Le génome des Influenzavirus A est constitué de huit segments d’ARN de polarité négative formant des ribonucléoprotéines virales (RNPv). La segmentation du génome complique l’empaquetage du génome, puisqu’un jeu complet de segments est nécessaire à l’infectiosité des virus. Il est aujourd’hui admis que le mécanisme d’empaquetage est sélectif et fait intervenir des interactions entre les ARN des différentes RNPv, qui dépendent vraisemblablement de la structure de l’ARN. Notre but a été de caractériser la fixation de la protéine virale NP, composant majeur des RNPv, sur l’ARN in vitro. Nous avons également mis en place une stratégie expérimentale afin de déterminer la structure de l’ARN au sein des particules virales. Ces deux aspects du projet ont été abordés par la cartographie chimique qui permet d’interroger la flexibilité de chaque nucléotide de l’ARN. Nos résultats démontrent une activité chaperone de la protéine NP ainsi que des sites préférentiels de fixation. Notre approche in viro a démontré que l’utilisation de deux sondes chimiques permet de discriminer les interactions ARN-ARN des interactions ARN-NP. / The Influenzavirus genome comprises eight segments of single-stranded RNA of negative polarity packaged in viral ribonucleoproteins (vRNP). Genome segmentation complicates packaging as a full set of vRNPs is required needed for virus infectivity. It is now accepted that packaging is selective and involves interactions between the RNA components of vRNPs that likely depend on the RNA structure. Our goal was to characterize the binding of the viral protein NP, the major component of the vRNP, on in vitro transcribed RNA. We also developed an experimental strategy to determine the RNA structure inside the viral particles. Both parts of the project were addressed with chemical mapping experiments, that interrogates the flexibility of each nucleotide in the RNA structure. Our results show that NP possess an RNA chaperone activity and binds preferential sites. Our in viro approach demonstrate that using two chemical probes allow us to discriminate between RNA-RNA and RNA-NP interactions.

L'adaptation des plantes face au stress thermique est cruciale pour leur survie et implique des réponses spécifiques telles que l’induction de protéines chaperonnes et la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). Les glutaredoxines (GRX), une famille de protéines thiol anti- oxydantes, jouent un rôle important dans la régulation redox et la réponse au stress oxydatif. Mes études se concentrent sur GRXS17, une protéine multi-domaine à cœur fer-soufre. Malgré un phénotype de développement sévère du mutant grxs17 à des températures normales et plus élevées, peu est connu sur les fonctions biochimiques et les rôles intracellulaires précis de GRXS17. J’ai montré au cours de ma thèse que GRXS17 fonctionne comme une chaperonnedépendante de l’oxydation de la cellule. Elle présente à la fois une activité de type foldase mais également holdase. L'exposition aux stress oxydatif et thermique provoque le passage d'une forme dimérique à des complexes à poids moléculaires élevés ce qui est consistant avec une activité holdase. J’ai également montré que GRXS17 est requis pour la tolérance à des hausses de température de manière dépendante de ses cystéines catalytiques. Des approches de transcriptomique, métabolomique et protéomique montrent une réponse au stress thermique retardée dans le mutant grxs17, des défauts dans l’accumulation de certains métabolites clés, et ont permis d'identifier de potentiels nouveaux interactants de GRXS17 dans des conditions de stress thermique. Ces éléments soutiennent la fonction chaperonne de GRXS17 dans desconditions normales et de stress thermiques. / Adaption of plants to heat stress is crucial for their survival and involves dedicated response such as chaperones proteins induction and production of reactive oxygen species (ROS). Glutaredoxins (GRX), a family of thiol redox proteins, play an important role in redox regulation and response to oxidative stress. The focus of our studies is on GRXS17 which is a multi-subunit iron-sulfur glutaredoxin. Despite the severe developmental phenotype of the grxs17 mutant at normal and elevated temperatures, relatively little is known about the biochemical functions and precise intracellular roles of GRXS17. I show during my thesis that GRXS17 function as a foldase and holdase redox-dependent chaperone. Oxidative and heat stress exposure cause a shift from a dimeric form to high MW complexes which is concordant with a holdase activity. I show that GRXS17 is required for the tolerance to moderated heatstress in a Cys-dependent manner. Transcriptomic, metabolomic and proteomic approaches show heat stress response delayed in grxs17, key-metabolites defects and allowed to identifynew potential GRXS17-interactor under heat stress conditions, supporting a potential protecting function of GRXS17 against stress damage.

