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The biosynthetic enzymes involved in wall teichoic acid biogenesis in Grampositive bacteria have been the subject of renewed investigation in recent years with the benefit of modem tools of biochemistry and genetics. Nevertheless, there have been only limited investigations into the enzymes that glycosylate wall teichoic acid. Decades-old experiments in the model Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis 168, using phage resistant mutants implicated tagE (also called gtaA and rodD) as the gene coding for the wall teichoic acid glycosyltransferase. This study and others have provided only indirect evidence to support a role for TagE in wall teichoic acid glycosylation. In this work, we showed that deletion of tagE results in the loss of a-glucose at the C-2 position of glycerol in the poly(glycerol phosphate) polymer backbone. We also report the first kinetic characterization of pure, recombinant wall teichoic acid glycosyltransferase using clean synthetic substrates. We investigated the substrate specificity ofTagE using a wide variety of acceptor substrates and showed that this enzyme has a strong kinetic preference for the transfer of glucose from UDP-glucose to glycerol phosphate in polymeric form. Further, we showed that the enzyme recognizes its polymeric (and repetitive) substrate with a sequential kinetic mechanism. This work provides direct evidence that TagE is the wall teichoic acid glycosyltransferase in B. subtilis 168 and provides a strong basis for further studies on the mechanism of wall teichoic acid glycosylation, a largely uncharted aspect of wall teichoic acid biogenesis. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

A novel and highly-abundant 39-kOa acidic water stress protein, Wsp, has been purified and partially characterized from cells of the desiccationtolerant cyanobacterium <i>Nostoc commune</i> (Scherer, S. and Potts, M. 1989. J. BioI. Chem. 264:12546-12553). In the original study, several inconsistencies were noted and are addressed in this body of work. Firstly, the microheterogeneity noted on two dimensional electrophoresis gels indicated the possibility of modifications of the protein or the existence of isoforms of Wsp. This possibility was not addressed in the original study. On two-dimensional gels, several proteins were seen to migrate differently in the 4.5 to 5.5 pH range. These proteins showed a similar change in staining characteristics and after 24h of rehydration a single darkly staining area was resolved. Immunocytochemical analysis revealed that a fraction of Wsp is secreted, and accumulates as a very discrete layer at and around the periphery of the envelope of both vegetative cells and heterocysts. This introduced the possibility that Wsp is a glycoprotein with a large proportion of carbohydrate to protein. However, the original study did not detect carbohydrate attached to Wsp. This was a direct result of the methodology employed to isolate the protein for characterization. A high speed centrifugation step in the protocol of Scherer and Potts (Scherer, S. and Potts, M. 1989. J. BioI. Chern. 264: 12546-12553) selected against isolation of a carbohydrate-bound protein. Further, only minimal glycosylation of this form of Wsp was detected by fluorimetric analysis and Concanavalin A binding experiments (Scherer, S. and Potts, M. 1989. J. BioI. Chem. 264:12546-12553). In the present study, it is shown that Wsp is intimately associated with carbohydrate; more specifically I the data suggest that this form of Wsp may be glycosylated. Wsp is also found to be ubiquitous in materials of <i>Nostoc commune</> collected from the Tropics to the polar regions, some after having being stored for 17 years in the air-dry state. Through the use of protease inhibitors, forms of Wsp, of significantly greater molecular mass than those seen in the primary study, were identified and characterized. This study indicates that the significant amount of Wsp present in desiccated cells is turned over rapidly and within minutes of cell rehydration. This turnover is prevented by a number of different protease inhibitors. Of these, diisopropyl fluorophosphate (DFP) affords the most efficient protection of Wsp. The glycosylation status and specific proteolysis of Wsp in <i>Nostoc</i> are discussed. / Master of Science

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une affection hématologique maligne caractérisée par l’apparition dans la moelle osseuse et le sang, d’un nombre important de globules blancs dont certains sont immatures. A l’heure actuelle, le principal traitement est l’Imatinib, commercialisé sous le nom de Glivec®. Ce traitement conduit, chez certains patients, à l'émergence de souches résistantes, ce qui complique la thérapeutique et nécessite un large panel de molécules actives pour contourner les mécanismes de résistance. Par conséquent, la recherche de nouvelles molécules bioactives agissant sur de nouvelles cibles biologiques reste toujours un défi important et d’actualité. Au cours de ce projet de thèse, nous nous sommes intéressés au développement de nouveaux procédés de synthèse pour accéder et découvrir de nouvelles molécules bioactives, en série nucléosidique, pour contourner les mécanismes de résistances dans des modèles de LMC. Nous avons tout d’abord développé une nouvelle méthode de synthèse propre et efficace de nouveaux analogues de C-nucléosides en utilisant une catalyse par le fer. Nous avons ensuite réalisé plusieurs modifications post-synthétiques pour accéder à de nouveaux C-nucléosides hautement fonctionnalisés, en particulier les analogues de la thiophènefurine. Nous avons également développé un nouveau procédé de synthèse d’une famille de O-glycosides, en combinant l’activation par les ultrasons à la catalyse par le fer. Ce procédé a été exploité par la suite pour concevoir et synthétiser les analogues glycosidiques du résvératrol. Enfin, nous avons mis au point une méthode efficace et peu couteuse d’azidation de sucres protégés. