A ampla distribuição das ureases na natureza é um indício da grande importância desta enzima para os mais diferentes organismos, fato que levou diversos pesquisadores ao redor do globo a dedicarem-se exclusivamente à caracterização destas enzimas. Apesar de ser uma proteína estudada ha quase um século, até o início deste trabalho apenas três ureases possuíam suas estruturas cristalográficas elucidadas e todas de origem bacteriana. A urease de Canavalia ensiformis (JBU) foi a primeira enzima desta família a ser descrita, em 1926 e ainda assim, apesar dos incansáveis esforços de diferentes grupos na caracterização estrutural e biológica desta proteína, sua estrutura cristalográfica só foi obtida no primeiro semestre de 2010. Tentativas anteriores de obtenção da estrutura cristalográfica de JBU falharam devido a baixa qualidade dos cristais formados por esta proteína através de técnicas convencionais de cristalização. Desta forma, na primeira parte deste trabalho relatamos o uso de técnicas alternativas de cristalização como o uso de ligantes ou aditivos, proteólise in situ e modificação química de resíduos de amino ácidos na obtenção de cristais de JBU com qualidade superior aos anteriormente obtidos, validando o uso destas metodologias na cristalização de proteínas recalcitrantes. Os cristais aqui obtidos, apesar de apresentarem qualidade superior aos previamente descritos na literatura, não foram otimizados ao ponto de obtenção da estrutura cristalográfica da enzima A atividade enzimática das ureases é dependente da presença de dois íons de níquel precisamente incorporados em seus sítios ativos. A biossíntese deste sítio ativo, bem como a incorporação de níquel na enzima consiste de um processo altamente regulado, cuja ocorrência depende da participação de diversas chaperonas (proteínas acessórias) agindo como reguladores pós traducionais. Apesar dos esforços já realizados, o mecanismo de ativação de ureases ainda permanece obscuro. Até hoje, os estudos concentraram-se em ureases de origem microbiana, sendo a informação disponível ainda extremamente limitada. Menos ainda é conhecido para o sistema de ativação de ureases de origem vegetal. Na segunda parte deste trabalho relatamos pioneiramente as primeiras tentativas de produção e caracterização de proteínas acessórias de origem vegetal. As proteínas UreD, UreF e UreG de soja (Glycine max) foram clonadas e expressas em sistema bacteriano. A proteína UreG de soja, purificada diretamente da planta e também produzida de forma recombinante em E.coli, foi caracterizada quanto a sua estrutura, capacidade de ligação a metais e atividade GTPásica, descrevendo algumas características nunca antes observadas para outras proteínas da mesma família. Também descrevemos o primeiro sucesso na obtenção da proteína acessória UreF tipo 5 selvagem na sua forma solúvel e a caracterização estrutural desta proteína foi realizada. As proteínas acessórias de soja também foram caracterizadas em relação ao seu perfil de expressão em diferentes tecidos, ao longo do desenvolvimento da planta, utilizando PCR em tempo real. Observamos uma grande variação dos níveis de expressão dos diferentes mRNAs nos tecidos avaliados. Uma possível relação entre estes níveis de expressão e a atividade ureásica de cada tecido foi investigada, visando uma melhor compreensão da dinâmica entre a expressão e atividade das proteínas responsáveis pela ativação das ureases vegetais. / The wide distribution of ureases in nature is an indication of the importance of this enzyme for the most different organisms, fact that lead researchers all over the world to dedicate their careers exclusively to the study of these enzymes. Despite of being studied for almost a century, until last year only three crystallographic structures of ureases had been solved, all from bacterial source. The urease from Canavalia ensiformis (JBU) was the first member of this family to be described, in 1926 and still, despite the restless efforts from different research groups on the structural and biological characterization of this protein, its structure was not solved until the beginning of 2010. Early trials to obtain the crystallographic structure of JBU have failed due to the poor quality crystals formed by this protein using conventional crystallization techniques. In this panorama, the first part of this work describes the use of alternative crystallization techniques, such as the use of ligands, in situ proteolisis and chemical modification of amino acid residues, for the obtention of JBU crystals with superior quality than the ones previously described in the literature, validating the use of such techniques on the crystallization of recalcitrant proteins. The crystals obtained here, despite of their superior characteristics, were not refined to the point of generating the crystallographic structure of JBU. The enzymatic activity of ureases is dependent of the presence of nickel ions precisely incorporated in their active sites. The bioassembly of these active sites, including the nickel incorporation, consist of a tightly regulated process, whose occurence depends on the participation of several chaperones (accessory proteins) that work as post-translational regulators. A great deal of effort has already been done on the study of the urease’s activation process; however its details remain unclear. To date, all work done concentrates on the study of microbial ureases, but the available information is very limited and even less information is available for the plant ureases activation process. The second part this work presents the first trials on the production and characterization of plant urease accessory proteins. The proteins UreD, UreF and UreG from soybean (Glycine max) were cloned and expressed in bacterial system. The soybean UreG protein, purified directly from the plant seeds and also produced in recombinant fashion in Escherichia coli, was characterized regarding its structure, metal biding capacity and GTPasic activity, describing a few characteristics never before observed for other proteins of the same family. It is also described the first success on the obtention of the wild type ureF accessory protein in its soluble form and a structural characterization was performed. All accessory proteins from soybean were also characterized for its expression profile in several tissues during its development utilizing real-time PCR and a correlation with the levels of urease activity were investigated. Altogether, these data improve the understanding of multiple factors involved on the urease activation process.

