Le fer est un cofacteur enzymatique indispensable à la survie de tous les eucaryotes. La biodisponibilité du fer est à ce point critique que des mécanismes homéostatiques sont enclenchés afin d'en réduire la consommation en période de carence. Cette stratégie a pour but d'économiser le fer et de le conserver pour des processus cellulaires fer-dépendants essentiels à la survie cellulaire. Chez la majorité des eucaryotes, la nature de ces mécanismes est toujours inconnue. Mes travaux de doctorat ont donc porté sur l'élucidation du mécanisme par lequel la levure modèle Schizosaccharomyces pombe parvient à limiter l'utilisation de son fer lorsque celui-ci se raréfie. Lors de mes travaux, j'ai identifié trois gènes codant pour des composantes fer-dépendantes chez S. pombe qui subissent une répression lors d'une carence en fer : pcl1[indice supérieur +], sdh4[indice supérieur +] et isa1[indice supérieur +]. Il a été déterminé que des éléments en cis de type CCAAT sont au centre de leur expression différentielle. Des évidences génétiques et biochimiques ont montré qu'un hétérocomplexe protéique formé des sous-unités Php2/3/4/5 est impliqué dans la régulation fer-dépendante de la transcription de pcl1[indice supérieur +], sdh4[indice supérieur +] et isa1[indice supérieur +]. Plus précisément, c'est la sous-unité Php4 qui est responsable de la répression de leur expression en carence de fer. Il s'avère aussi que la transcription du gène codant pour Php4 (php4[indice supérieur +]) est elle-même régulée par le statut en fer. Il a d'ailleurs été démontré que le facteur de transcription de type GATA Fep1 réprime l'expression de php4[indice supérieur +] en présence de fer, et ce, en s'associant à son promoteur de manière fer-dépendante. Une étude à large spectre à l'aide de micropuces à ADN a révélé que, lors d'une carence en fer, Php4 réprime la transcription d'un régulon composé de 86 gènes, dont la majorité codent pour des protéines fer-dépendantes ou des composantes impliquées dans l'homéostasie du fer. Parmi ceux-ci se trouve le gène codant pour le répresseur Fep1 (fep1[indice supérieur +]). Cette découverte a mis au jour une boucle de régulation réciproque entre les facteurs de transcription Fep1 et Php4. La capacité de Php4 à réprimer directement la transcription a été confirmée par des essais de type simple-hybride. Ces essais ont également démontré que la fonction de Php4 est inactivée post-traductionnellement en présence d'ions de fer. Php4 est donc un régulateur transcriptionnel capable de jauger les niveaux de fer intracellulaires. L'étude de la régulation de la fonction de Php4 par le fer a permis de découvrir que le répresseur Php4 se localise au noyau lors d'une déficience en fer, tandis qu'il est exporté vers le cytosol par l'exportine Crm1 en présence de fer. Cet exportation nucléaire fer-dépendante implique la glutarédoxine Grx4. L'action inhibitrice de Grx4 sur la fonction de Php4 ne se limite pas à la régulation de sa localisation cellulaire. J'ai pu démontrer qu'en présence de fer, l'activité transcriptionnelle de Php4 est directement inhibée au noyau par Grx4. Cette régulation de Php4 par Grx4 s'avère directe étant donné l'association de ces deux protéines in vivo chez S. pombe. En conclusion, j'ai découvert que le répresseur Php4 est un élément central de la régulation de l'utilisation du fer chez la levure fissipare S. pombe . La découverte du rôle de Grx4 dans la régulation post-traductionnelle de Php4 pave la voie à l'élucidation d'un sentier signalétique par lequel une cellule eucaryote communique son statut en fer à ses régulateurs homéostatiques. La biodisponibilité du fer étant un facteur de virulence majeur chez les levures pathogènes, l'acquisition de nouvelles connaissances quant à la régulation de l'homéostasie du fer chez les mycètes devient cruciale pour le développement de nouveaux agents antifongiques.

