Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5040.pdf: 2753762 bytes, checksum: 183de6a78d0f606bfd3485cc5c3d7711 (MD5) Previous issue date: 2013-03-21 / Universidade Federal de Sao Carlos / The sugarcane sugar (sucrose) is a raw material produced in abundance in Brazil, being attractive to produce high added-value by-products. The gluconic acid (GA) can be obtained by multienzymatic conversion of sucrose, using three enzymes. Invertase, responsible for the inversion of sucrose to glucose and fructose, glucose oxidase (GOD) responsible for the glucose oxidation and catalase (CAT) responsible for decomposition of hydrogen peroxide. In multienzymatic process fructose is obtained as a byproduct, also of great interest to the food, pharmaceutical and chemical industries. In this study, the production of GA from sucrose in airlift reactor is evaluated. Temperature and pH of maximum activity were determined for the enzymes invertase, GOD and CAT , as well as the thermal stability in the absence of substrate. Invertase enzymatic activity was quantified by formation of reducing sugars on a 200 mM sucrose solution at 30 ° C, and pH 4.8. The enzymatic activity of GOD and the CAT were determined by monitoring respectively the formation of H2O2 from a solution of glucose 1 g/L, 25°C, pH 5.0 and the decomposition of H2O2 from a solution of H2O2 35 mM, 25°C, pH 7.5. Invertase showed maximum activity at 45 ºC and pH 5.0; GOD at 55ºC and pH 6.0 and CAT at 25 ° C and pH 8.0, respectively. From the activity profiles as a function of temperature and pH, the operational conditions of 50, 45 and 40°C at pH 5.0 and 6.0 were pre-selected for the multienzymatic process. It was found that the best half-lives times of the soluble enzymes, invertase, GOD and CAT, occurred in the condition of 40°C and pH 6.0, respectively 137, 105 and 98 h. A kinetic study was carried out at 40°C and pH 6.0. The kinetics of the enzyme invertase showed a behavior best predicted by the model of substrate inhibition. Michaelis-Menten model (MM) was fitted to experimental data of GOD and substrate inhibition model best predicted the kinetics behavior of CAT. The proposed kinetic models were used to estimate enzyme/substrate ratio (w/w) used in the production of GA in agitated and aerated and airlift bioreactors. On the other hand, in the batch assays conducted in airlift bioreactor were obtained AG real yields of 80.38 ± 5.69% and global yields of 103.20 ± 13.96% and conversion of sucrose of 98.86 ± 0.97%; obtained after 5 h. A new set of kinetic parameters including volumetric oxygen transfer coefficient (kLa) was based on the experimental data from tests in airlift bioreactor. These showed that Bi-Bi Ping-Pong model both with or without product inhibition correspond satisfactorily to the tendency of the experimental data. / O açúcar de cana (sacarose) é uma matéria-prima produzida em abundância no Brasil, sendo atrativa a produção de derivados com maior valor agregado. O ácido glucônico (AG) pode ser obtido através da conversão multienzimática da sacarose, utilizando como biocatalisadores as enzimas invertase, glicose oxidase (GOD) e catalase (CAT), responsáveis respectivamente pela inversão da sacarose, oxidação da glicose e decomposição de peróxido de hidrogênio (H2O2). No processo multienzimático obtém-se como subproduto a frutose, também de grande interesse para as indústrias alimentícia, farmacêutica e química. No presente trabalho foi avaliada a produção de AG a partir de sacarose em reator airlift. As enzimas invertase, GOD e CAT solúveis foram caracterizadas quanto à temperatura e ao pH de máxima atividade, bem como quanto à estabilidade térmica na ausência de substrato. A atividade enzimática da invertase foi quantificada pela ação da invertase sobre uma solução de sacarose 200 mM a 30ºC, pH 4,8, acompanhando-se a formação de açúcares redutores totais. As atividades enzimáticas da GOD e da CAT foram determinadas monitorando respectivamente a formação de H2O2 a partir de uma solução de glicose 1 g/l, 25ºC, pH 5,0 e a decomposição de H2O2 a partir de uma solução de H2O2 35 mM, 25ºC, pH 7,5. Invertase apresentou máxima atividade a 45ºC e pH 5,0; GOD a 55ºC e pH 6,0 e CAT a 25ºC e pH 8,0, respectivamente. A partir dos perfis de atividade em função da temperatura e do pH, as condições operacionais de 50, 45 e 40ºC em pHs 5,0 e 6,0 foram pré-selecionadas para a bioconversão multienzimática de sacarose a AG. Verificou-se que os melhores tempos de meias-vidas das enzimas invertase, GOD e CAT solúveis ocorreram na condição de 40ºC e pH 