La voie de signalisation Notch est une voie de signalisation conservée et primordiale aussi bien pour le développement des métazoaires que la maintenance de leurs tissus adultes. L'ubiquitine ligase Mind bomb1 (Mib1) est nécessaire à l'activation du récepteur Notch et contrôle l'ubiquitination et l'endocytose des ligands DLS (Delta/Serrate/Lag-2) de Notch. Afin d'identifier de nouveaux régulateurs de la signalisation des ligands DSL chez la drosophile, j'ai réalisé un crible modificateur sur un phénotype d'aile induit par des pertes partielles d'activité mib1. Une collection de lignées GS (Gene Search), permettant l'expression ectopique des gènes adjacents à leur point d'insertion, a permis d'identifier deux interacteurs génétiques de mib1 : α4GT1 et Hsc70-4. Hsc70-4 est un régulateur de la dynamique du manteau de clathrin dont la fonction dans la signalisation Notch et l'endocytose des ligands DSL n'a pas encore été analysée. α4GT1 est une α1,4- Nacétylgalactosaminyltranferase impliquée dans la voie de biosynthèse des glycosphingolipides (GSLs). L'obtention d'allèles mutants de cette enzyme a révélé qu'elle n'était pas essentielle à la signalisation Notch. En revanche, sa surexpression restaure le trafic des ligands DSL dans des contextes de pertes partielles d'activité ubiquitine ligase. Des analyses génétiques et biochimiques ont permis de montrer que cette fonction d'α4GT1 dans la signalisation Notch nécessite la synthèse d'un glycosphingolipide (GSL) particulier, N5, produit par α4GT1. L'identification d'un motif conservé d'interaction avec les GSLs dans le domaine Nterminal de Delta et Serrate suggère une interaction directe entre ces ligands et les GSLs.

Contexte : Les désordres congénitaux de la glycosylation (CDGs) sont des maladies rares dues à des mutations dans des gènes codant pour des protéines de la biosynthèse des glycoconjugués. Les CDGs présentent avec des glycoprotéines sériques hypoglycosylées avec un spectre clinique large. Le diagnostic moléculaire des CDG est important dans le cadre du diagnostic prénatal et du développement de stratégies thérapeutiques. Objectif : Déterminer les mutations causales dans une cohorte de cas suspects de CDG. Deux cas ont fait l’objet d’explorations biochimiques afin de comprendre les conséquences des mutations et d’envisager des stratégies thérapeutiques. Sujets/méthodes : Des explorations biochimiques sur des fibroblastes cutanés d’une cohorte de patients présentant des signes cliniques suggérant un CDG et hypglycosylation des protéines sérique. Résultats et conclusions: Le premier patient présentait une maladie multisystémique sévère. Des mutations affectant le gène codant pour la dehydrodolichol diphosphate synthase (DHDDS) ont été trouvées. Une activité diminuée la DHDDS était accompagnée de la diminution du dolichol phosphate. Ce patient est le premier cas de DHDDS-CDG présentant une atteinte multi-viscérale. Dans une deuxième étude deux siblings présentaient une thrombopénie associée à des atteintes neurologiques. Une mutation bi-allélique dans le gène codant pour le transporteur golgien du CMP-acide sialique (SLC35A1) associé avec une hypoglycosylation des protéines sériques a été détectée. Des profils anormaux des glycosphingolipides ont été mis en évidence et supplémentation des cellules de patient par de l’acide sialique a augmenté la biosynthèse des gangliosides. / Background: Congenital disorders of glycosylation (CDGs) are rare inherited diseases caused by mutations in genes required for glycoconjugate biosynthesis. CDG clinical presentations range from monosystemic to multiorgan failure. Often these diseases are diagnosed biochemically by the presence of hypoglycosylated serum proteins. Molecular diagnosis of CDG is crucial for both antenatal diagnostics and development of treatment strategies. Aims: To determine the molecular origins of disease in suspected CDG patients. Two cases were chosen for more extended biochemical explorations in order to