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a malignant hematological disorder characterized by the formation, in the blood and bone marrow, of an excessive number of white blood cells, some of which are immature. Currently, the main treatment of CML is based on tyrosine-kinase inhibitors, such as Imatinib, the first approved drug of this class of compounds and marketed as Gleevec ®. However, this treatment results, in some patients, to the emergence of resistance, which complicates the treatment and requires a wide range of active molecules to circumvent resistance mechanisms. Therefore, the search for new bioactive molecules featuring new mode of action still remains a challenging.In this thesis project, we were interested in the design and discovery of new bioactive molecules in nucleoside series to circumvent resistance mechanisms in CML models, as well as in the development of new synthetic methods for the preparation of these targeted molecules. We first developed a clean and efficient procedure for the synthesis of new C- nucleoside analogues using iron catalysis. Then, several post-synthetic modifications were carried out, starting from halogenated nucleoside derivatives, to access highly functionalized C- nucleosides, as new analogues of thiophenefurin . We also developed a new procedure for the synthesis of O-glycosides using a cooperative effect of iron catalysis and ultrasound activation. This method has been applied for the synthesis of resveratrol O-glycosides. Finally, we developed an effecient and inexpensive method for anomeric sugar azidation. This method was applied for the synthesis of 1,2,3-triazolyl glycosides using a one-pot azidation-click procedure.

Les thérapies anti-angiogéniques actuelles sont limitées, et cibler le métabolisme endothélial représente une nouvelle stratégie prometteuse. Parmi la famille de glycomimétiques Phostines, le composé PST 3.1a possède des propriétés anti-tumorales contre le glioblastome à la fois in vitro et in vivo. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de PST3.1a sur l’angiogenèse et le métabolisme endothélial. L’angiogenèse est un processus complexe décrivant la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d’une vasculature préexistante, dirigée par des facteurs pro-angiogéniques locaux tel que le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF). L’angiogenèse intervient dans différentes conditions pathologiques, et notamment la croissance tumorale. PST 3.1a (10 μM) inhibe les principales étapes menant à l’angiogenèse in vitro, parmi lesquelles la migration, la prolifération, l’adhésion et la formation de tubes. PST 3.1a réduit également l’angiogenèse in vivo dans les modèles murins et du poisson zèbre, ainsi que l’angiogenèse tumorale et la progression du glioblastome. En particulier nos résultats démontrent une diminution d’interaction entre le récepteur au VEGF 2 et la galectine 1, cette interaction étant décrite comme cruciale dans le cadre des résistances tumorales face aux thérapies anti-angiogéniques actuelles. Ces résultats fournissent une ouverture thérapeutique sur une approche innovante et originale contre les pathologies associées à une angiogenèse excessive, tel que le cancer. / Actual anti-angiogenic therapies are limited, and targeting endothelial metabolism is a new promising strategy. One of the lead compound of the Phostin family, PST 3.1a has anti-glioblastoma properties both in vitro and in vivo. The objective of the present study was to assess the effect of PST3.1a on angiogenesis and endothelial metabolism. Angiogenesis is a complex process describing the growth of new blood vessels from existing vasculature, triggered by local pro-angiogenic factors such as the vascular endothelial growth factor (VEGF). Angiogenesis takes part in various pathological conditions and particularly in tumor growth. PST 3.1a (10 μM) inhibited the main steps leading to angiogenesis in vitro including migration, proliferation, adhesion and tube formation. PST 3.1a also reduced physiological angiogenesis in both mice and zebrafish models, and pathological angiogenesis and glioblastoma progression in vivo. In addition, our results highlight the alteration of the interaction between VEGF receptor 2 and galectin-1, a binding known as a key component of the regulation of angiogenesis associated to tumor resistance.These results provide a new route towards an innovative and original approach to target angiogenesis related diseases, including cancer.

