Na interação cana-de-açúcar/Lxx, em análise da eletroforese bidimensional, se observou 138 spots com expressão diferenciada. A análise por espectrometria de massa identificou 56 proteínas responsivas a estresses bióticos, defesa e metabolismo de carboidratos. Durante a interação simultânea com Gd e Lxx, o proteoma da cana-de-açúcar a análise da eletroforese bidimensional mostrou que 142 spots apresentaram nível de expressão alterada. A análise por espectrometria de massa identificou 30 proteínas associadas com metabolismo de carboidratos e defesa contra estresses bióticos. Os resultados obtidos compõem um conjunto de proteínas (e genes codificantes) com provável utilidade como marcadores funcionais auxiliares no melhoramento genético, na seleção de variedades com interação benéfica de crescimento/fixação biológica de nitrogênio com Gd, e/ou maior resistência à patogenicidade de Lxx. / The sugarcane has an important role in the Brazilian economy, despite its suceptibility to biotic and abiotic factors that decrease agricultural and industrial productivity. Although there are parasitic organisms that contribute to damage sugarcane, symbiotic microorganisms interact with the culture, providing benefits in the process, such as nitrogen fixation. Thus, the analysis of proteins involved in the response to biotic factors may assist the developing new sugarcane varieties. In this study, we analyzed the proteome of the interaction of sugarcane with pathogen (Leifsonia xyli subsp. xyli; Lxx) and / or symbiont (Gluconacetobacter diazotrophicus; Gd) by 2-DE (Two-dimensional electrophoresis) followed by MS (Mass Spectrometry). The results of two-dimensional electrophoresis with sugarcane / Gd interaction showed that 173 spots showed altered expression level. Analysis by mass spectrometry identified 65 proteins. These differentially expressed proteins were primarily associated with energy production, and induction components photosystems response to environmental stimuli. Since the sugarcane interaction / Lxx the analysis of two-dimensional electrophoresis demonstrated that 138 spots showed altered expression level. The analysis by mass spectrometry identified 56 proteins responsive to biotic stresses, defense and carbohydrate metabolism. During simultaneous interaction with Gd and Lxx, the proteome analysis of sugarcane showed that 142 spots with altered expression level. Analysis by mass spectrometry identified 30 proteins associated with carbohydrate metabolism and protection against biotic stresses. The results obtained in this work comprise a set proteins (and encoding genes) with probable utility as auxiliary functional markers in plant breeding, in the selection of varieties with beneficial interaction for growth/biological nitrogen fixation with Gd, and/or increased resistance to pathogenic Lxx.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:18:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarolinaCSO.pdf: 673645 bytes, checksum: 65edb3dd5d260d66ee98b34da41f4185 (MD5) Previous issue date: 2009-02-27 / Gluconacetobacter diazotrophicus ? uma alfa-proteobact?ria Gram-negativa, tolerante a meios ?cidos, fixadora de nitrog?nio atmosf?rico e foi a primeira bact?ria diazotr?fica endof?tica isolada da cana-de-a??car. Por sua vez, Gluconobacter oxydans, tamb?m alfa-proteobact?ria Gram-negativa, possui a capacidade de oxidar incompletamente alco?is e carboidratos. Ambas de interesse biotecnol?gico e industrial, essas bact?rias tiveram seus genomas seq?enciados completamente em 2007. Desta forma, foi de interesse desse trabalho analisar e comparar os genes de reparo do DNA devido sua import?ncia na manuten??o da integridade gen?mica. Sendo assim, as vias de reparo presentes nos dois organismos foram identificadas, utilizando como base uma terceira alfa-proteobact?ria, a Caulobacter crescentus, cujos genes de reparo foram descritos por um trabalho anterior e tamb?m os genes bem estabelecidos para o reparo do DNA em Escherichia coli. Para esse estudo, um banco de dados contendo ort?logos para os genes de reparo de DNA encontrados nos organismos foi criado e an?lises comparativas por similaridade usando o pacote Blast e o software Clustal foram feitas. Este estudo demonstrou que as principais vias de reparo ao DNA reparos por excis?o, reparo direto, reparo recombinacional e reparo pelo sistema SOS est?o presentes nos organismos analisados, demonstrando, na maioria das vezes, boa similaridade com E. coli. Interessantemente, foram encontradas duplica??es g?nicas nos quais uma das c?pias estava presente no cromossomo e a outra, no plasm?deo, como no caso de UvrD, DnaE e Ssb, possivelmente caracterizando eventos de transfer?ncia lateral. Por fim, uma grande novidade foi a identifica??o de ort?logos para RecB em G. diazotrophicus e G. oxydans e de ort?logos duplicados de RecD em G. diazotrophicus. At? o momento, n?o havia sido relatada a presen?a de membros da via de inicia??o RecBCD do reparo recombinacional em alfaproteobact?rias