GOES JÚNIOR, Francisco de Assis Mendes. Relaxamento do corpo cavernoso de coelho induzido pela fração alcaloidal F3-5 de Aspidosperma ulei Markgr. 2007. 65 f. Dissertação (Mestrado em Cirurgia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2007. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-02-19T16:37:10Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_famgoesjpunior.pdf: 1185630 bytes, checksum: bc50b6e04e8e3c6c6879faa44b04e3be (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-02-19T16:38:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_famgoesjpunior.pdf: 1185630 bytes, checksum: bc50b6e04e8e3c6c6879faa44b04e3be (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-19T16:38:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_famgoesjpunior.pdf: 1185630 bytes, checksum: bc50b6e04e8e3c6c6879faa44b04e3be (MD5) Previous issue date: 2007 / Erectile dysfunction is a worldwide public health issue and, in spite of advances brougth by the utilization of type-5 phosphodiesterase inhibitors, there is still much interest in new treatment alternatives, especially when derived from natural products. Some investigators observed the pro-erectile effects of an alkaloidal-rich fraction from Aspidosperma ulei Markgr., named F3-5. In this study, it was evaluated the degree of relaxation induced by F3-5 on rabbit corpus cavernosum, as well as possible Pharmacological mechanisms involved, in vitro. Several experimental assays were performed, utilizing the methods of cascade tissue superfusion and isolated tissue bath. Wíth strips ot corpus cavernosum pre-contracted with phenilephrine (5µM), dose-response curves of relaxation for F3-5 papaverine and DMSO were produced. were There were also assays fo, evaluation of the effects of L-NAME, 7-NI, 000, propranolol, atropine, sildenafil and F3-5 on the relaxations mediated by sodium litroprusside, acetylcholine, isoproterenol, sildenafil and F3-S. With depolarized preparations of corpus cavernosum, in a calcium-free, potassium-rich (60 mM) medium, the effects of F3-S and DMSO on the contractions induced by the progressive increase in Ca2+ concentration (1 - 300 mM) were observed. F3-5 was capable of inducing complete relaxation of rabbit corpus cavernosum with magnitude similar to that of papaverine for all doses tested, except 3 mg, when ít presented a significantly higher relaxation. Superfusions of L-NAME, 7-NI and ODQ did not significantly inhibit the relaxatíons provoked by F3-5, suggesting that it acts independently of the nitrergiê pathway. Propranolol and atropine also did not significantly interfere with relaxations mediated by F3-5 indicating that B-adrenergic or rnuscarinic receptors also might not be involved. F3-5 did not significantly amplify the relaxations promoted by sodium nitroprusside or acetylcholine, as opposed to sildenafil, suggesting that it does not act through inhibition of type-5 ohosphodiesterase. Finally, in cavernous tissue pre-incubated with F3-5, the minimum dose of Ca2+ necessary for muscular contraction was thirty times superior to that utilizedon the tissue without previous treatment, or treated with OMSO. This inhibition of the contractions of corpus cavernosum mediated by Ca2+ suggests, therefore, that F3-S can act through blockade of voltage-dependent calcium channels. / A disfunção erétil é um problema mundial de saúde pública e, apesar dos avanços trazidos pela utilização dos inibidores da fosfodiesterase tipo-5, ainda há muito interesse em novas alternativas de tratamento, especialmente quando derivadas de produtos naturais. Alguns pesquisadores observaram os efeitos pró-eréteis de uma fração rica em alcalóides de Aspidosperma ulei Markgr., denominada F3-5. Neste estudo, foi avaliado o grau de relaxamento induzido por F3-5 no corpo cavernoso de coelho, bem como possíveis mecanismos farmacológicos envolvidos, in vitro. Foram realizados diversos ensaios experimentais, utilizando-se os métodos de superfusão de tecido em cascata e de banho isolado de tecido. Com tiras de corpo cavernoso pré-contraídas com fenilefrina (5 μM), foram produzidas curvas de dose-resposta de relaxamento para F3-5, papaverina e DMSO. Também foram realizados ensaios para avaliação dos efeitos de L-NAME, 7-NI, ODQ, propranolol, atropina, sildenafil e F3-5 sobre os relaxamentos mediados por nitroprussiato de sódio, acetilcolina, isoproterenol, sildenafil e F3-5. Com preparações de corpo cavernoso despolarizadas, em um meio livre de cálcio e rico em potássio (60 mM), os efeitos de F3-5 e DMSO sobre as contrações induzidas pelo aumento progressivo na concentração de Ca2+ (1 – 300 mM) foram observados. F3-5 foi capaz de induzir o relaxamento completo do corpo cavernoso de coelho, com magnitude similar à da papaverina para todas as doses testadas, exceto 3 mg, quando apresentou relaxamento significantemente maior. As superfusões de L-NAME, 7-NI e ODQ não inibiram significantemente os relaxamentos provocados por F3-5, sugerindo que este age independentemente da via nitrérgica. Propranolol e atropina também não interferiram significantemente com os relaxamentos mediados por F3-5, indicando que receptores β-adrenérgicos ou muscarínicos também não devem estar envolvidos. F3-5 não amplificou significantemente os relaxamentos promovidos por nitroprussiato de sódio ou acetilcolina, ao contrário de sildenafil, sugerindo que não age por inibição da fosfodiesterase tipo-5. Finalmente, em tecido cavernoso pré-incubado com F3-5, a dose mínima de Ca2+ necessária para contração muscular foi trinta vezes superior àquela utilizada em tecido sem tratamento prévio ou tratado com DMSO. Esta inibição das contrações de corpo cavernoso mediadas pelo Ca2+ sugere, portanto, que F3-5 pode atuar através do bloqueio de canais de cálcio voltagem-dependente.