En raison de leur contribution à la virulence bactérienne, les lipoprotéines et les membres de la voie de biogenèse des lipoprotéines représentent des cibles prometteuses pour la recherche de nouveaux antibiotiques. À la suite de translocation à travers la membrane interne la future lipoprotéine ancrée dans la membrane par l’intermédiaire de son peptide signal, va subir en premier lieu l’addition de sn-1,2-diacylglyceryle sur la fonction sulfhydryle de la future cystéine N-terminale de la lipoprotéine mature. Cette modification est catalysée par Lgt (prolipoprotéin diacylglycérol transférase) avant même que le peptide signal de la lipoprotéine ne soit clivé par Lsp (lipoprotéine signal peptidase). L’action de la peptidase permet de libérer l’amine terminale de la cystéine qui pourra alors, chez les bactéries à Gram-négatif, être acylée par Lnt (lipoprotéin aminoacyl transférase). La présence d’un apolipoprotéine N-acyltransférase (Ppm2-Ms) impliquées dans la N-acylation de LppX a récemment été montrée chez M. smegmatis. Ppm2-Ms fait partie de l'opéron ppm dans laquelle ppm1, une synthase polyprénol-monophosphomannose, a été révélée essentielle dans la synthèse lipoglycans mais dont la fonction dans la biosynthèse des lipoprotéines est totalement inconnue. Afin de clarifier le rôle de l'opéron ppm dans la biosynthèse des lipoprotéines, nous avons étudié les modifications post-traductionnelles de deux modèles (lipoprotéines AmyE et LppX) dans les mutants Δppm1 et Δppm2 chez C. glutamicum.Nos résultats montrent que les deux lipoprotéines modèles sont ancrées dans la membrane et que leurs extrémités N-terminales sont N-acylés par Ppm2-Cg. Le peptide N-teminal acylé de LppX a été également modifié par des groupements d'hexose. Cette O-glycosylation est localisée dans le peptide N-terminal de LppX mais absente dans le mutant Δppm1. Tandis compromise en l'absence de Cg-PPM2, O-glycosylation LppX pourrait être rétabli lorsque Cg-PPM1, Cg-PPM2 ou l'homologue Mt-ppm1 de M. tuberculosis a été surexprimée. Ensemble, ces résultats montrent pour la première fois que Ppm1-Cg (Ppm synthase) et Ppm2-Cg (Lnt) fonctionnent dans une voie de biosynthèse commune dans laquelle la glycosylation et la N-acylation des lipoprotéines sont étroitement couplés / Due to their contribution to bacterial virulence, lipoproteins and members of the lipoprotein biogenesis pathway represent potent drug targets. Following translocation across the inner membrane, lipoprotein precursors are acylated by lipoprotein diacylglycerol transferase (Lgt), cleaved off their signal peptides by lipoprotein signal peptidase (Lsp) and, in Gram-negative bacteria, further triacylated by lipoprotein N-acyl transferase (Lnt). The existence of an active apolipoprotein N-acyltransferase (Ms-Ppm2) involved in the N-acylation of LppX was recently reported in M. smegmatis. Ms-Ppm2 is part of the ppm operon in which Ppm1, a polyprenol-monophosphomannose synthase, has been shown to be essential in lipoglycans synthesis but whose function in lipoprotein biosynthesis is completely unknown. In order to clarify the role of the ppm operon in lipoprotein biosynthesis, we investigated the post-translational modifications of two model lipoproteins (AmyE and LppX) in C. glutamicum ∆ppm1 and ∆ppm2 mutants. Our results show that both proteins are anchored into the membrane and that their N-termini are N-acylated by Cg-Ppm2. The acylated Ntermina peptide of LppX was also found to be modified by hexose moieties. This O-glycosylation is localized in the N-terminal peptide of LppX and disappeared in the ∆ppm1 mutant. While compromised in the absence of Cg-Ppm2, LppX Oglycosylation could be restored when Cg-Ppm1, Cg-Ppm2 or the homologous Mt-Ppm1 of M. tuberculosis was overexpressed. Together, these results show for the first time that Cg-Ppm1 (Ppm synthase) and Cg-Ppm2 (Lnt) operate in a common biosynthetic pathway in which lipoprotein N-acylation and glycosylation are tightly coupled.