Orientador: Paulo Roberto Arbex Silva / Resumo: O objetivo do trabalho foi avaliar a cultura da soja semeada em diferentes densidades e profundidades das sementes, e dessa maneira saber o quanto esses fatores influenciam na emergência de plântulas, nas características agronômicas e de produtividade. O experimento foi conduzido em dois anos agrícolas, 2015/16 e 2016/17, com sementes de soja da cultivar 5D634, na Fazenda Experimental Lageado, da Faculdade de Ciências Agronômicas – UNESP/Botucatu-SP. Em cada ano, foram realizados dois experimentos, um com sete tratamentos de densidade de semeadura: 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22 sementes por metro e o outro com seis tratamentos que se referem às profundidades das sementes na mesma linha de semeadura: 0,02; 0,05 e 0,08 m do nível do solo, e combinação e alternância entre eles: 0,02 e 0,05; 0,02 e 0,08; 0,05 e 0,08 m. Os experimentos foram conduzidos em delineamento de blocos casualizados, com 4 repetições, perfazendo 28 parcelas para as densidades e 24 para as profundidades de semeadura. Para a análise estatística dos dados de densidades de sementes foi utilizada análise de regressão polinomial e para as profundidades de sementes os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) utilizando o teste de Tukey, ambos a 5% de probabilidade. Concluiu-se que falhas na densidade de semeadura são mais prejudiciais do que sementes a mais no solo. Sementes depositadas mais profundas do que o recomendado para a soja tem baixa variação na produtividade e podem ocorrer pequenas alteraçõ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to verify different densities and seeds depths in the soybean sowing, and to find what kind of influence this has on the emergence of seedlings, agronomic characteristics and productivity. The experiment was carried out in 2015/16 and 2016/17 (two experimental years), at the Faculty of Agricultural Sciences - FCA / UNESP. The treatment of the sowing density has 10, 12, 14, 16, 18, 20 and 22 seeds per meter and the other treatment was depths of seeds in the same sowing line: 0.02; 0.05 and 0.08 m from ground level, and combination and alternation between them: 0.02 and 0.05; and 0.02 0.08; 0.05 and 0.08 m, in each year was sown individually these two experiments. The experimental design was composed by randomized blocks, with 4 repetitions, totaling 28 plots for the densities and 24 for the depths of sowing. The regression analysis was used to verify the sowing density and the variance analysis model (ANOVA) followed by Tukey test was used in case of the depths of seeds, both at 5% probability. Thus, it was verified in the density sowing with seeds failure does more harm than the excess of seeds in the soil. Seeds placed deeper than the recommended for soybeans have low variation in productivity and small changes may occur in uniformity since they are next, 2 cm above or 3 cm below, without significant decrease in productivity. / Doutor

Ureases (ureia amido-hidrolases; EC 3.5.1.5) são enzimas níquel dependentes, amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas, que catalisam a hidrólise da ureia à amônia e a dióxido de carbono. Em plantas e fungos, as ureases são hexâmeros formados por subunidades idênticas. Em bactérias, as ureases são formadas por duas ou três subunidades distintas, como é o caso em Helicobacter pylori e Azospirillum brasilense, respectivamente. As bactérias do gênero Azospirillum são microrganismos diazotróficos (capazes de fixar nitrogênio atmosférico), encontrados no solo e em associação com raízes de plantas como o arroz, o trigo e o milho. A principal função da urease em plantas parece estar relacionada à reciclagem do nitrogênio, mas diversas atividades biológicas que independem da atividade ureolítica têm sido demonstradas, sugerindo que esta possa estar envolvida na defesa da planta contra insetos e fungos. A fim de estudar esta enzima, a primeira parte do trabalho objetivou obter a urease recombinante de Azospirillum brasilense FP2. Para isso, o inserto foi clonado no vetor pET-23a por recombinação homóloga in vivo. Seis aminoácidos mostraram-se diferentes, em relação a sequência de proteínas predita do A. brasilense sp245, o que parece diferença entre as cepas de A. brasilense sp245 e FP2. A expressão da enzima recombinante foi otimizada, seguida de purificação feita por cromatografia de afinidade a níquel. No segundo capítulo desse trabalho é apresentada a clonagem, a expressão do gene e a purificação de um peptídeo derivado da urease ubíqua de soja. Esse peptídeo, denominado soyuretox, é colinear com o jaburetox, uma peptídeo recombinante derivado da urease de Canavalia ensiformis. Dados prévios do nosso laboratório demonstram diversas propriedades biológicas do jaburetox, tais como atividade inseticida, capacidade de interagir com bicamadas lipídicas, efeito fungitóxico, dentre outras. Estudos comparativos com o soyuretox mostraram que esse peptídeo apresenta toxicidade para duas leveduras testadas, Candida tropicalis e Saccharomyces cerevisiae. / Urease (urea amidohydrolase, EC 3.5.1.5) are nickel-dependent enzymes widely distributed in bacteria, fungi and plants which catalyze the hydrolysis of urea to ammonia and carbon dioxide. In plants and fungi, ureases are hexamers formed by one type of subunit. In bacteria, ureases are formed by two or three distinct subunits, such as in Helicobacter pylori and in Azospirillum brasilense, respectively. Bacteria of the genus Azospirillum are diazotrophic (capable of fixing atmospheric nitrogen), found in the soil and in association with roots of plants such as rice, wheat and corn. The main function of urease in plants appears to be related to nitrogen recycling, but several biological activities that are independent of ureolytic activity have been demonstrated, suggesting that it may be involved in the defense of plants against insects and fungi. In order to study this enzyme, the first part of the study aimed to obtain the recombinant Azospirillum brasilense FP2 urease. For this end, the insert was cloned into the vector pET-23a by in vivo homologous recombination. Six amino acids were different in relation to the predicted protein sequence of A. brasilense sp245, which seems to difference among strains of A. brasilense sp245 and FP2. Expression of the recombinant protein was optimized, following purification by nickel affinity chromatography. Cloning, expression of the gene and purification of a peptide derived from soybean ubiquitous urease is presented in the second chapter of this work. This peptide, called soyuretox, aligns with jaburetox, a recombinant peptide derived from Canavalia ensiformis urease. Previous data from our laboratory have shown diverse biological properties for jaburetox, such as insecticidal activity, ability to interact with lipid bilayers, fungitoxic effects, among others. Comparative studies with soyuretox, showed that this peptide presents toxicity against yeast, Candida tropicalis and Saccharomyces cerevisiae.