Bactérias podem formar comunidades bacterianas sésseis, conhecidas como biofilmes, os quais possuem um grande impacto tanto na indústria, por serem responsáveis pelo entupimento e corrosão de tubulações, quanto na saúde, por serem resistentes ao tratamento com antibióticos. Nos últimos anos, o mensageiro secundário c-di-GMP foi descoberto como um importante regulador nas vias de sinalização envolvidas na capacidade da bactéria alternar entre esses dois fenótipos: livre nadante ou em biofilme. Um dos alvos moleculares de c-di-GMP é FleQ, uma Enhancer binding protein bacteriana (bEBP), que regula a expressão dos genes flagelares de forma dependente do fator σ54, em um processo dependente de ATP. FleQ também atua no controle da transcrição dos genes envolvidos na síntese do exopolissacarídeo PEL, principal constituinte da matriz protetora que reveste o biofilme bacteriano em Pseudomonas aeruginosa, possivelmente em um processo dependente do fator σ70. A atividade de FleQ é regulada pelos níveis de c-di-GMP e por uma segunda proteína, FleN, que se liga diretamente à FleQ. Apesar do papel do complexo FleQ:FleN na regulação do operon pel ter sido estudado, seu efeito na transcrição dos genes flagelares ainda é desconhecido. Para um melhor entendimento do mecanismo regulatório de FleQ, foram resolvidas as estruturas cristalográficas do domínio REC e do domínio AAA+ em seu estado apo e em complexo com ADP, ATPγS e c-di-GMP. Também foi identificado e confirmado o sítio ativo da proteína, as diferentes formas oligoméricas de FleQ, além da proposição de como a atividade da proteína é controlada por FleN. Esses resultados sugerem um mecanismo único na transcrição mediada por uma bEBP não convencional que atua tanto com o fator σ54 e σ70, no qual a oligomerização do complexo FleQ:FleN possui um papel essencial na regulação dos genes flagelares e de formação do biofilme. Estes estudos também levam à hipótese que outras bEBPs, associadas a diferentes fenótipos, podem ser reguladas por c-di-GMP. / Bacteria can form sessile communities known as biofilm, which has a major industrial impact, causing tubing obstruction and corrosion, and in the health, due to its resistance against antibiotic treatment. In recent years, a novel secondary messenger molecule named c-di-GMP has been discovered as a key regulator in signaling pathways related to the bacteria capacity to alternate between two distinct phenotypes: free-swimming cells and biofilm community. One of the molecular targets of c-di-GMP so far identified is FleQ, a bacterial enhancer binding protein (bEBP), which regulates flagellar gene expression in a σ54 dependent mechanism. FleQ acts also controlling transcription of genes involved in PEL exopolysaccharide synthesis, main component of the protective matrix, possibly in a σ70 dependent process. FleQ activity is regulated by a second protein, FleN, which directly interacts with FleQ. Although the role of FleQ:FleN complex in regulating pel operon has been studied, its effect in flagellar gene transcription has not. For a better understanding of FleQ regulatory mechanism, we obtained the crystallographic structure of the REC domain and the AAA+ domain in its apo state and bound to ADP, ATPγS and c-di-GMP. It has also been identified and confirmed c-di-GMP binding site, the distinct oligomers of FleQ, and also proposed a mechanism by which FleN regulates FleQ. These results suggest an unique mechanism in the transcription mediated by an unusual bEBP that acts in conjunction with both σ54 and σ70 factors, in which oligomerization of FleQ:FleN complex has a crucial role in the regulation of flagellar and biofilm formation genes. These studies also lead to the hypothesis that others bEBP, related to distinct phenotypes, may be regulated by c-di-GMP.