Les cellules épithéliales sont capable de se polariser avec un domaine apical et un basolatéral qui diffèrent nettement en leurs protéines, leurs composition en lipides et donc en fonction. Cette asymétrie reflète la capacité des cellules épithéliales à affecter les protéines nouvellement synthétisées et les lipides à chacune des surfaces de la cellule. Alors que les signaux responsables pour la sélection basolatérale des protéines ont été clairement identifiés, la situation en ce qui concerne la sélection apicale des protéines demeure mal comprise. Nous avons précédemment montré que contrairement aux GPI-APs basolatérales l’oligoisomérisation des protéines ancrées glycosylphosphatidylinositol (GPI-AP) dans l'appareil de Golgi est requise pour le tri apical. Il est intéressent de noter que ce mécanisme est conservé dans deux types de cellules épithéliales, les cellules MDCK et les cellules FRT, qui présentent des différences de tri des GPI-APs. Cependant, le mécanisme précis menant à cet événement n'est pas compris. Nos données précédentes ont démontré que le simple ajout de cholestérol aux cellules MDCK est nécessaire et suffisant pour induire l'oligomérisation et le tri apical d'une GPI-AP basolatérale. Alors que dans l’étude présente sur les cellules FRT, nous avons montré que contrairement aux cellules MDCK, le cholestérol ne joue pas un rôle majeur dans la régulation du tri apicale des GPI-APs. De plus, nous avons également montré que les GPI-APs apicales et basolatérales ne sont pas séparées dans le Golgi en fonction de leur teneur en cholestérol entourant l'environnement membranaire. Par ailleurs, nous avon démontré que la N-glycosylation des protéines de l’ectodomaine est indispensable à l’oligomérisation et au tri apical de GPI-APS. Nos données indiquent qu’il existe au moins deux mécanismes, l’un dépendant du taux de cholestérol et l’autre de la N-glycosylation, qui déterminent l’oligomérisation dans l'appareil de Golgi et le tri des GPI-APs vers la membrane apicale. / Epithelial cells represent the ability to polarize with an apical and basolateral domains which differ markedly in proteins, lipid composition and therefore in function. This asymmetry reflects the ability of epithelial cells to sort newly synthesized proteins and lipid to either cell surface. While the signals responsible for basolateral targeting of the proteins have been clearly understood, the situation regarding the apical sorting of proteins is more obscure. We have previously shown that differently from basolateral GPI-APs oligomerization in the Golgi apparatus is necessary for apical sorting of Glycosylphosphatidylinositol- anchored proteins (GPI-APs). Interestingly this mechanism is conserved in two different kinds of epithelial cells, MDCK and FRT cells, which exhibits a difference in the sorting of GPI-APs. However the precise mechanism leading to this event is not understood. Our previous data demonstrated that simple addition of cholesterol to MDCK cells is necessary and sufficient to induce the oligomerization and apical sorting of a basolateral GPI-AP. Whereas, in this present study in FRT cells we showed that in contrast with MDCK cells cholesterol is not an active player in the regulation of GPI- APs apical sorting. In addition, we also showed that apical and basolateral GPI-APs are not segregated in the Golgi on the bases of the cholesterol content of the surrounding membrane environment. Furthermore, we demonstrated that N- glycosylation of the protein ectodomain is critical for oligomerization and apical sorting of GPI-APs. Our data indicates that at least two mechanisms depending either on cholesterol or on N-glycosylation exist to determine oligomerization in the Golgi and sorting to the apical membrane of GPI-APs.