A ampla distribuição das ureases na natureza é um indício da grande importância desta enzima para os mais diferentes organismos, fato que levou diversos pesquisadores ao redor do globo a dedicarem-se exclusivamente à caracterização destas enzimas. Apesar de ser uma proteína estudada ha quase um século, até o início deste trabalho apenas três ureases possuíam suas estruturas cristalográficas elucidadas e todas de origem bacteriana. A urease de Canavalia ensiformis (JBU) foi a primeira enzima desta família a ser descrita, em 1926 e ainda assim, apesar dos incansáveis esforços de diferentes grupos na caracterização estrutural e biológica desta proteína, sua estrutura cristalográfica só foi obtida no primeiro semestre de 2010. Tentativas anteriores de obtenção da estrutura cristalográfica de JBU falharam devido a baixa qualidade dos cristais formados por esta proteína através de técnicas convencionais de cristalização. Desta forma, na primeira parte deste trabalho relatamos o uso de técnicas alternativas de cristalização como o uso de ligantes ou aditivos, proteólise in situ e modificação química de resíduos de amino ácidos na obtenção de cristais de JBU com qualidade superior aos anteriormente obtidos, validando o uso destas metodologias na cristalização de proteínas recalcitrantes. Os cristais aqui obtidos, apesar de apresentarem qualidade superior aos previamente descritos na literatura, não foram otimizados ao ponto de obtenção da estrutura cristalográfica da enzima A atividade enzimática das ureases é dependente da presença de dois íons de níquel precisamente incorporados em seus sítios ativos. A biossíntese deste sítio ativo, bem como a incorporação de níquel na enzima consiste de um processo altamente regulado, cuja ocorrência depende da participação de diversas chaperonas (proteínas acessórias) agindo como reguladores pós traducionais. Apesar dos esforços já realizados, o mecanismo de ativação de ureases ainda permanece obscuro. Até hoje, os estudos concentraram-se em ureases de origem microbiana, sendo a informação disponível ainda extremamente limitada. Menos ainda é conhecido para o sistema de ativação de ureases de origem vegetal. Na segunda parte deste trabalho relatamos pioneiramente as primeiras tentativas de produção e caracterização de proteínas acessórias de origem vegetal. As proteínas UreD, UreF e UreG de soja (Glycine max) foram clonadas e expressas em sistema bacteriano. A proteína UreG de soja, purificada diretamente da planta e também produzida de forma recombinante em E.coli, foi caracterizada quanto a sua estrutura, capacidade de ligação a metais e atividade GTPásica, descrevendo algumas características nunca antes observadas para outras proteínas da mesma família. Também descrevemos o primeiro sucesso na obtenção da proteína acessória UreF tipo 5 selvagem na sua forma solúvel e a caracterização estrutural desta proteína foi realizada. As proteínas acessórias de soja também foram caracterizadas em relação ao seu perfil de expressão em diferentes tecidos, ao longo do desenvolvimento da planta, utilizando PCR em tempo real. Observamos uma grande variação dos níveis de expressão dos diferentes mRNAs nos tecidos avaliados. Uma possível relação entre estes níveis de expressão e a atividade ureásica de cada tecido foi investigada, visando uma melhor compreensão da dinâmica entre a expressão e atividade das proteínas responsáveis pela ativação das ureases vegetais. / The wide distribution of ureases in nature is an indication of the importance of this enzyme for the most different organisms, fact that lead researchers all over the world to dedicate their careers exclusively to the study of these enzymes. Despite of being studied for almost a century, until last year only three crystallographic structures of ureases had been solved, all from bacterial source. The urease from Canavalia ensiformis (JBU) was the first member of this family to be described, in 1926 and still, despite the restless efforts from different research groups on the structural and biological characterization of this protein, its structure was not solved until the beginning of 2010. Early trials to obtain the crystallographic structure of JBU have failed due to the poor quality crystals formed by this protein using conventional crystallization techniques. In this panorama, the first part of this work describes the use of alternative crystallization techniques, such as the use of ligands, in situ proteolisis and chemical modification of amino acid residues, for the obtention of JBU crystals with superior quality than the ones previously described in the literature, validating the use of such techniques on the crystallization of recalcitrant proteins. The crystals obtained here, despite of their superior characteristics, were not refined to the point of generating the crystallographic structure of JBU. The enzymatic activity of ureases is dependent of the presence of nickel ions precisely incorporated in their active sites. The bioassembly of these active sites, including the nickel incorporation, consist of a tightly regulated process, whose occurence depends