Nos últimos anos, um estilo de vida celular vem ganhando destaque no mundo científico: o biofilme. O biofilme é uma comunidade celular em que as células permanecem aderidas a um substrato e envoltas em uma matriz de biopolímeros. Bactérias no estado de biofilme possuem algumas características alteradas, como o aumento da resistência a antibióticos e a facilidade de troca de genes de resistência, sendo um grande inconveniente na área médica e industrial. O patógeno humano Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria gram-negativa causadora de infecções associadas a pacientes que apresentam o sistema imune debilitado, sendo muito comum em casos de fibrose cística. Além disso, P. aeruginosa é um organismo modelo no estudo de formação de biofilme, podendo produzir três tipos distintos de exopolissacarídeos: alginato, PSL e PEL. Devido ao pouco conhecimento do polissacarídeo PEL, a cepa P. aeruginosa PA14 vem sendo amplamente estudada, uma vez que essa é a única cepa em que PEL é o principal polímero responsável pela estabilidade da matriz de polissacarídeos. No processo de produção e exportação de PEL, sete proteínas são necessárias: Pel(A-G). Segundo predições computacionais e comparações com outros tipos de complexos biossintéticos de exopolissacarídeos, um modelo de arranjo molecular das proteínas Pel foi proposto, embora algumas proteínas não possuam uma função bem determinada no processo de síntese de PEL. Nesse contexto, o trabalho buscou estudar as proteínas envolvidas na formação de PEL para a melhor elucidação do mecanismo de ativação, produção e exportação desse polissacarídeo, com destaque para a enzima glicosiltransferase PelF e a investigação de uma possível interação de PelF com a proteína reguladora de produção do polissacarídeo, PelD, e a transportadora de membrana interna, PelG. Foram realizados diversos testes de interação entre PelF, PelG e construções solúveis de PelD por cromatografia de exclusão molecular, crosslinking e pull-down que não apresentaram interações entre tais construções, indicando que frações de membrana de PelD ou outros parceiros de interação podem ser necessários para a formação do complexo de síntese e exportação de PEL da membrana interna. Adicionalmente, mutantes de PelD sítio-dirigidos foram construídos em P. aeruginosa PA14 e tiveram sua capacidade de formação de biofilme avaliadas para investigação do mecanismo de ativação de PelD. A diminuição da formação de biofilme de mutantes de algumas regiões de PelD como a hélice S (resíduos 158-176), o core hidrofóbico ocupado pela hélice S e resíduos que estabilizam a ligação de c-di-GMP nos levou a propor um mecanismo de ativação desse importante regulador proteico de formação de biofilme em P. aeruginosa nunca descrito anteriormente. / In the last years, a cellular lifestyle has been in the spotlight in the scientific world: the biofilm. Biofilm is a cellular community in which cells are attached to a substrate and surrounded by a biopolymeric matrix. Bacteria in a biofilm lifestyle has some altered characteristics, as a higher antibiotics tolerance and facility in resistance genes exchange, turning them into a big problem in medical and industrial fields. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa is a gram-negative bacterium which causes infections associated to patients with an impaired immune system, as frequently found in patients with cystic fibrosis. Moreover, P. aeruginosa is a model organism in biofilm formation studies, producing three distinct types of exopolysaccharides: alginate, PSL and PEL. Since there is few information about PEL polysaccharide, the strain PA14 has been broadly studied because this is the unique strain in which PEL is the main polymer that gives stability of the polysaccharide matrix. In the process of PEL production and exportation, seven proteins are required: Pel(A-G). Computational predictions and comparison with other similar exopolysaccharides biosynthetic complexes led to a model of molecular complex of Pel proteins, though some proteins do not have a clear role in the PEL synthesis process. In this context, the work aimed to study the proteins related to PEL synthesis for a better understanding of the mechanism of production and exportation of this polysaccharide, focusing on the glycosyltransferase PelF and the investigation of its possible interaction with PelD, the regulatory protein of the polysaccharide production, and PelG, the putative inner membrane transporter. Several interaction assays were performed with PelF, PelG and soluble constructs of PelD using size exclusion chromatography, crosslinking and pull-down. No interaction was detected, showing that membrane fractions of PelD or other interaction partners can be required to the inner membrane complex of synthesis and export of PEL. Additionally, site-directed mutants of PelD in P. aeruginosa PA14 were constructed to evaluate their biofilm formation ability and investigate PelD activation mechanism. Mutants in regions as S-helix (residues 158-176), hydrophobic core occupied by the S-helix and residues of c-di-GMP stabilization presented a decrease of biofilm formation compared to the wild type strain. Those results allowed us to propose an activation mechanism of this important regulator of biofilm formation in P. aeruginosa never described before.