O. oeni est une bactérie lactique responsable de la fermentation malolactique des vins. Un des mécanismes impliqués dans la survie de O. oeni dans ce milieu requière la synthèse de la protéine de stress de faible masse moléculaire (sHsp) Lo18. Cette sHsp exerce une activité de chaperon sur des substrats protéiques et lipidiques.Des variations de pH (5 à 9) ont permis de moduler l’oligomérisation de Lo18 in vitro et de démontrer que sa plasticité oligomérique est un élément clé pour ses activités. Des observations de la sHsp par microscopie électronique ont montré que Lo18 s’organise à pH 5 en un 16-mère composé de deux anneaux superposés ayant comme structure de base probable un dimère.La réponse adaptative de O. oeni a également été caractérisée suite à des stress fluidifiant sa membrane plasmique. Une étude transcriptomique a révélé une augmentation du taux de transcrits pour des gènes dont les produits interviennent dans la biosynthèse des acides gras membranaires saturés et insaturés lors d’un stress à l’alcool benzylique. Des approches physiologique, moléculaire et structurale ont permis de proposer un modèle décrivant l’action chronologique de Lo18 en lien avec ses deux activités de chaperon en réponse à un stress éthanol. Dès l’application du stress, Lo18 est fortement synthétisée et agit préférentiellement à la membrane sous une forme quaternaire simplifiée. O. oeni modifie alors sa composition en acides gras membranaires, affectant ainsi l’affinité de Lo18 pour la membrane ainsi que ses activités.Les résultats obtenus permettent non seulement, de mieux comprendre le fonctionnement et le rôle de Lo18 dans la réponse au stress de O. oeni mais aussi de mettre en exergue les mécanismes d’adaptation préservant l’intégrité de sa membrane cellulaire, élément essentiel dans la survie et la performance des ferments malolactiques dans le vin / Oenococcus oeni is a lactic acid bacterium which is able to perform malolactic fermentation in wine. The synthesis of the small heat-shock protein (sHsp) Lo18 is one of the mechanisms involved in O. oeni survival in wine. Lo18 possess a chaperone activity on both protein and lipid substrates. pH variations in the range 5-9 were used to modulated Lo18 oligomerization in vitro and indicated that oligomer plasticity is essential for its activities. Electron microscopy studies showed that Lo18 is organised in a double-ring of stacked octamers to form a 16-mer structure at pH 5. The dimer observed at basic pH is thought to be the building block leading to oligomerization.The adaptive response of O. oeni to stress fluidizing its cytoplasmic membrane was also investigated. A transcriptomic study indicated an increase of the transcript level of genes involved in biosynthesis of saturated and unsaturated membrane fatty acids during benzylalcohol stress. On the basis of physiological, molecular and structural approaches, a model describing the first steps of O. oeni response to ethanol stress was proposed. In the early steps of the stress, Lo18 is synthesised and addressed to the membrane under a simplified structure. During the course of adaptation to the presence of ethanol, changes of the phospholipids content occur. This affects Lo18 activities and its affinity for O. oeni membrane.The results allow us to better understand the activities and the role of Lo18 in stress response of O. oeni and highlight the mechanisms involved in the maintenance of membrane integrity, a crucial event for malolactic starter performance in wine

Le VIH-1 bourgeonne sous forme immature et doit subir l’étape de maturation afin d’acquérir son caractère infectieux. La maturation protéolytique du précurseur Pr55Gag induit le réarrangement morphologique de la particule alors que le dimère d’ARNg acquiert une compaction optimale. Ces réarrangements conformationnels restent encore inconnus et sont facilités par l’activité chaperonne de la protéine NCp7. Notre but a été de déterminer les différentes étapes menant à l’obtention d’un dimère d’ARNg mature. Nous avons donc étudié la structure des 550 premiers nucléotides du génome par cartographie chimique, à la fois 1. in vitro en présence des protéines Pr55Gag, GagΔp6, intermédiaires contenant le domaine NC et NCp7 et 2. in viro par l’approche hSHAPE-Seq que nous avons développé. Les particules matures et bloquées aux différentes étapes de maturation de Pr55Gag ont été analysées ainsi que des particules matures et totalement immatures traitées avec l’éjecteur de zinc AT-2. Ce traitement permet d’identifier les sites de protection de Pr55Gag et NCp7 ainsi que leur activité déstabilisatrice. / The HIV-1 particle buds from the infected cell as an immature particle and has to undergo a maturation process to become infectious. Proteolytic processing of Pr55Gag triggers morphological rearrangements of the particle whereas the gRNA dimer becomes more stable. Genomic rearrangements remain poorly understood and are facilitated by the RNA chaperone activity of the NCp7 protein. Our goal was to determining the different steps leading to the formation of the mature dimeric gRNA. To this end, the structure of the first 550 nucleotides of the HIV-1 genome was assessed by chemical probing 1. in vitro with Pr55Gag, GagΔp6, NC-containing intermediates and NCp7 proteins and 2. in viro with the hSHAPE-Seq approach we developed. Wild type and mutant viruses mimicking the sequential processing of Pr55Gag were analysed, as well as immature PR- and mature particles treated with the AT-2 zinc ejector, in order to identify the Pr55Gag and NCp7 binding sites and their gRNA destabilising activity.