on the participation of several chaperones (accessory proteins) that work as post-translational regulators. A great deal of effort has already been done on the study of the urease’s activation process; however its details remain unclear. To date, all work done concentrates on the study of microbial ureases, but the available information is very limited and even less information is available for the plant ureases activation process. The second part this work presents the first trials on the production and characterization of plant urease accessory proteins. The proteins UreD, UreF and UreG from soybean (Glycine max) were cloned and expressed in bacterial system. The soybean UreG protein, purified directly from the plant seeds and also produced in recombinant fashion in Escherichia coli, was characterized regarding its structure, metal biding capacity and GTPasic activity, describing a few characteristics never before observed for other proteins of the same family. It is also described the first success on the obtention of the wild type ureF accessory protein in its soluble form and a structural characterization was performed. All accessory proteins from soybean were also characterized for its expression profile in several tissues during its development utilizing real-time PCR and a correlation with the levels of urease activity were investigated. Altogether, these data improve the understanding of multiple factors involved on the urease activation process.

Nitrogen (N) is present in proteins, enzymes, cell structures, purines and pyrimidines in DNA and RNA molecules, photosynthetic pigments, and several other types of molecules in all living organisms. Nonetheless, even though N makes up more than 78% of the atmosphere, it is reported to be the most frequent deficient nutrient in plants. Nitrate (NO3-) and ammonium (NH4+) are the N forms absorbed by plants from soil, but legume crops can establish symbiotic relationships with rhizobia bacteria, and fix N2 from the atmosphere. In soybean, increasing yield and protein content are raising the crop's N requirement; therefore, enhanced N2 fixation is seen as a reliable path to avoid the use of N fertilizers. In this study, the objective was to perform a comprehensive screening in greenhouse and field conditions of soybean genotypes for traits related to N2 fixation. The purpose was to identify among the soybean genotypes different N2 fixation profiles at early and late stages, as well as to investigate their capacity to accumulate above-ground N and supply carry-over N to following crops. The results showed different profiles among the soybean genotypes for early and late N2 fixation capacity, both in greenhouse and field evaluations. Different traits were correlated to either early or late N2 fixation activity. Soybean and winter-rye shoot dry mass were evaluated in the field to assess above-ground N accumulation and carry-over N, respectively. Soybean genotypes were identified with specific capacities to accumulate N in above-ground biomass or supply N to winter-rye. The patterns of N2 fixation identified in this study, as well as the different abilities to accumulate N above-ground or supply N to following crops, could assist in the selection of superior lines with improved N2 fixation capacity.

LSD (Lesion Simulating Disease) é uma família de proteínas dedo de zinco descritas como importantes na resposta hipersensitiva (HR – hipersensitive response), limitando a área da lesão e a morte celular programada (PCD – programmed cell death), regulando negativamente as espécies reativas de oxigênio (ROS – reative oxygen species) geradas em condições de estresse biótico e abiótico. Até o presente momento, a maioria dos estudos incluindo genes LSD foi realizada em Arabidopsis thaliana, havendo poucos relatos em outros organismos. Além disto, a identificação completa dos genes LSD não foi ainda descrita, o que dificulta a reconstrução da história evolutiva desta família. Assim, os objetivos deste estudo foram identificar sequências de genes LSD em diferentes genomas, realizar a análise filogenética dessa família e avaliar o perfil de expressão de genes GmLSD em diferentes órgãos de soja e sob condições de estresse. Nossos resultados permitiram a identificação de 117 possíveis genes LSD exclusivamente em Viridiplantae. Os organismos basais Volvox carteri e Chamydomonas reinhardtii apresentaram uma cópia de genes LSD. Além disso, a expansão do número de cópias gênicas parece ter ocorrido no clado Embriófita. As sequências identificadas foram analisadas quanto à presença do domínio dedo de zinco característico, sendo encontradas proteínas com uma, duas e três cópias de domínios LSD. Foi observada uma ampla conservação das três sequências de domínios LSD, indicando a manutenção destas ao longo da evolução da família. A análise filogenética mostrou que a arquitetura de proteínas com três domínios LSD representa a condição mais ancestral, sendo presente desde os organismos basais. As proteínas com dois domínios LSD foram identificadas somente no clado Embriófita e proteínas que possuem um domínio LSD foram