Bactérias podem formar comunidades bacterianas sésseis, conhecidas como biofilmes, os quais possuem um grande impacto tanto na indústria, por serem responsáveis pelo entupimento e corrosão de tubulações, quanto na saúde, por serem resistentes ao tratamento com antibióticos. Nos últimos anos, o mensageiro secundário c-di-GMP foi descoberto como um importante regulador nas vias de sinalização envolvidas na capacidade da bactéria alternar entre esses dois fenótipos: livre nadante ou em biofilme. Um dos alvos moleculares de c-di-GMP é FleQ, uma Enhancer binding protein bacteriana (bEBP), que regula a expressão dos genes flagelares de forma dependente do fator σ54, em um processo dependente de ATP. FleQ também atua no controle da transcrição dos genes envolvidos na síntese do exopolissacarídeo PEL, principal constituinte da matriz protetora que reveste o biofilme bacteriano em Pseudomonas aeruginosa, possivelmente em um processo dependente do fator σ70. A atividade de FleQ é regulada pelos níveis de c-di-GMP e por uma segunda proteína, FleN, que se liga diretamente à FleQ. Apesar do papel do complexo FleQ:FleN na regulação do operon pel ter sido estudado, seu efeito na transcrição dos genes flagelares ainda é desconhecido. Para um melhor entendimento do mecanismo regulatório de FleQ, foram resolvidas as estruturas cristalográficas do domínio REC e do domínio AAA+ em seu estado apo e em complexo com ADP, ATPγS e c-di-GMP. Também foi identificado e confirmado o sítio ativo da proteína, as diferentes formas oligoméricas de FleQ, além da proposição de como a atividade da proteína é controlada por FleN. Esses resultados sugerem um mecanismo único na transcrição mediada por uma bEBP não convencional que atua tanto com o fator σ54 e σ70, no qual a oligomerização do complexo FleQ:FleN possui um papel essencial na regulação dos genes flagelares e de formação do biofilme. Estes estudos também levam à hipótese que outras bEBPs, associadas a diferentes fenótipos, podem ser reguladas por c-di-GMP. / Bacteria can form sessile communities known as biofilm, which has a major industrial impact, causing tubing obstruction and corrosion, and in the health, due to its resistance against antibiotic treatment. In recent years, a novel secondary messenger molecule named c-di-GMP has been discovered as a key regulator in signaling pathways related to the bacteria capacity to alternate between two distinct phenotypes: free-swimming cells and biofilm community. One of the molecular targets of c-di-GMP so far identified is FleQ, a bacterial enhancer binding protein (bEBP), which regulates flagellar gene expression in a σ54 dependent mechanism. FleQ acts also controlling transcription of genes involved in PEL exopolysaccharide synthesis, main component of the protective matrix, possibly in a σ70 dependent process. FleQ activity is regulated by a second protein, FleN, which directly interacts with FleQ. Although the role of FleQ:FleN complex in regulating pel operon has been studied, its effect in flagellar gene transcription has not. For a better understanding of FleQ regulatory mechanism, we obtained the crystallographic structure of the REC domain and the AAA+ domain in its apo state and bound to ADP, ATPγS and c-di-GMP. It has also been identified and confirmed c-di-GMP binding site, the distinct oligomers of FleQ, and also proposed a mechanism by which FleN regulates FleQ. These results suggest an unique mechanism in the transcription mediated by an unusual bEBP that acts in conjunction with both σ54 and σ70 factors, in which oligomerization of FleQ:FleN complex has a crucial role in the regulation of flagellar and biofilm formation genes. These studies also lead to the hypothesis that others bEBP, related to distinct phenotypes, may be regulated by c-di-GMP.

Nos últimos anos, um estilo de vida celular vem ganhando destaque no mundo científico: o biofilme. O biofilme é uma comunidade celular em que as células permanecem aderidas a um substrato e envoltas em uma matriz de biopolímeros. Bactérias no estado de biofilme possuem algumas características alteradas, como o aumento da resistência a antibióticos e a facilidade de troca de genes de resistência, sendo um grande inconveniente na área médica e industrial. O patógeno humano Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria gram-negativa causadora de infecções associadas a pacientes que apresentam o sistema imune debilitado, sendo muito comum em casos de fibrose cística. Além disso, P. aeruginosa é um organismo modelo no estudo de formação de biofilme, podendo produzir três tipos distintos de exopolissacarídeos: alginato, PSL e PEL. Devido ao pouco conhecimento do polissacarídeo PEL, a cepa P. aeruginosa PA14 vem sendo amplamente estudada, uma vez que essa é a única cepa em que PEL é o principal polímero responsável pela estabilidade da matriz de polissacarídeos. No processo de produção e exportação de PEL, sete proteínas são necessárias: Pel(A-G). Segundo predições computacionais e comparações com outros tipos de complexos biossintéticos de exopolissacarídeos, um modelo de arranjo molecular das proteínas Pel foi proposto, embora algumas proteínas não possuam uma função bem determinada no processo de síntese de PEL. Nesse contexto, o trabalho buscou estudar as proteínas envolvidas na formação de PEL para a melhor elucidação do mecanismo de ativação, produção e exportação desse polissacarídeo, com destaque para a enzima glicosiltransferase PelF e a investigação de uma possível interação de PelF com a proteína reguladora de produção do polissacarídeo, PelD, e a transportadora