6,0, respectivamente 137, 105 e 98 h. Um estudo cinético foi realizado a 40ºC e pH 6,0. A cinética da enzima invertase apresentou comportamento previsto pelo modelo de inibição pelo substrato. O modelo de Michaelis-Menten (MM) foi ajustado aos dados experimentais da GOD e o modelo de inibição pelo substrato foi o que melhor se ajustou à cinética da CAT. Os modelos cinéticos propostos serviram para a estimativa das relações enzima/substrato (m.m-1) empregadas na produção de ácido glucônico em biorreatores agitado e aerado e airlift. Os ensaios em batelada em biorreator airlift apresentaram eficiências real e global em AG de respectivamente 80,40 ± 5,70 % e 103,20 ± 13,96 % e conversão de sacarose de 98,86 ± 0,97 %; obtidas após 5 h. Um novo ajuste dos parâmetros cinéticos incluindo o coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) foi realizado com base nos dados experimentais dos ensaios em biorreator airlift. Este mostrou que os modelos Bi-Bi Ping-Pong com ou sem inibição pelo produto responderam de forma satisfatória à tendência dos dados experimentais.

Frutose e Ácido Glicônico são produtos importados empregados em diferentes setores nas áreas química, farmacêutica e alimentícia, representando um mercado de dois milhões de dólares (US$ 2,0 milhões) por ano. Por sua vez, a sacarose pode ser empregada como matéria-prima para a obtenção destes produtos através de conversão enzimátiva empregando invertase e glicose-oxidase. O uso de biorreatores com membrana (MBR) mostra-se interessante em processos enzimáticos, pois, ao serem empregados em processos contínuos permitem, simultaneamente, produção e separação dos produtos, reduzindo a formação de subprodutos e, eventual, inibição da enzima por excesso de substrato ou produtos. A sacarose é convertida em xarope de açúcar invertido (solução equimolar de frutose e glicose) pela invertase (Bioinvert®, enzima comercial), seguido pela oxidação da glicose em ácido glicônico pela ação da glicose oxidase (GO). O processo de conversão multi-enzimático da sacarose foi obtido através da alimentação de sacarose (50 mM) em reator com membrana (MBR) contendo invertase (24 U/mL), glicose-oxidase (0,5 U/mL) e catalase (470 U/mL) e operando com vazão específica de 6,0 h-1, 35ºC e pH 5,5. As condições operacionais otimizadas possibilitaram a conversão completa da sacarose (X = 100 %) e da glicose resultante (Y = 100%) com velocidades específicas de reação de 4,2 mmol/U.h, 0,60 mmol/U.h e 0,00062 mmol/U.h, respectivamente, para a invertase, glicose oxidase e catalase. A respeito da oxidação da glicose, a adição de catalase no meio reacional se fez necessária para minimizar os efeitos inibitórios sobre a GO através do peróxido de hidrogênio formado. / The fructose and gluconic acid are products of great application in chemical, pharmaceutical and food industry. The actual Brazilian market for these compounds is about US$ 2 millions, here as the sucrose, the raw-material used for their production, represents about 2.4% of the Brazil\'s GNP. This conversion increases the value added to the sugarcane, usually marketed as a commodity, because the fructose and gluconic acid are more valuable products than sucrose. The use of membrane bioreactor (MBR), which operates under mild conditions regarding internal pressure, temperature and pH, has been growing along the years for enzyme catalyzed processes. Moreover, in the MBR the reaction and separation of the products occur simultaneously, avoiding the formation of by-products and the eventual inhibition of the enzyme caused by excess of substrate or products. The sucrose is converted to the inverted syrup (an equimolar solution of fructose and glucose) by invertase (in this work was employed Bioinvert®, a commercial invertase) followed by the oxidation of glucose in gluconic acid by the glucose oxidase (GO). The multi-enzymatic conversion of sucrose was attained when carried out under initial substrate of 50mM and invertase, glucose oxidase and catalase concentrations, respectively, of 24.0 U/mL, 0.5 U/mL and 470 U/mL in a membrane reactor utilizing a dilution rate of 6.0 h-1, 35ºC and pH 5.5. The optimized operational conditions led to a conversion yield of 100% for sucrose hydrolysis and glucose oxidation steps resulting in enzyme productivity of 4.2 mmol/U.h, 0.60 mmol/U.h and 0.00062 mmol/U.h, respectively, to invertase, glucose oxidase and catalase. In regard to the glucose oxidation, the addition of catalase in the reaction medium was necessary, in order to minimize the inhibition of the GO by the hydrogen peroxide formed.