La structure de trois oxydoréductases (la glutathion peroxydase (Gpx), la thiorédoxine (Trx) et la glutarédoxine (Grx)) de Populus trichocarpa × deltoides (le peuplier) a été caractérisée par diffraction des rayons X. Les Gpxs forment un groupe d’enzymes qui régulent la concentration des espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules, et qui les protègent des effets d’un stress oxydant. Contrairement à leurs homologues d’origine animale, les Gpxs végétales ne dépendent pas du glutathion (GSH) mais des Trx pour leur fonctionnement. Dans cette étude, j'ai résolu les structures des formes réduite et oxydée de la Gpx5 de peuplier et montré que des changements conformationnels drastiques sont nécessaires pour passer d’une forme à l’autre. Les Trxs régulent diverses protéines cibles par la réduction de leur pont disulfure. Mon objectif était de comprendre le mécanisme catalytique d’une nouvelle isoforme, la PtTrxh4, dont la capacité à accepter des électrons de la Grx a été récemment démontrée. Cette PtTrxh4 contient trois cystéines, la première localisée dans une extension en position N-terminale (Cys4) et deux situées dans le site actif classique (WC1GPC2) de la Trx. Les résolutions des structures de l’enzyme sauvage et du mutant C4S m’ont permis de proposer un mécanisme catalytique en quatre étapes en accord avec les études enzymatiques. Les Grxs sont des protéines qui utilisent des électrons du GSH en particulier pour catalyser des réactions d'échange de thiol-disulfure. Ici, je présente la structure de la PtGrxS12 (en complexe avec le GSH), la première structure de la Grx végétale de sous-classe 1 ayant un site actif de motif atypique 28WCSYS32. / Three oxidoreductases (glutathione peroxidase, GPX; thioredoxin, Trx and glutaredoxin, Grx) from Populus trichocarpa × deltoides (poplar tree) were characterized using X-ray crystallography approach. GPXs are a group of enzymes that regulate the levels of oxygen species in cells, and protect them against oxidative damage. In this study, I have determined the crystal structures of the reduced and oxidized form of poplar GPX5 (PtGPX5). Comparison of both redox structures indicates that a drastic conformational change is necessary to bring the two distant cysteine residues together to form an intramolecular disulfide bond. Trxs regulate various protein partners through the thiol-disulfide(s) reduction. The aim of this study is thus to precisely describe the catalytic mechanism of a new isoform of Trx, PtTrxh4, since it has been demonstrated recently to be reduced by Grx. PtTrxh4 contains three cysteines; one localized in an N-terminal extension (Cys4) and two in the usual Trx active site (WC1GPC2). Two crystal structures of PtTrxh4 solved in this study, wild-type and C61S mutant, allow us to propose a four-step disulfide cascade catalytic mechanism in accordance with enzymatic studies. Grxs are highly conserved redox-proteins that utilize electrons from GSH particularly to catalyze thiol-disulfide exchange reactions. Here, I present the structure of glutathionylated PtGrxS12, the first structure of plant Grx of subclass 1 with an atypical 28WCSYS32 active site. Protein structures solved here shed lights to our understanding of the redox mechanism in plant and to the enzyme-substrate interactions.