de membrana interna, PelG. Foram realizados diversos testes de interação entre PelF, PelG e construções solúveis de PelD por cromatografia de exclusão molecular, crosslinking e pull-down que não apresentaram interações entre tais construções, indicando que frações de membrana de PelD ou outros parceiros de interação podem ser necessários para a formação do complexo de síntese e exportação de PEL da membrana interna. Adicionalmente, mutantes de PelD sítio-dirigidos foram construídos em P. aeruginosa PA14 e tiveram sua capacidade de formação de biofilme avaliadas para investigação do mecanismo de ativação de PelD. A diminuição da formação de biofilme de mutantes de algumas regiões de PelD como a hélice S (resíduos 158-176), o core hidrofóbico ocupado pela hélice S e resíduos que estabilizam a ligação de c-di-GMP nos levou a propor um mecanismo de ativação desse importante regulador proteico de formação de biofilme em P. aeruginosa nunca descrito anteriormente. / In the last years, a cellular lifestyle has been in the spotlight in the scientific world: the biofilm. Biofilm is a cellular community in which cells are attached to a substrate and surrounded by a biopolymeric matrix. Bacteria in a biofilm lifestyle has some altered characteristics, as a higher antibiotics tolerance and facility in resistance genes exchange, turning them into a big problem in medical and industrial fields. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa is a gram-negative bacterium which causes infections associated to patients with an impaired immune system, as frequently found in patients with cystic fibrosis. Moreover, P. aeruginosa is a model organism in biofilm formation studies, producing three distinct types of exopolysaccharides: alginate, PSL and PEL. Since there is few information about PEL polysaccharide, the strain PA14 has been broadly studied because this is the unique strain in which PEL is the main polymer that gives stability of the polysaccharide matrix. In the process of PEL production and exportation, seven proteins are required: Pel(A-G). Computational predictions and comparison with other similar exopolysaccharides biosynthetic complexes led to a model of molecular complex of Pel proteins, though some proteins do not have a clear role in the PEL synthesis process. In this context, the work aimed to study the proteins related to PEL synthesis for a better understanding of the mechanism of production and exportation of this polysaccharide, focusing on the glycosyltransferase PelF and the investigation of its possible interaction with PelD, the regulatory protein of the polysaccharide production, and PelG, the putative inner membrane transporter. Several interaction assays were performed with PelF, PelG and soluble constructs of PelD using size exclusion chromatography, crosslinking and pull-down. No interaction was detected, showing that membrane fractions of PelD or other interaction partners can be required to the inner membrane complex of synthesis and export of PEL. Additionally, site-directed mutants of PelD in P. aeruginosa PA14 were constructed to evaluate their biofilm formation ability and investigate PelD activation mechanism. Mutants in regions as S-helix (residues 158-176), hydrophobic core occupied by the S-helix and residues of c-di-GMP stabilization presented a decrease of biofilm formation compared to the wild type strain. Those results allowed us to propose an activation mechanism of this important regulator of biofilm formation in P. aeruginosa never described before.

Die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) ist ein zentrales Enzym der NO/cGMP-Signalkaskade, das über die Aktivierung von NO zur Bildung des second messangers cGMP führt. Die NO-GC setzt sich aus zwei Untereinheiten zusammen, sodass zwei Isoformen des Enzyms gebildet werden können (α1β1 und α2β1). Da die genaue Verteilung der beiden Isoformen im Colon nicht bekannt ist, wurde diese im ersten Teil dieser Arbeit charakterisiert. Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung zeigten die Expression beider Isoformen sowohl in der glatten Muskelschicht als auch in der Submukosa und Lamina propria. Dabei war die α1β1-Isoform ubiquitär, die α2β1-Isoform dagegen hauptsächlich im Bereich des myenterischen Plexus vorzufinden. In der glatten Muskelschicht des Colons ist die NO-GC in glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) sowie Fibroblasten-ähnliche Zellen (FLC) exprimiert und hauptsächlich in die Modulation der gastrointestinalen Motilität involviert. Zur spezifischen Charakterisierung der Funktion der NO-GC in den einzelnen Zelltypen wurden Knockout-Mäuse generiert, denen die NO-GC global (GCKO) oder spezifisch in SMC (SMC-GCKO), ICC (ICC-GCKO) oder beiden Zelltypen (SMC/ICC-GCKO) fehlt. Anhand dieser Mausmodelle sollten im zweiten Teil dieser Arbeit die modulatorischen Effekte der NO-GC auf die spontanen Kontraktionen des Colons bestimmt werden. Zur Charakterisierung der spontanen Kontraktionen der zirkulären Muskelschicht wurden Myographiestudien mit 2,5 mm langen Colonringen durchgeführt. Hierbei konnten drei verschiedene Kontraktionen gemessen werden: Kleine, hochfrequente Ripples, mittlere Kontraktionen und große Kontraktionen. Die detaillierte Analyse der einzelnen Kontraktionen zeigte einerseits eine NO-unabhängige Regulation der Ripples, andererseits eine NO-abhängige Modulation der mittleren und großen Kontraktionen über die NO-GC in SMC und ICC. Die NO-GC in SMC beeinflusst die Kontraktionen vermutlich vor allem über die Regulation des Muskeltonus der zirkulären