altamente representadas no clado gramíneas. Os genes de monocotiledôneas e dicotiledôneas não formaram grupos separados, indicando que a expansão da família LSD foi anterior à diversificação entre esses clados. A análise de expressão dos genes GmLSD em diferentes órgãos de soja mostrou que estes tem expressão variável dependente do órgão. Foi avaliada a expressão dos genes GmLSD em resposta a Phakopsora pachyrhizi, o agente causador da ferrugem asiática da soja (ASR – Asian Soybean Rust). A abordagem de RNA-seq (no qual foi analisada somente a região da lesão) permitiu a identificação de GmLSD1, GmLSD3 e GmLSD4 nos genótipos suscetível (EMBRAPA48) e resistente (PI561356), enquanto que GmLSD6 e GmLSD8 foram detectados somente no genótipo resistente PI561356. Por outro lado, o experimento de RT-qPCR (em que foram analisadas folhas de soja infectadas por P. pachyrhizi) revelou que todos os genes GmLSD foram responsivos a inoculação do fungo, embora GmLSD1, GmLSD4 e GmLSD8 tenham sido modulados exclusivamente no genótipo resistente PI561356. A análise do perfil de expressão dos genes GmLSD em raízes e folhas de plantas de soja em condições de déficit hídrico mostrou que a maioria dos genes GmLSD foi modulada em resposta ao estresse. No entanto os genes GmLSD5 (folhas), GmLSD1 e GmLSD2 (raízes) foram diferencialmente expressos somente na cultivar tolerante EMBRAPA48. Esses resultados sugerem um possível envolvimento dos genes GmLSD na PCD causada por estresses bióticos e abióticos, assim como observado em Arabidopsis thaliana. Análises futuras com os genes GmLSD são particularmente interessantes para avaliar o potencial biotecnológico destes genes, sobretudo visando o desenvolvimento de plantas de soja mais tolerantes/resistentes à diferentes condições de estresse. / LSD (Lesion Simulating Disease) is a family of zinc finger proteins described as important in the hypersensitive response (HR), limiting the area of injury and the programmed cell death (PCD), negatively regulating the Reactive oxygen species (ROS) generated under biotic and abiotic stress conditions. To date, most studies including LSD genes were performed in Arabidopsis thaliana, with few reports in other organisms. Moreover, the complete identification of LSD genes has not yet been described, which difficult the reconstruction of the evolutionary history of this family. The goals of this study were to identify LSD gene sequences in different genomes, perform a phylogenetic analysis of this family and evaluate the expression profile of GmLSD genes in different soybean organs and under stress conditions. Our results allowed the identification of 117 putative LSD genes exclusively in Viridiplantae. Volvox carteri and Chamydomonas reinhardtii basal organisms showed one copy of LSD gene. Furthermore, the expansion of the number of genes copies seems to be occurred in Embryophyte clad. The identified sequences were analyzed for the presence of the characteristic zinc finger domain, being found proteins with one, two and three copies of LSD domains. We observed a wide conservation of the three sequences of LSD domains, indicating their maintenance throughout the evolution of the family. Phylogenetic analysis showed that the architecture of proteins with three LSD domains is the most ancestral condition, being present since the basal organisms. Proteins with two LSD domains have been identified only in Embryophyte clad and proteins having one LSD domain were highly represented in the Grass clad. The monocots and dicots genes not formed separate groups, indicating that the expansion of the LSD family was prior to diversification between these clades. The expression analysis of GmLSD genes in different soybean organs showed that these having an organ dependent variable expression. We evaluated the expression of GmLSD genes in response to Phakopsora pachyrhizi, the Asian Soybean Rust (ASR) causal agent. The RNA-seq approach (wherein only the lesion site was analyzed) allowed the identification of GmLSD1, and GmLSD3 GmLSD4 in both susceptible (EMBRAPA48) and resistant (PI561356) genotypes, while GmLSD6 and GmLSD8 were detected only in PI561356 resistant genotype. Moreover, the RT-qPCR experiment (in which soybean leaves infected by P. pachyrhizi were analyzed) showed that all GmLSD were responsive to fungus inoculation, although GmLSD1, GmLSD4 and GmLSD8 were differentially expressed only in PI561356 resistant genotype. The analysis of GmLSD genes expression profile in roots and leaves of soybean plants under water deficit conditions showed that the majority GmLSD genes were modulated in response to stress. However, GmLSD5 (leaves), and GmLSD1 GmLSD2 (roots) genes were differentially expressed only in EMBRAPA48 tolerant cultivar. These results suggest a putative involvement of GmLSD genes in the PCD caused by biotic and abiotic stresses, as observed in Arabidopsis thaliana. Further analyzes with GmLSD genes are particularly interesting to evaluate the biotechnological potential of these genes, especially for the development of soybean plants more tolerant / resistant to various stress conditions.