Le fer est un cofacteur essentiel à la croissance des organismes. Cependant, un surplus de fer conduit à la production de dérivés toxiques de l’oxygène qui sont dangereux pour les cellules. La concentration intracellulaire de fer doit donc être régulée. Lorsque la biodisponibilité du fer s’amenuise, la plupart des cellules augmentent leur acquisition du fer environnemental tout en réduisant sa consommation en réprimant plusieurs voies métaboliques fer-dépendantes non-essentielles. Alors que les mécanismes qui régissent l’augmentation de l’acquisition du fer sont assez bien caractérisés, les composantes qui contrôlent la promotion de l’économie du fer sont largement méconnues. Mes travaux ont porté sur l’étude des mécanismes de contrôle de l’économie du fer chez la levure à fission Schizosaccharomyces pombe. Php4, une sous-unité du complexe liant les boîtes CCAAT, est responsable de la répression des gènes codants pour des protéines qui utilisent du fer lorsque ce dernier est en faible concentration. Il est déjà connu qu’en présence de fer, l’expression du gène php4+ est réprimée via le facteur de transcription Fep1. De plus, la protéine Php4 est inactivée et exportée hors du noyau lorsque les cellules croissent en présence de fer. Ce processus est dépendant à la fois de la présence de l’exportine Crm1 et de la monothiol glutarédoxine Grx4. L’objectif de recherche est de découvrir le mécanisme par lequel Grx4 inhibe Php4 en réponse à la présence de fer. L’approche du double-hybride a été utilisée pour quantifier la force de l’interaction entre Php4 et Grx4 et identifier les domaines de ces protéines qui y participent. Ce système nous a permis de déterminer que Php4 interagit de façon constitutive avec le domaine thiorédoxine (TRX) de Grx4, alors que l’interaction entre Php4 et le domaine glutarédoxine (GRX) est dépendante de la présence de fer. Nous avons déterminé que la cystéine 35 du domaine TRX et la cystéine 172 du domaine GRX sont essentiels pour l’interaction de chacun de ces domaines avec Php4. Des régions minimales de Php4 nécessaires pour son interaction avec chacun des domaines GRX et TRX ont aussi été identifiées. Par la suite, nous avons démontré que l’expression du domaine GRX seul de Grx4 est suffisante pour l’inactivation de Php4 en présence de fer. Puis, par des essais de fluorescence par complémentation bimoléculaire (BiFC), nous avons démontré que le domaine GRX de Grx4 interagit de façon fer-dépendante avec Php4 et qu’il est suffisant pour l’exportation de Php4 hors du noyau en présence de fer. Ces résultats révèlent que le mécanisme par lequel Php4 est inhibé en présence de fer dépend de son interaction avec le domaine GRX de Grx4. À la suite des résultats obtenus, un modèle illustrant l’interaction fer-dépendante entre Grx4 et Php4 suggère la présence potentielle d’un centre fer-soufre qui pourrait expliquer la nature de l’interaction fer-dépendante entre les deux protéines.

Dans la première partie de notre travail, nous avons étudié le rôle de la peroxyrédoxine-6 (Prdx6) sur un modèle d'ischémie/reperfusion. Comme la glutathion peroxydase (GSHPx) et la catalase, la Prdx6 est capable de neutraliser le peroxyde d'hydrogène et les hydroperoxydes organiques. Ces propriétés scavenger de la catalase et de la GSHPx jouent un rôle majeur dans la protection du tissu cardiaque soumis à un processus d'ischémie/reperfusion, en neutralisant les H2O2 et les hydroperoxydes formés dans ces conditions pathologiques. Nous avons donc cherché à vérifier si la Prdx6 peut contribuer également à un tel mécanisme de protection et nos résultats montrent que le déficit en Prdx6, chez la souris, ne peut être compensé par l'activité catalase ou l'activité GSHPx et suggère donc que cette enzyme joue un rôle non redondant avec les autres systèmes antioxydants cellulaires. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons tenté de préciser le rôle potentiel de la glutarédoxine-2 (Glrx2) dans les conditions d'ischémie/reperfusion cardiaque. On sait en effet que la Glrx2 mitonchondriale joue un rôle important de régulateur redox dans de nombreux organes des mammifères, en particulier le coeur. Nous avons donc testé l'effet d'une surexpression myocardique de Glrx2 sur l'incidence de l'apoptose et de la nécrose au cours de l'ischémie et de la reperfusion. Sur des préparations de coeurs isolés de souris Glrx2 transgéniques soumis à une période de 30 minutes d'ischémie globale, suivie de 2 heures de reperfusion (modèle du coeur travaillant). Comparés à des coeurs d'animaux de souche sauvage, les coeurs des souris transgéniques Glrx2 