Muskelschicht. Die NO-GC in ICC dagegen modifiziert die spontanen Kontraktionen möglicherweise über eine Veränderung der Schrittmacheraktivität. Allerdings führt erst ein Funktionsverlust des NO/cGMP-Signalweges in beiden Zelltypen zu einem sichtbar veränderten Kontraktionsmuster, das dem von globalen Knockout-Tieren glich. Dies weist auf eine kompensatorische Wirkung der NO-GC im jeweils anderen Zelltyp hin. Zur Analyse der propulsiven Kontraktionen entlang des gesamten Colons wurden Videoaufnahmen der Darmbewegungen in Kontraktionsmusterkarten transformiert. Zudem wurde der Darm durchspült und die Ausflusstropfen aufgezeichnet, um die Effektivität der Kontraktionen beurteilen zu können. Hierbei zeigte sich, dass eine Beeinträchtigung des NO/cGMP-Signalweges eine verminderte Effektivität der Kontraktionen zur Folge hat und vermutlich durch eine beeinträchtige Synchronisation der Kontraktionen erklärt werden kann. In diesem Regulationsmechanismus konnte vor allem der NO-GC in SMC eine übergeordnete Rolle zugewiesen werden. Der dritte Teil der Arbeit thematisierte den Befund, dass SMC-GCKO-Tiere ca. 5 Monate nach Tamoxifen-Behandlung Entartungen der Mukosa entwickelten. Diese Entartung war lediglich in Tamoxifen-induzierten Knockout-Tieren vorzufinden. Histologische Analysen identifizierten die Entartungen als tubulovillöses Adenom. Die Genexpressionsanalyse von Mukosafalten von SMC-GCKO- und heterozygoten Kontrolltieren zeigte eine Vielzahl von Genen, welche spezifisch bei colorectalem Karzinom differenziell exprimiert sind. Einer dieser Faktoren war der BMP-Antagonist Gremlin1. Dieser Faktor erschien von besonderem Interesse, da er in Zellen der Lamina muscularis mucosae und kryptennahen Myofibroblasten exprimiert wird. Immunhistochemische Analysen ließen vermuten, dass diese Zellen sowohl die NO-GC als auch die Cre-Rekombinase unter dem SMMHC-Promotor exprimieren. Diese Arbeit liefert demnach Hinweise darauf, dass die NO-GC einen wichtigen Regulator innerhalb der Stammzellnische bildet. Die Deletion der NO-GC führt vermutlich zu einer verstärkten Bildung bzw. Sekretion von Gremlin1, was die Homöostase der mukosalen Erneuerung stört und somit zur Entwicklung von Adenomen führt. / The NO/cGMP signalling cascade is involved in many physiological processes. NO sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) is a key enzyme of this cascade, which is activated by NO and leads to the generation of the second messenger cGMP. As NO GC is comprised of two subunits two different isoforms exist (α1β1 und α2β1). However, the detailed distribution of the two isoforms in the colon is not known. Therefore, in the first part of this thesis, immunohistochemical staining and in situ hybridization was performed. The results showed NO-GC expression in the smooth muscle layer as well as in the submucosa and the lamina propria. Whereas the α1β1 isoform is expressed ubiquitously, expression of the α2β1 isoform is concentrated on the myenteric plexus. In the smooth muscle layer, NO-GC expression has been shown specifically in smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC) and fibroblast-like cells (FLC). The function has been mainly associated with modulation of gastrointestinal motility. To specify the role of NO-GC on colonic motility in each cell type, mice lacking NO-GC globally (GCKO) or specifically in SMC (SMC-GCKO), ICC (ICC-GCKO) or in both (SMC/ICC-GCKO) were used. First, organ bath studies were performed using small proximal colonrings of 2,5 mm size. These measurements showed three different contractions: small, high frequency ripples, intermediate contractions and large contractions. For each contraction type, NO dependence was analyzed: Ripples are regulated in a NO-independent manner. In contrast, intermediate and large contractions are modulated by NO via a mechanism involving both ICC and SMC: NO GC in SMC most likely modulates contractions by setting muscle tone, whereas NO GC in ICC interacts with the pacemaker activity. Moreover, contractions along the whole colon were analyzed using spatiotemporal maps. These measurements revealed NO-GC to be related to the efficiency of propulsive long distance contractions (LDC). Impaired NO-GC signalling (e.g. in SMC-GCKO, GCKO mice or in the presence of NOS inhibitor L-NAME) resulted in altered appearance of LDC. Some of these LDC did not produce outflow. Thus, our results indicate a prominent role of NO-GC in SMC to synchronize contractions along the colon to result in effective propulsion. The third part of the study focused on the potential involvement of NO-GC in adenoma development. This hypothesis was set up based on the observation that colon of SMC GCKO mice showed mucosal swellings five month after tamoxifen treatment. Histological analysis assumed the mucosal swellings as tubulovillous adenoma. Subsequent gene expression analysis of mucosal folds of SMC-GCKO and heterozygous control mice identified a variety of differentially expressed genes, among them the BMP antagonist Gremlin1. This factor is potentially influenced by NO-GC as it is expressed by cells of the lamina muscularis mucosae and myofibroblasts closely located to the colonic crypts. Immunohistochemical analysis of tdTomato reporter mice assumed the same cells to express NO-GC under control conditions and active Cre recombinase in SMC-GCKO colon. Thus, this work hypothesizes NO-GC to be involved in the regulation of mucosal renewal. Deletion of NO-GC likely increases Gremlin1 generation and/or secretion, leading to altered mucosal renewal and finally resulting in adenoma development.