Les glioblastomes multiformes (GBM) comptent parmi les tumeurs au pronostic le plus sombre. L’extraordinaire capacité invasive des cellules tumorales rend toutes les interventions thérapeutiques actuelles totalement impuissantes. Une sous-population de Cellules Souches de Glioblastome (CSG) hautement invasive est responsable de la récurrence tumorale. Dans le cerveau, les GBM migrent principalement le long des vaisseaux sanguins au sein de l’espace périvasculaire riche en laminine, fibronectine et collagène ainsi qu’en suivant l’alignement des fibres myélinisées du corps calleux. La Matrice Extracellulaire (MEC) de ces régions joue un rôle important dans l’invasion des GBM, mais les mécanismes mis en jeu n’ont pas été complètement dévoilés. De plus, le développement de nouvelles thérapies anti-migratrices ciblant l’interaction des GBM avec la MEC reste encore limité. Dans le but de mimer la composition biochimique et les propriétés mécaniques de la MEC cérébrale et d’étudier leur rôle(s) dans la migration des CSG, nous avons développé un nouveau support de nanofibres (NF) alignées et fonctionnalisées avec de la laminine. Mes travaux de thèse ont montré que les NF génèrent un microenvironnement tridimensionnel (3D) favorisant l’adhésion et la migration des CSG. Cette adhésion est améliorée en comparaison avec les supports planaires (SP) conventionnels (2D) et récapitule mieux les mécanismes d’interaction des CSG avec la MEC au cours de l’invasion dans le modèle murin de tumeurs xénogreffées. Dans ces conditions physiologiques plus convenables générées par les NF, la variation des composantes biochimiques et mécaniques de la MEC affecte la migration des CSG. La présence ou l’absence de laminine régule le mode migratoire et l’orientation de fibres contrôle la direction de migration des CSG. D’un autre coté, l’altération de la glycosylation des protéines de la surface cellulaire module l’interaction des cellules tumorales du cerveau avec la MEC et augmente leur invasion. La deuxième partie de mes travaux de thèse a permis de démontrer que les glycomimétiques phostines « 3.1a » réorganisent le processus de la N-glycosylation des CSG diminuant leur invasivité in vitro et in vivo en inhibant les voies de signalisation de la kinase FAK et du récepteur de TGF-β impliqués dans l’interconnexion cellule-MEC. / Glioblastoma Multiforme (GBM) is a biologically aggressive tumor with an extremely poor prognosis. The highly invasive capacity of a subpopulation of Glioblastoma Initiating Cells (GIC) makes complete surgical resection impossible. GBM dissemination occurs along preexisting brain structures such as the perivascular space rich in laminin, fibronectine and collagen as well as the aligned myelinated fibers of the corpus callosum. The Extracellular Matrix (ECM) of these cerebral regions plays an important role during GBM invasion, but the underlying mechanisms remain largely unknown. Accordingly, the development of new anti-migratory therapies targeting the cell-ECM interactions is lacking. In order to mimic the compositional and physical properties of the cerebral ECM and to investigate their role(s) in GBM invasion, we have set up a new aligned nanofibers (NF)scaffold functionalized with laminin. My work demonstrated that the NFs constitute a tridimensional (3D) microenvironment supporting GIC adhesion and migration. The cell-ECM adhesion is improved on the NF in comparison to the conventional 2D planar surfaces (PS). Furthermore, the mechanisms of GIC interaction with the ECM on the NF are similar to those observed in the human GBM xenograft murine model. In this physiologically more relevant 3D microenvironment reproduced by the NF, the variation of the different biochemical and mechanical components of the ECM affects the migration of GIC. The presence or absence of laminin on the NF regulates the mode of migration and the orientation of the fibers dictates the direction of migration of GIC. On the other hand, the glycosylation that decorates cell surface proteins modulates the interaction of GBM tumor cells with the ECM and its alteration increases their invasion. The second part of my thesis demonstrated that the glycomimetics phostines « 3.1a » remodel the N-glycosylation of GIC and decrease their invasivity in vitro and in vivo via the inhibition of FAK and TGFβ-R signaling pathways known to be implicated in the cell-ECM intercommunication.