investigate the consequences of the mutations and possible treatment strategies. Subjects/Methods: Biochemical explorations of skin biopsy fibroblasts from a cohort of patients presenting with signs suggestive of CDG, and serum protein hypoglycosylation. Results and conclusions: In the first study, a patient presented with multisystemic disease suggesting CDG. Fibroblasts revealed both truncated dolichol-linked oligosaccharides and polymannose-type N-glycans. Mutations in the dehydrodolichol diphosphate synthase (DHDDS) gene were found as well as low DHDDS activity and dolichol phosphate levels. As previous cases of DHDDS-CDG present with retinitis pigmentosa only, we describe the first case of a CDG syndrome associated with mutations in DHDDS. In the second study, two siblings presented with thrombocytopenia and CNS signs. A biallelic mutation in the CMP-sialic acid transporter gene (SLC35A1) was associated with hyposialylated serum glycoproteins. Altered glycosphingolipid profiles were seen and sialic acid supplementation of patient cells increased the appearance of gangliosides

L'interaction des glycosphingolipides de la membrane plasmique avec les protéines de liaison aux glucides (lectines) est d'une importance vitale pour l'infection de la cellule hôte par divers virus et bactéries. Dans ce travail, nous avons exploré l’interaction des lectines LecA de la bactérie P. aeruginosa et de la sous-unité B de la toxine Shiga (StxB) de S. dysenteriae avec son récepteur à membrane plasmatique, le globotriaosylcéramide (Gb3). De plus, nous avons étudié l'interaction de la bactérie complète P. aeruginosa avec Gb3. Afin de déchiffrer l'interaction lectine-Gb3 en l'absence d'autres composants cellulaires, nous avons utilisé les systèmes de membrane artificielle - vésicules unilamellaires géantes (GUV) et bicouches lipidiques supportées (SLB). Nous avons observé la liaison de la lectine en utilisant différents modes de microscopie à fluorescence (confocal, TIRF, etc.). Nous examinons la liaison des deux lectines aux domaines membranaires de différents ordres et compositions. Nous avons constaté que StxB préfère des domaines membranaires plus ordonnés alors que LecA est moins préférentiel. De plus, les deux lectines induisent la réorganisation des domaines membranaires: StxB stabilise les domaines ordonnés, les réduit et induit la formation des nouveaux domaines ordonnés. D'autre part, LecA ainsi que la bactérie P. aeruginosa induisent la dissolution des domaines ordonnés. Nous pensons que ces processus de réorganisation membranaire sont cruciaux pour l’infection bactérienne. / The interaction of plasma membrane glycosphingolipids with the carbohydrate binding proteins (lectins) is of vital importance for the infection of the host cell by various viruses and bacteria. In this work, we explored the interaction of the lectins LecA from the bacterium P. aeruginosa and B subunit of Shiga toxin (StxB) from S. dysenteriae with its plasma membrane receptor globotriaosylceramide (Gb3). Moreover, we studied the interaction of the complete bacterium P. aeruginosa with Gb3. In order to decipher the lectin-Gb3 interaction in absence of other cellular components we employed the artificial membrane systems – Giant unilamellar vesicles (GUVs) and Supported lipid bilayers (SLBs). We observed the lectin binding using different modes of fluorescence microscopy (confocal, TIRF, etc…). We examine the binding of both lectins to the membrane domains of different ordere and composition. We found that StxB prefers more ordered membrane domains whereas LecA is less preferential. Moreover, both lectins induce the reorganization of the membrane domains: StxB stabilizes ordered domains, shrinks them and induces the formation of the novel ordered domains. On the other hand LecA, as well as the bacterium P. aeruginosa induce the dissolution of the ordered domains. We believe, these membrane reorganization processes are crucial for the bacterial infection.