In the era of knowledge-based economy, the knowledge is the most important thing for all corporations. How to manage and use the knowledge to strengthen their competitiveness is significant. The study company is the first probiotic factory of passing GMP verification in Taiwan. The experience of GMP verification is very good for the other companies and the whole probiotic industry; therefore it is worthwhile to study more deeply. In this study, there are many important factors to make the GMP system be established successfully. And the experience is valuable, it makes the case company take the lead in probiotic industry, and helps the case company extend its international marketing rapidly. This study showed us that GMP could help health food industry raise the competitiveness effectively.

Techn. Universiẗat, Diss., 2006--München.

CERQUEIRA, João Batista Gadelha de. Identificação dos mecanismos envolvidos no relaxamento da musculatura lisa cavernosa e da aorta de coelho, induzido por doadores de óxido nítrico do complexo nitrosil-rutênio. 2008. 125 f. Tese (Doutorado em Cirurgia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2008. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-03-18T12:40:46Z No. of bitstreams: 1 2008_teses_jbgcerqueira.pdf: 1166899 bytes, checksum: 80812fd9e68a5a052d30380374a26a1a (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-03-18T12:41:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_teses_jbgcerqueira.pdf: 1166899 bytes, checksum: 80812fd9e68a5a052d30380374a26a1a (MD5) / Made available in DSpace on 2014-03-18T12:41:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_teses_jbgcerqueira.pdf: 1166899 bytes, checksum: 80812fd9e68a5a052d30380374a26a1a (MD5) Previous issue date: 2008 / Endothelial dysfunction makes 56% of patients with erectile dysfunction decline treatment with PDE-5 inhibitors. New forms of treatment are necessary for this group of patients. The present study evaluates the relaxation in vitro induced in rabbit corpus cavernosum smooth muscle and aortic rings by sodium nitroprusside (SNP) and by two new NO-donor substances of the nitrosyl-ruthenium complex: Rut-Byp and Rut-Caf. Tissues immersed in isolated baths of Krebs-Henseleit solution (37oC; pH 7.4) were precontracted with 1uM phenylephrine (PE). Relaxation concentration/response curves were plotted for all concentrations (10-12 to 10-4 M). To explore the mechanisms involved in induced relaxation, the following substances were added: 3µM, 10µM, 30µM or 100µM ODQ (soluble guanylate cyclase-specific inhibitor), 3µM or 10 µM oxyhemoglobin (extracellular NO scavenger), 1 mM L-cysteine (nitrosyl anion-specific scavenger), 100µM hydroxycobalamin (NO free radical scavenger), glibenclamide (ATP-dependent potassium channel blocker), iberiotoxin (medium and high-conductance potassium channel blocker) and apamin (low-conductance potassium channel blocker). The tissue samples were frozen in liquid nitrogen in order to quantify GMPc and AMPc produced during relaxation. All the substances tested produced a significant level of relaxation in the aortic vascular endothelium. Similar results were found for corpus cavernosum smooth muscle, with the exception of Rut-Byp (Emax 30%). In this tissue, Rut-Caf e SNP induced dose-dependent relaxation with a potency (pEC50) of 4.2 and 5.2, and a maximum effect (Emax) of 100% and 80%, respectively. All substances acted through the activation of soluble guanylate cyclase (sGC); therefore, the addition of 100µM ODQ inhibited the relaxation effect completely in all cases. Oxyhemoglobin reduced relaxation induced by all substances. At 3µM, the maximum effect (Emax) was reduced by 26% on the average, and at 10µM the effect was reduced by another 50% (p<0.05), though not completely neutralized. L-cysteine failed to affect relaxation, but hydroxycobalamin abolished Rut-Caf-induced relaxation in aortic rings (Emax: 112% vs 10%; p<0.005). A significant reduction was observed in corpus cavernosum smooth muscle relaxation, though not as intense as in aortic rings. The addition of glibenclamide to the baths increased the potency of Rut-Caf