Frutose e Ácido Glicônico são produtos importados empregados em diferentes setores nas áreas química, farmacêutica e alimentícia, representando um mercado de dois milhões de dólares (US$ 2,0 milhões) por ano. Por sua vez, a sacarose pode ser empregada como matéria-prima para a obtenção destes produtos através de conversão enzimátiva empregando invertase e glicose-oxidase. O uso de biorreatores com membrana (MBR) mostra-se interessante em processos enzimáticos, pois, ao serem empregados em processos contínuos permitem, simultaneamente, produção e separação dos produtos, reduzindo a formação de subprodutos e, eventual, inibição da enzima por excesso de substrato ou produtos. A sacarose é convertida em xarope de açúcar invertido (solução equimolar de frutose e glicose) pela invertase (Bioinvert®, enzima comercial), seguido pela oxidação da glicose em ácido glicônico pela ação da glicose oxidase (GO). O processo de conversão multi-enzimático da sacarose foi obtido através da alimentação de sacarose (50 mM) em reator com membrana (MBR) contendo invertase (24 U/mL), glicose-oxidase (0,5 U/mL) e catalase (470 U/mL) e operando com vazão específica de 6,0 h-1, 35ºC e pH 5,5. As condições operacionais otimizadas possibilitaram a conversão completa da sacarose (X = 100 %) e da glicose resultante (Y = 100%) com velocidades específicas de reação de 4,2 mmol/U.h, 0,60 mmol/U.h e 0,00062 mmol/U.h, respectivamente, para a invertase, glicose oxidase e catalase. A respeito da oxidação da glicose, a adição de catalase no meio reacional se fez necessária para minimizar os efeitos inibitórios sobre a GO através do peróxido de hidrogênio formado. / The fructose and gluconic acid are products of great application in chemical, pharmaceutical and food industry. The actual Brazilian market for these compounds is about US$ 2 millions, here as the sucrose, the raw-material used for their production, represents about 2.4% of the Brazil\'s GNP. This conversion increases the value added to the sugarcane, usually marketed as a commodity, because the fructose and gluconic acid are more valuable products than sucrose. The use of membrane bioreactor (MBR), which operates under mild conditions regarding internal pressure, temperature and pH, has been growing along the years for enzyme catalyzed processes. Moreover, in the MBR the reaction and separation of the products occur simultaneously, avoiding the formation of by-products and the eventual inhibition of the enzyme caused by excess of substrate or products. The sucrose is converted to the inverted syrup (an equimolar solution of fructose and glucose) by invertase (in this work was employed Bioinvert®, a commercial invertase) followed by the oxidation of glucose in gluconic acid by the glucose oxidase (GO). The multi-enzymatic conversion of sucrose was attained when carried out under initial substrate of 50mM and invertase, glucose oxidase and catalase concentrations, respectively, of 24.0 U/mL, 0.5 U/mL and 470 U/mL in a membrane reactor utilizing a dilution rate of 6.0 h-1, 35ºC and pH 5.5. The optimized operational conditions led to a conversion yield of 100% for sucrose hydrolysis and glucose oxidation steps resulting in enzyme productivity of 4.2 mmol/U.h, 0.60 mmol/U.h and 0.00062 mmol/U.h, respectively, to invertase, glucose oxidase and catalase. In regard to the glucose oxidation, the addition of catalase in the reaction medium was necessary, in order to minimize the inhibition of the GO by the hydrogen peroxide formed.