O principal mecanismo de defesa das plantas frente a uma infecção viral é baseado no fenômeno chamado interferência por RNA (RNAi). Por meio da ação coordenada de proteínas como Argonautas, Dicers, RNA polimerases dependentes de RNA e proteínas de ligação a RNA de dupla fita (DRBs), o RNA viral é reconhecido e clivado a pequenos RNAs de interferência derivados de vírus (vsiRNAs). Os vsiRNAs, acoplados ao complexo proteíco de indução ao silenciamento, atuam sobre sequências de RNA ou DNA virais, podendo promover a clivagem, inibição da tradução ou metilação de seus alvos (para vírus de DNA). Neste trabalho foram realizados dois estudos que abordam mecanismos de defesa baseados em RNAi em plantas. No primeiro capítulo é descrito a integração do RNA1 do Cumcumber mosaic virus (CMV) no genoma de Glycine max. Através da análise de bibliotecas de sequenciamento de alta eficiência de RNA mensageiros (mRNAs), pequenos RNAs e DNAs de diferentes cultivares e diferentes tecidos de soja foi possível identificar que o evento de integração envolveu duas moléculas do RNA1 do CMV, o RNA de um retrotransposon e um mRNA de um gene endógeno. No locus aonde ocorreu esta integração as duas sequências do RNA1 estão em sentidos opostos. Os pequenos RNAs (sRNAs) das nossas bibliotecas alinham majoritariamente na região do RNA1 do CMV e são praticamente ausentes nas outras regiões da sequência integrada, sugerindo fortemente a formação de um grampo aonde hibridizam ambas as sequências do CMV. A presença desses sRNAs derivados do CMV em todos os tecidos estudados sugere uma provável função antiviral dessa sequencia que foi integrada em soja. No segundo capítulo, por microscopia confocal, foi estudada a interação entre as proteínas DRBs e o Potato virus X (PVX) durante a infecção viral em Nicotiana benthamiana. É demonstrado que as DRBs 2, 3 e 5 se realocam de sua posição original e se concentram em estruturas chamadas complexos de replicação viral durante a infecção por PVX. Esse fenômeno é um indicativo que essas proteínas podem estar atuando nos primeiros estágios de defesa da planta frente ao vírus. / The main defense mechanism of plants facing a viral infection is based on the phenomenon called RNA interference (RNAi). Through the coordinated action of proteins such as Argonaut, Dicers, RNA dependent RNA polymerases and double-stranded RNAbinding proteins (DRBs), the viral RNA is recognized and cleaved to virus-derived interfering small RNAs (vsiRNAs). The vsiRNAs, coupled to a protein complex that induce the silencing, act on DNA or RNA viral sequences promoting cleavage, translational inhibition or methylation of their targets (for DNA viruses). This work described two studies that address new defense mechanisms based on RNAi in plants. In the first chapter of this thesis is described the integration of the cucumber mosaic virus (CMV) RNA1 in the genome of Glycine max. Through the analysis of deep sequencing libraries of messenger RNA, small RNAs and DNA from different cultivars and different soybean tissues it was possible to identified that the integration event involved two molecules of CMV RNA1, the RNA of a retrotransposon and the mRNA of an endogenous gene. In the locus where the integration occurred the two RNA1 sequences are in opposite directions. Small RNAs (sRNAs) from our libraries mostly aligned in the region of CMV RNA1 and are practically absent in other regions of the integrated sequence, strongly suggesting the formation of a hairpin where both CMV sequences hybridize. The presence of these CMV-derived sRNAs in all surveyed tissues suggests a probable antiviral function for the sequence that was integrated into soybeans. In the second chapter, the interaction between the DRB proteins and the Potato virus X (PVX) during viral infection in Nicotiana benthamiana is assessed by confocal microscopy. It is shown that the DRBs 2, 3 and 5 relocate from its original position and concentrated in structures called viral replication complexes during infection by PVX. This is an indication that these proteins can act in the early stages of plant defense against the virus.

Submitted by PATRÍCIA PEREIRA DIAS null (patypdias.89@gmail.com) on 2017-05-18T19:14:22Z No. of bitstreams: 1 TESE - Patrícia P. Dias.pdf: 2042404 bytes, checksum: 9b90623364bec5cfc2e9ba09e452f83d (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-05-19T13:28:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dias_pp_dr_bot.pdf: 2042404 bytes, checksum: 9b90623364bec5cfc2e9ba09e452f83d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-19T13:28:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dias_pp_dr_bot.pdf: 2042404 bytes, checksum: 9b90623364bec5cfc2e9ba09e452f83d (MD5) Previous issue date: 2017-03-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo do trabalho foi avaliar a cultura da soja semeada em diferentes densidades e profundidades das sementes, e dessa maneira saber o quanto esses fatores influenciam na emergência de plântulas, nas características agronômicas e de produtividade. O experimento foi conduzido em dois anos agrícolas, 2015/16 e 2016/17, com sementes de soja da cultivar 5D634, na Fazenda Experimental Lageado, da Faculdade de Ciências Agronômicas – UNESP/Botucatu-SP. Em cada ano, foram realizados dois experimentos, um com sete tratamentos de densidade de semeadura: 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22 sementes por metro e o outro com seis tratamentos que se referem às profundidades das sementes na mesma linha de semeadura: 0,02; 0,05 e 0,08 m do nível do solo, e combinação e alternância entre eles: 0,02 e 0,05; 0,02 e 0,08; 0,05 e 0,08 m. Os experimentos foram conduzidos em delineamento de blocos casualizados, com 4 repetições, perfazendo 28 parcelas para as densidades e 24 para as profundidades de semeadura. Para a análise estatística dos dados de densidades de sementes foi utilizada análise de regressão polinomial e para as profundidades de sementes os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) utilizando o teste de Tukey, ambos a 5% de probabilidade. Concluiu-se que falhas na densidade de semeadura são mais prejudiciais do que sementes a mais no solo. Sementes depositadas mais profundas do que o recomendado para a soja tem baixa variação na produtividade e podem ocorrer pequenas alterações na uniformidade desde que se encontrem próximas, 2 cm acima ou 3 cm abaixo, sem diminuição significativa na produtividade. / The aim of this study was to verify different densities and seeds depths in the soybean sowing, and to find what kind of influence this has on the emergence of seedlings, agronomic characteristics and productivity. The experiment was carried out in 2015/16 and 2016/17 (two experimental years), at the Faculty of Agricultural Sciences - FCA / UNESP. The treatment of the sowing density has 10, 12, 14, 16, 18, 20 and 22 seeds per meter and the other treatment was depths of seeds in the same sowing line: 0.02; 0.05 and 0.08 m from ground level, and combination and alternation between them: 0.02 and 0.05; and 0.02 0.08; 0.05 and 0.08 m, in each year was sown individually these two experiments. The experimental design was composed by randomized blocks, with 4 repetitions, totaling 28 plots for the densities and 24 for the depths of sowing. The regression analysis was used to verify the sowing density and the variance analysis model (ANOVA) followed by Tukey test was used in case of the depths of seeds, both at 5% probability. Thus, it was verified in the density sowing with seeds failure does more harm than the excess of seeds in the soil. Seeds placed deeper than the recommended for soybeans have low variation in productivity and small changes may occur in uniformity since they are next, 2 cm above or 3 cm below, without significant decrease in productivity.