significantly (4.09 vs. 7.9; p<0.005) with no significant change in maximum effect. Potency and maximum effect remained unchanged with the other ion channel blockers. The agents released cGMP in both tissues studied. NO-donor substances of the nitrosyl-ruthenium complex were shown to be potent vasodilators. One substance (Rut-Caf) induced significant relaxation in animal corpus cavernosum. The substances tested in the study act through the activation of soluble guanylate cyclase producing intracellular GMPc. During relaxation they release NO and its free radical intracellularly, but not nitrosyl. They do not act directly upon potassium ion channels. Rut-Caf acts independently of the endothelial integrity. / Disfunção endotelial provoca 56% de resistência ao tratamento da disfunção erétil pelos inibidores da PDE-5. Novas formas de tratamento são necessárias para este grupo de pacientes. O estudo avaliou o relaxamento, in vitro, induzido por novas substâncias doadoras de óxido nítrico (NO) do complexo nitrosil-rutênio (Rut-Byp, Rut-Caf) na musculatura lisa de corpos cavernosos humanos e de coelho e em anéis de aorta de coelho e do nitroprussiato de sódio (SNP). Os tecidos, imersos em sistemas de banhos isolados em solução de KHS (pH 7,4; 37oC), foram pré-contraídos com fenilefrina (PE;1uM) e curvas de concentração-resposta (10-12M a10-4M) foram obtidas. Para esclarecer o mecanismo de ação envolvido no relaxamento induzido pelos agentes, foram adicionadas aos banhos as substâncias: ODQ (3µM, 10µM, 30µM e 100µM), inibidor da guanilatociclase solúvel; oxi-hemoglobina (3µM e 10µM), removedor extracelular do NO; L-cisteína (100µM), removedor intracelular do ânion nitroxil; hidroxicobalamina (100µM), removedor de radical livre do NO; glibenclamida, bloqueador de canais de íons potássio ATP-dependente (KATP); iberiotoxina, bloqueador de canais de potássio de alta e média condutividade (KCA); apamina, bloqueador de canais de potássio de baixa condutividade (KCA). Amostras dos tecidos foram congeladas em nitrogênio líquido para mensurar a quantidade de GMPc e AMPc produzido no relaxamento. Todas as substâncias provocaram relaxamento estatisticamente significante da musculatura lisa dos anéis de aorta. Na musculatura lisa cavernosa, só Rut-Byp não conseguiu induzir relaxamento significativo (efeito máximo= 30%). Neste tecido a Rut-Caf e SNP provocaram relaxamento dose-dependente, com efeito máximo de 80% e 100% e pEC50 4,2 e 5,2, respectivamente. Todas substâncias mostraram atividade mediante a ativação da enzima guanilatociclase solúvel (GCs), pois a adição do ODQ 100µM aos banhos, inibiu totalmente o efeito relaxante. A oxi-hemoglobina em anéis de aorta de coelho na dose de 3µM, diminuiu o efeito máximo das substâncias em média 26% e, na dose de 10µM, houve uma redução adicional de 50% (p<0,05). A L-cisteína falhou em alterar o relaxamento induzido pelos agentes estudados. A hidroxicobalamina em anéis de aorta e em corpo cavernoso de coelho aboliu o efeito relaxante da Rut-Caf (Efeito máximo: 112% x 10%; p<0,005). A adição de glibenclamida em corpos cavernosos de coelho aumentou a potência da substância Rut-Caf (4,09 x 7,9; p<0,005), sem alterar o efeito máximo. Não houve alteração de potência ou efeito máximo das substâncias com a adição de outros bloqueadores de canais de íons. A remoção do endotélio não alterou a potência e o efeito máximo da substância Rut-Caf em anéis de aorta de coelho. As substâncias liberaram GMPc em maior intensidade no corpo cavernoso do que em anéis de aorta. As substâncias doadoras de NO do complexo nitrosil-rutênio são potentes vasodilatadores e uma delas (Rut-Caf), demonstrou relaxamento significativo no tecido cavernoso animal e humano. As substâncias atuam ativando a enzima guanilatociclase solúvel produzindo GMPc, liberam NO e radical livre do NO durante o relaxamento, mas não o ânion nitrosil. Os agentes não atuam diretamente nos canais de íons potássio. A substância Rut-Caf atua independentemente da integridade endotelial.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2004. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 95-101).