Les voies d’endocytose qui régissent l’internalisation d’éléments extracellulaires peuvent être classées selon que la protéine de manteau, la clathrine, est impliquée ou non dans le processus. Les voies indépendantes de la clathrine sont utilisées par de nombreuses toxines, des virus et des protéines endogènes. Les mécanismes permettant d’induire le recrutement des protéines cargoes et la déformation de la membrane plasmique dans le contexte de l'endocytose clathrine-indépendant restent encore mal compris. Cette étude montre que la galectine 3, une protéine humaine qui se lie aux glucides, induit la formation d’invaginations de la membrane plasmique de manière indépendante de la clathrine. Les glycosphingolipides (molécules jouant un rôle majeur dans la physiologie de la cellule) sont essentielles pour permettre à la galectine 3 d’induire ces invaginations et d’être internalisée dans la cellule. Les structures tubulaires induites par la galectine 3 présentent une morphologie étonnamment similaire à celle de compartiments intermédiaires de transport décrits dans la littérature pour l’endocytose indépendante de la clathrine. Des cargos utilisant la voie indépendante de la clathrine, tels que CD44 et les intégrines α5 et β1, sont retrouvés dans les tubules induits par la galectine 3. De plus, cette dernière est nécessaire à l’internalisation de CD44. Cela indique donc que la galectine 3 pourrait relier des protéines cargos glycosylés à des glycosphyngolipides de la membrane plasmique et ainsi induire une déformation de la membrane et leur internalisation dans les cellules. Ce mécanisme diffère de celui utilisé par la toxine pentamérique de Shiga et par la toxine cholérique, qui sont leur protéines cargos propores et interagissant directement avec le glycosphyngolipide leur servant de récepteur. Les tubules induits par la galectine 3 sont distincts de ceux induit par les autres lectines. Celles-ci présentent des spécificités différentes de liaison aux glucides, montrant ainsi la l'importance des interactions entre les lectines et les sucres dans ce processus. De plus, nous avons constaté que la galectine 3 module l’équilibre à l’état basal de l’intégrine β1 à la surface de la cellule. Cette protéine étant capitale pour les phénomènes d’adhésion et de migration cellulaires, nous avons donc exploré le rôle conjoint de la galectine 3 et des glycosphingolipides dans la migration cellulaire. La galectine 3 inhibe la migration des cellules humaines de carcinomes mammaires alors qu’elle stimule au contraire celle de cellules de tumeurs mammaires murines. Or, nous avons montré que la régulation par la galactine 3 de la migration de différentes lignées cellulaires est dépendante des glycosphingolipides. Il ressort donc de cette étude que la galectine 3 et les glycosphingolipides contribuent de manière synergique au processus d’induction de déformation de la membrane, à l’endocytose de protéines cargos et à la migration cellulaire. / Endocytic processes which govern the uptake of extracellular material into the cell can be classified based on their dependence on the coat protein, clathrin. Clathrin-independent mechanisms are used by many toxins, viruses and endogenous proteins. How cargo is recruited and membranes are bent is not well understood in these cases. Here, we discovered that galectin 3, a human carbohydrate binding protein induced the clathrin-independent formation of endocytic plasma membrane invaginations. Glycosphingolipids, which have established functions in key physiological processes, were found to be essential for the formation of galectin 3-induced invaginations and for the efficient uptake of the protein into the cell. Galectin 3-induced tubular structures were found to have a strikingly similar morphology to that of the clathrin-independent carriers described in literature. Clathrin-independent endocytic cargoes such as CD44, α5 and β1 integrin were present in galectin 3-induced tubules, and galectin activity and glycosphingolipids were required for the uptake of CD44. This indicated that galectin 3 could link glycosylated cargoes with glycosphingolipids for cargo recruitment and membrane bending. In contrast, the pentameric Shiga and cholera toxins are their own cargoes and drive membrane deformations by directly binding to their respective glycosphingolipid receptors. Galectin 3-induced tubules were distinct from those induced by lectins with different carbohydrate binding specificities, which revealed the importance of lectin-glycan interaction in this process. Further, we observed that galectin 3 modulated the steady state surface dynamics of β1 integrin, a protein which like CD44 is critical for cell adhesion and migration. Subsequently, we explored the interplay of galectins and glycosphingolipids in cell migration. Galectin 3 inhibited cell migration in human breast carcinoma cells, and stimulated migration in a mouse mammary tumor cell line. However, the regulation of migration by galectin 3 was in both cases found to be dependent on glycosphingolipids. In conclusion, galectin 3 and glycosphingolipids synergistically contribute to the clathrin-independent curvature generation process, cargo endocytosis and cell migration.