maintenaient une fonction contractile significativement meilleure et présentaient une taille d'infarctus réduite ainsi que des phénomènes d'apoptose limités. La surexpression de Glrx2 entraînait également une diminution de la fuite de cardiolipine mitochondriale, une diminution de l'activité des espèces réactives dérivées de l'oxygène et une préservation du rapport glutathion réduit / glutathion oxydé. Dans la troisième partie de ce travail, nous avons étudié les effets d'une thérapie génique PR39 chez la souris. PR39 est un peptide pro-angiogénique qui a déjà été impliqué en pathologie cardiaque. Dans cette étude, des souris mâles C57B1/J6 subissaient une injection intracardiaque d'une suspension d'adénovirus : codant PR39 (PR39), ou contruit dominant négatif FGFR1 (FGFR1-dn), ou vecteur vide (EV), ou PR39 plus un plasmide codant un construit dominant négatif HIF-1 (PR39 + HIF-1-dn). Une semaine plus tard, les coeursétaient soumis à 20 min d'ischémie et 2 heures de reperfusion ex vivo. Dans ces conditions, l'hémodynamique cardiaque restait inchangée dans les coeurs PR39, alors qu'elle se détériorait significativement dans les autres groupes. La cotransfection d'HIF-1-dn avec PR39 abolissait totalement cet effet cardioprotecteur. Dans la dernière partie de ce travail, nous avons étudié la contribution d'un traitement à la dexamethazone sur la récupération post-ischémique de la fonction cardiaque et sur le développement des troubles du rythme de reperfusion. Dans cette étude conduite sur des coeurs isolés de rats, le prétraitement dexamethazone réduit significativement l'incidence de la fibrillation ventriculaire. Nos résultats suggèrent que l'inhibition de la libération du cytochrome-C est impliquée dans la cardioprotection par la dexaméthazone.

L'adaptation des plantes face au stress thermique est cruciale pour leur survie et implique des réponses spécifiques telles que l’induction de protéines chaperonnes et la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). Les glutaredoxines (GRX), une famille de protéines thiol anti- oxydantes, jouent un rôle important dans la régulation redox et la réponse au stress oxydatif. Mes études se concentrent sur GRXS17, une protéine multi-domaine à cœur fer-soufre. Malgré un phénotype de développement sévère du mutant grxs17 à des températures normales et plus élevées, peu est connu sur les fonctions biochimiques et les rôles intracellulaires précis de GRXS17. J’ai montré au cours de ma thèse que GRXS17 fonctionne comme une chaperonnedépendante de l’oxydation de la cellule. Elle présente à la fois une activité de type foldase mais également holdase. L'exposition aux stress oxydatif et thermique provoque le passage d'une forme dimérique à des complexes à poids moléculaires élevés ce qui est consistant avec une activité holdase. J’ai également montré que GRXS17 est requis pour la tolérance à des hausses de température de manière dépendante de ses cystéines catalytiques. Des approches de transcriptomique, métabolomique et protéomique montrent une réponse au stress thermique retardée dans le mutant grxs17, des défauts dans l’accumulation de certains métabolites clés, et ont permis d'identifier de potentiels nouveaux interactants de GRXS17 dans des conditions de stress thermique. Ces éléments soutiennent la fonction chaperonne de GRXS17 dans desconditions normales et de stress thermiques. / Adaption of plants to heat stress is crucial for their survival and involves dedicated response such as chaperones proteins induction and production of reactive oxygen species (ROS). Glutaredoxins (GRX), a family of thiol redox proteins, play an important role in redox regulation and response to oxidative stress. The focus of our studies is on GRXS17 which is a multi-subunit iron-sulfur glutaredoxin. Despite the severe developmental phenotype of the grxs17 mutant at normal and elevated temperatures, relatively little is known about the biochemical functions and precise intracellular roles of GRXS17. I show during my thesis that GRXS17 function as a foldase and holdase redox-dependent chaperone. Oxidative and heat stress exposure cause a shift from a dimeric form to high MW complexes which is concordant with a holdase activity. I show that GRXS17 is required for the tolerance to moderated heatstress in a Cys-dependent manner. Transcriptomic, metabolomic and proteomic approaches show heat stress response delayed in grxs17, key-metabolites defects and allowed to identifynew potential GRXS17-interactor under heat stress conditions, supporting a potential protecting function of GRXS17 against stress damage.