Les héparanes sulfates (HS) sont des polysaccharides linéaires et sulfatés exprimés sur la surface cellulaire où ils interagissent et régulent l’activité de nombreuses proteines, en particulier les cytokines et chimiokines. Ils sont à ce titre de bons candidats médicaments dans des pathologies inflammatoires, autoimmunes ou en oncologie. L’unité répétitive de ce biopolymère est constituée d’un résidu de D-glucosamine lié à un acide uronique par une liaison 1,2-cis. Malheureusement, la formation d’un glycoside 1,2-cis dans la série 2-azido-2-déoxy-D-glucose avec une haute stéréosélectivité reste un des plus grands défis de la glycochimie. Parmi les nombreuses méthodologies permettant d’accéder à la synthèse des fragments d’HS avec de bons rendements et une bonne stéréosélectivité, nous avons été particulièrement intéressés par l’assistance anchimérique d’un groupement protecteur en position 6 du donneur. L’objectif de ce travail était de trouver des groupements protecteurs qui favoriseront la stéréosélectivité 1,2-cis. Nous avons préparés plusieurs donneurs thioglycosides modifiés en position 6 par des différents groupements protecteurs. L’activation des thioglycosides passe par une étape de formation des triflates anomériques. Nous avons élaboré un protocole de suivi de l’activation sur un donneur modèle afin de suivre la formation du triflate anomérique, sa plage de stabilité, ses produits de dégradation ainsi que les produits secondaires d’activation par RMN à basse température. Ensuite, ce protocole d’activation a été utilisé avec tous les donneurs synthétisés afin d’ajuster les conditions de glycosylation. Les tests de glycosylation nous ont permis de décéler plusieurs groupes capables de favoriser la stéréosélectivité 1,2-cis. Certains groupements protecteurs ont manifesté une incompatibilité avec les conditions d’activation des thioglycosides. Pour contourner ce problème, nous avons remplacé les thioglycosides par les donneurs N-phényltrifluoroacétimidates. Après avoir effectué des études d’activation sur ces donneurs toujours par RMN à basse température, les glycosylations ont été effectuées. Finalement, les groupements protecteurs favorisant la stéréosélectivité 1,2-cis ont été testés dans différentes conditions de déprotection afin d’établir la compatibilité de ces groupements protecteurs avec les conditions de synthèse des oligosaccharides d’HS. / Heparin sulfate (HS) are linear and sulfated polysaccharides present at the cell surface. HS interact and regulate activity of numerous proteins, especially cytokines and chemokines. Therefore, HS oligosaccharides are targeted as potential drugs in inflammation, autoimmune disease or tumor treatment. The basic disaccharide unit of HS consists in D-glucosamine residue linked to an uronic acid by 1,2-cis glycosidic linkage. Unfortunately, the formation of highly stereoselective 1,2-cis glycosidic bond in 2-azido-2-deoxy-D-glucose series is still a major concern in glycochemistry. Amongst the numerous methodologies favoring the stereoselective 1,2-cis linkage formation, we were particularly interested in 6-O-anchimeric assistance. Several thioglycoside donors with different protecting groups in position 6 were prepared to find some 1,2-cis stereodirecting protecting groups. Some thioglycoside activation related in literature yields a reactive anomeric triflate intermediate. In order to observe its formation and to determine the limits of its stability and by-product formation, a new low temperature NMR experiment protocol was elaborated. All synthesized donors were tested using this protocol in order to adjust their glycosylation conditions. The glycosylation tests revealed several 1,2-cis stereodirecting protecting groups. Since certain protecting groups were incompatible with thioglycoside activation conditions, corresponding NPTFA donors were used as an alternative. Their activations were monitored by low temperature NMR techniques and followed by their glycosylations. Finally, all 1,2-cis stereodirecting protecting groups were tested in different deprotection conditions to determine the compatibility of chosen protecting groups with our HS oligosaccharide design synthesis.