La toxine bactérienne de Shiga se lie au glycosphingolipide (GSL) globotriaosylcéramide (Gb3) afin d’entrer par endocytose dans les cellules en utilisant une voie dépendante et indépendante de la clathrine. Dans la voie indépendante de la clathrine, la toxine de Shiga réorganise les lipides de la membrane de façon à imposer une contrainte mécanique sur la bicouche, conduisant ainsi à la formation de pic d’invagination d'endocytose profonds et étroits. Mécaniquement ce phénomène n’est pas encore compris, notamment il reste énigmatique, comment se traduisent les propriétés géométriques de l’agrégation des glycosphingolipides GSLS et de la toxine. Dans mon travail de thèse, via l’utilisation de la sous-unité B de la toxine de Shiga (STxB) comme un modèle, différentes espèces moléculaires de son récepteur Gb3 ont été synthétisés avec des structures délibérément choisis. Les études réalisées par imagerie de haute résolution et par la modélisation informatique ont permis d’élucider les contraintes mécano-chimique sous-jacente conduisant à une réorganisation efficace qui a pour résultat l’agrégation de la toxine et la réorganisation des lipides. En combinant des expériences de simulation sur ordinateur de dynamique des particules dissipatives (DPD) et des expériences sur des modèles de membranes cellulaires, nous avons fourni la preuve de l’induction d’une force de fluctuation-membrane, de type « force de Casimir », conduisant à l'agrégation des molécules de toxines associées à la membrane à des échelles de longueur mésoscoiques. Nous avons observé et mesuré, en outre la condensation lipidique induite par la toxine, quantitativement sur des monocouches de Langmuir en utilisant la réflectivité des rayons X (XR) et par la mesure de la diffraction des rayons X par incidence rasante (GIXD), fournissant ainsi une preuve directe de l'hypothèse que la toxine a le potentiel de réduire de façon asymétrique la surface moléculaire sur la partie membranaire exoplasmique, ce qui conduit à une déformation locale de la membrane. Durant ma thèse, nos efforts ont été consacrés à la réalisation de nouveaux glycosphinolipides (GSL) comme outils chimiques à visée biologique. Par ailleurs, une nouvelle stratégie de reconstitution de GSL fonctionnels sur la membrane cellulaire, basée sur une réaction de ligation de type « click » entre un glycosyl-cyclooctyne et un azido-sphingosine a été étudiée. Les résultats obtenus sur les cellules se sont avérés beaucoup moins efficace que ceux in vitro. Une poursuite de l'optimisation de cette méthodologie est actuellement en cours. Une sonde fluorescente du glycosphinolipide Gb3, marquée à l’Alexa Fluor 568 lui-même lié par l'intermédiaire d'un bras PEG-α à la position de la chaîne acyle, a été synthétisée. Cette sonde se lie à la STxB sur couche mince de TLC, mais pas sur des membranes modèles. D'autres améliorations sont discutées. / Bacterial Shiga toxins bind to the glycosphingolipid (GSL) globotriaosylceramide (Gb3) to enter cells by clathrin-dependent and independent endocytosis. In the clathrin-independent pathway, Shiga toxin reorganizes membrane lipids in a way such as to impose mechanical strain onto the bilayer, thus leading to the formation of deep and narrow endocytic pits. Mechanistically how this occurs is not yet understood, and notably how the geometric properties of toxin-GSLs complexes translate into function has remained enigmatic. In my thesis work, using the B-subunit of Shiga toxin (STxB) as a model, different molecular species of its receptor Gb3 have been synthesized with deliberately chosen structures, coupled with high resolution imaging and computational modeling, to understand the underlying mechano-chemical constraints leading to efficient toxin clustering and lipids reorganization. By combining dissipative particle dynamics (DPD) computer simulation and experiments on cell and model membranes, we provided evidence that a membrane fluctuation-induced force, termed Casimir-like force, drives the aggregation of tightly membrane-associated toxin molecules at mesoscopic length scales. Furthermore, toxin-induced lipid condensation was observed and measured quantitatively on Langmuir monolayers using X-ray reflectivity (XR) and grazing incidence x-ray diffraction (GIXD), thereby providing direct evidence for the hypothesis that the toxin has the potential to asymmetrically reduce the molecular area of the exoplasmic membrane leaflet, leading to local membrane deformation. During my PhD, effort was also invested to develop new GSL tools applied to the biological setting. A novel strategy based on the Cu-free click reaction between glycosyl-cyclooctyne and azido-sphingosine was designed with the goal to functionally incorporate GSLs into cellular membranes. Following the synthesis work, click reactions have been performed in solution and on cells. Compared to the former, results on cells were far less efficient. Further optimization is currently ongoing. A fluorescently labeled Gb3 probe with Alexa Fluor 568 coupled via a PEG linker to the α-position of the acyl chain, was synthesized, to which STxB bound on TLCs, but not on model membranes. Further improvements are discussed.