O principal mecanismo de defesa das plantas frente a uma infecção viral é baseado no fenômeno chamado interferência por RNA (RNAi). Por meio da ação coordenada de proteínas como Argonautas, Dicers, RNA polimerases dependentes de RNA e proteínas de ligação a RNA de dupla fita (DRBs), o RNA viral é reconhecido e clivado a pequenos RNAs de interferência derivados de vírus (vsiRNAs). Os vsiRNAs, acoplados ao complexo proteíco de indução ao silenciamento, atuam sobre sequências de RNA ou DNA virais, podendo promover a clivagem, inibição da tradução ou metilação de seus alvos (para vírus de DNA). Neste trabalho foram realizados dois estudos que abordam mecanismos de defesa baseados em RNAi em plantas. No primeiro capítulo é descrito a integração do RNA1 do Cumcumber mosaic virus (CMV) no genoma de Glycine max. Através da análise de bibliotecas de sequenciamento de alta eficiência de RNA mensageiros (mRNAs), pequenos RNAs e DNAs de diferentes cultivares e diferentes tecidos de soja foi possível identificar que o evento de integração envolveu duas moléculas do RNA1 do CMV, o RNA de um retrotransposon e um mRNA de um gene endógeno. No locus aonde ocorreu esta integração as duas sequências do RNA1 estão em sentidos opostos. Os pequenos RNAs (sRNAs) das nossas bibliotecas alinham majoritariamente na região do RNA1 do CMV e são praticamente ausentes nas outras regiões da sequência integrada, sugerindo fortemente a formação de um grampo aonde hibridizam ambas as sequências do CMV. A presença desses sRNAs derivados do CMV em todos os tecidos estudados sugere uma provável função antiviral dessa sequencia que foi integrada em soja. No segundo capítulo, por microscopia confocal, foi estudada a interação entre as proteínas DRBs e o Potato virus X (PVX) durante a infecção viral em Nicotiana benthamiana. É demonstrado que as DRBs 2, 3 e 5 se realocam de sua posição original e se concentram em estruturas chamadas complexos de replicação viral durante a infecção por PVX. Esse fenômeno é um indicativo que essas proteínas podem estar atuando nos primeiros estágios de defesa da planta frente ao vírus. / The main defense mechanism of plants facing a viral infection is based on the phenomenon called RNA interference (RNAi). Through the coordinated action of proteins such as Argonaut, Dicers, RNA dependent RNA polymerases and double-stranded RNAbinding proteins (DRBs), the viral RNA is recognized and cleaved to virus-derived interfering small RNAs (vsiRNAs). The vsiRNAs, coupled to a protein complex that induce the silencing, act on DNA or RNA viral sequences promoting cleavage, translational inhibition or methylation of their targets (for DNA viruses). This work described two studies that address new defense mechanisms based on RNAi in plants. In the first chapter of this thesis is described the integration of the cucumber mosaic virus (CMV) RNA1 in the genome of Glycine max. Through the analysis of deep sequencing libraries of messenger RNA, small RNAs and DNA from different cultivars and different soybean tissues it was possible to identified that the integration event involved two molecules of CMV RNA1, the RNA of a retrotransposon and the mRNA of an endogenous gene. In the locus where the integration occurred the two RNA1 sequences are in opposite directions. Small RNAs (sRNAs) from our libraries mostly aligned in the region of CMV RNA1 and are practically absent in other regions of the integrated sequence, strongly suggesting the formation of a hairpin where both CMV sequences hybridize. The presence of these CMV-derived sRNAs in all surveyed tissues suggests a probable antiviral function for the sequence that was integrated into soybeans. In the second chapter, the interaction between the DRB proteins and the Potato virus X (PVX) during viral infection in Nicotiana benthamiana is assessed by confocal microscopy. It is shown that the DRBs 2, 3 and 5 relocate from its original position and concentrated in structures called viral replication complexes during infection by PVX. This is an indication that these proteins can act in the early stages of plant defense against the virus.

A ampla distribuição das ureases na natureza é um indício da grande importância desta enzima para os mais diferentes organismos, fato que levou diversos pesquisadores ao redor do globo a dedicarem-se exclusivamente à caracterização destas enzimas. Apesar de ser uma proteína estudada ha quase um século, até o início deste trabalho apenas três ureases possuíam suas estruturas cristalográficas elucidadas e todas de origem bacteriana. A urease de Canavalia ensiformis (JBU) foi a primeira enzima desta família a ser descrita, em 1926 e ainda assim, apesar dos incansáveis esforços de diferentes grupos na caracterização estrutural e biológica desta proteína, sua estrutura cristalográfica só foi obtida no primeiro semestre de 2010. Tentativas anteriores de obtenção da estrutura cristalográfica de JBU falharam devido a baixa qualidade dos cristais formados por esta proteína através de técnicas convencionais de cristalização. Desta forma, na primeira parte deste trabalho relatamos o uso de técnicas alternativas de cristalização como o uso de ligantes ou aditivos, proteólise in situ e modificação química de resíduos de amino ácidos na obtenção de cristais de JBU com qualidade superior aos anteriormente obtidos, validando o uso destas metodologias na cristalização de proteínas recalcitrantes. Os cristais aqui obtidos, apesar de apresentarem qualidade superior aos previamente descritos na literatura, não foram otimizados ao ponto de obtenção da estrutura cristalográfica da enzima A atividade enzimática das ureases é dependente da presença de dois íons de níquel precisamente incorporados em seus sítios ativos. A biossíntese deste sítio ativo, bem como a incorporação de níquel na enzima consiste de um processo altamente regulado, cuja ocorrência depende da participação de diversas chaperonas (proteínas acessórias) agindo como reguladores pós traducionais. Apesar dos esforços já realizados, o mecanismo de ativação de ureases ainda permanece obscuro. Até hoje, os estudos concentraram-se em ureases de origem microbiana, sendo a informação disponível ainda extremamente limitada. Menos ainda é conhecido para o sistema de ativação de ureases de origem vegetal. Na segunda parte deste trabalho relatamos pioneiramente as primeiras tentativas de produção e caracterização de proteínas acessórias de origem vegetal. As proteínas UreD, UreF e UreG de soja (Glycine max) foram clonadas e expressas em sistema bacteriano. A proteína UreG de soja, purificada diretamente da planta e também produzida de forma recombinante em E.coli, foi caracterizada quanto a sua estrutura, capacidade de ligação a metais e atividade GTPásica, descrevendo algumas características nunca antes observadas para outras proteínas da mesma família. Também descrevemos o primeiro sucesso na obtenção da proteína acessória UreF tipo 5 selvagem na sua forma solúvel e a caracterização estrutural desta proteína foi realizada. As proteínas acessórias de soja também foram caracterizadas em relação ao seu perfil de expressão em diferentes tecidos, ao longo do desenvolvimento da planta, utilizando PCR em tempo real. Observamos uma grande variação dos níveis de expressão dos diferentes mRNAs nos tecidos avaliados. Uma possível relação entre estes níveis de expressão e a atividade ureásica de cada tecido foi investigada, visando uma melhor compreensão da dinâmica entre a expressão e atividade das proteínas responsáveis pela ativação das ureases vegetais. / The wide distribution of ureases in nature is an indication of the importance of this enzyme for the most different organisms, fact that lead researchers all over the world to dedicate their careers exclusively to the study of these enzymes. Despite of being studied for almost a century, until last year only three crystallographic structures of ureases had been solved, all from bacterial source. The urease from Canavalia ensiformis (JBU) was the first member of this family to be described, in 1926 and still, despite the restless efforts from different research groups on the structural and biological characterization of this protein, its structure was not solved until the beginning of 2010. Early trials to obtain the crystallographic structure of JBU have failed due to the poor quality crystals formed by this protein using conventional crystallization techniques. In this panorama, the first part of this work describes the use of alternative crystallization techniques, such as the use of ligands, in situ proteolisis and chemical modification of amino acid residues, for the obtention of JBU crystals with superior quality than the ones previously described in the literature, validating the use of such techniques on the crystallization of recalcitrant proteins. The crystals obtained here, despite of their superior characteristics, were not refined to the point of generating the crystallographic structure of JBU. The enzymatic activity of ureases is dependent of the presence of nickel ions precisely incorporated in their active sites. The bioassembly of these active sites, including the nickel incorporation, consist of a tightly regulated process, whose occurence depends on the participation of several chaperones (accessory proteins) that work as post-translational regulators. A great deal of effort has already been done on the study of the urease’s activation process; however its details remain unclear. To date, all work done concentrates on the study of microbial ureases, but the available information is very limited and even less information is available for the plant ureases activation process. The second part this work presents the first trials on the production and characterization of plant urease accessory proteins. The proteins UreD, UreF and UreG from soybean (Glycine max) were cloned and expressed in bacterial system. The soybean UreG protein, purified directly from the plant seeds and also produced in recombinant fashion in Escherichia coli, was characterized regarding its structure, metal biding capacity and GTPasic activity, describing a few characteristics never before observed for other proteins of the same family. It is also described the first success on the obtention of the wild type ureF accessory protein in its soluble form and a structural characterization was performed. All accessory proteins from soybean were also characterized for its expression profile in several tissues during its development utilizing real-time PCR and a correlation with the levels of urease activity were investigated. Altogether, these data improve the understanding of multiple factors involved on the urease activation process.