Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 1998. / Spine title: Regulation of rat LH genes by GnRH. Includes bibliographical references (p. 145-154). Also available online through Digital Dissertations.

In 1971 Schally and co-workers (Schally et al., 1971) isolated gonadotropin-releasing hormone (now called luteinizing hormone-releasing hormone (LH-RH)) from sheep hypothalami and established that the hormone was a decapeptide with the amino acid sequence: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂. The peptide was subsequently synthesised (Matsuo et al., 1971b) and shown to stimulate the release of gonadotropins (luteinizing hormone and follicle-stimulating hormone) in a wide range of mammalian species (Schally et al., 1973, 1976). With the exception of amphibians, nonmammalian vertebrates have a poor gonadotropin response to synthetic mammalian LH-RH (for reviews, see Ball, 1981; Jackson, 1981; King and Millar, 1981a). Since there is considerable molecular heterogeneity in the related neurohypophysial nonapeptide hormones (oxytocin-vasopressin) amongst vertebrates (Acher et al., 1972), we postulated that differences might exist in the structure of hypothalamic LH-RH in different vertebrate classes, Utilising a combination of regionspecific antisera and chromatographic techniques, we established that amphibian hypothalamic LH-RH is identical to the mammalian peptide while avian, reptilian, and piscine hypothalamic LH-RHs differ structurally in the region Gly⁶-Leu⁷-Arg⁸ (King and Millar, 1979a, 1980), We have now conducted further studies on avian hypothalamic LH-RH, which indicate that the arginine residue in position eight of mammalian LH-RH is substituted by glutamine in this vertebrate class. Purification of LH-RH from chicken hypothalami and determination of the amino acid composition have confirmed that the structure of avian LH-RH is: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Gln-Pro-Gly-NH₂.

The existence of an ultrashort feedback mechanism regulating GnRH secretion has been supported from in vivo and in vitro studies. However, the complex synaptic connections of GnRH neurons with other neural elements made it difficult to determine whether the regulation was mediated by direct actions on the GnRH neurons or through actions on other interneurons. The recent development of the GnRH-secreting neuronal cell line, GT1, provided a model system for the study of neural regulation of a pure population of GnRH neurons. The present studies utilized GT1 -7 cells to investigate whether GnRH (at the level of the nerve terminal) influences the control of its own release. Preliminary studies determined the presence of GnRH mRNA in GT1-7 cells and established a cell culture system for the analysis of secretagogue-induced GnRH release. In this system GnRH release was shown to be spontaneous and was enhanced by the addition of K⁺, L-GLU, forskolin and PMA. Furthermore, K⁺- and forskolin-induced GnRH release was dependent on extracellular Ca²⁺. For the analysis of an ultrashort feedback mechanism, GT1-7 cells were cultured in 6-well plates to near confluence and then incubated in serum-free medium in the presence (1 nM- 1 μM) or absence of GnRH antagonist, Ant 27. Basal, K⁺-and forskolin-induced secretion of GnRH was monitored with antiserum 1076 which does not cross-react with Ant 27 at> 1 μM. Ant 27 treatment increased basal, K⁺- and forskolin-stimulated GnRH release in a dose-dependent manner. Total content was unaffected by 18 h treatment of GT1-7 cells with Ant 27. This suggests that the effects of Ant 27 are at the level of release and not biosynthesis. The presence of GnRH binding sites in the cells was demonstrated with ¹²⁵I-GnRH analog. These findings support the concept that GnRH, acting via autoreceptors, negatively controls its own release.

Gonadotropin releasing hormone (GnRH) is a key reproductive hormone in vertebrates and exerts its effects via the GnRH receptor (GnRHR) to result in the synthesis and release of the gonadotropin hormones in the pituitary gonadotrope cells. GnRHR expression is likely to be regulated in a tissue- and cell- specific manner. A variety of hormones, including GnRH itself, estrogen, progesterone, inhibin, and testosterone have been shown to regulate GnRHR expression. Steroidogenic Factor-1 (SF-1), a member of the orphan nuclear receptor transcription factor family, regulates the expression of both the gonadotropin hormones in the pituitary and the steroidogenic enzymes in the gonads and adrenal gland, and provides a potential molecular mechanism for coordinate control of reproductive function. SF-1 binds to a gonadotrope-specific element (GSE) in the promoters of the gonadotropin hormones. Our studies involved investigating whether SF- I plays a role in tissue-specific regulation of GnRHR gene expression. A genomic clone of the mouse GnRHR gene contains a putative SF- I site at about -15 relative to the translation start site. We demonstrate the presence of a factor with SF-1-like DNA-binding activity in the gonadotrope cell lines, αT3-1 and αT4, by gel retardation assays. DNasel footprinting reveals that the major DNA-binding activity in αT3-1 cells on the GnRHR promoter occurs at the SF-1-like site. The SF-1-like sequence specificity of the interaction is demonstrated by gel redardation and DNasel footprinting assays using specific and mutated oligonucleotides as competitors. Northern blot analysis suggests that GnRHR expression is not solely dependent on the presence of SF-1, as αT4 cells do not express GnRHR but a SF-1 transcript is seen in these cells. Promoter function was analysed by constructing plasmids containing 563 bp of the GnRHR gene 5' to the ATG translation start site linked to a luciferase reporter gene, followed by transfection of these constructs into different cell lines. In addition, a mutant construct containing a mutated SF-1 site was tested. We demonstrate that this 563 bp of the GnRHR gene contains strong promoter activity in both pituitary gonadotrope (αT3-1) and somatotrope (GH₃) cells, but not in non-pituitary (COS-1) cells. Thus promoter activity appears to be tissue specific but not gonadotrope specific. The presence of a mutated SF-1 site in the 563 bp GnRHR gene fragment did not significantly effect the promoter activity, showing that binding of SF-1 protein to this site is not necessary for high levels of GnRHR expression in the pituitary gonadotropes.

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2003. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains vi, 187 p. : ill. (some col.). Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 156-183).

Thesis (M.S.)--University of Florida, 2004. / Typescript. Title from title page of source document. Document formatted into pages; contains 176 pages. Includes Vita. Includes bibliographical references.

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Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die brunststimulierende Wirkung des synthetisch hergestellten Gonadorelin[5-His, 6-Asp, 7-Trp, 8-Lys] (International Nonproprietary Name: Peforelin), das in dem Präparat Maprelin® XP10 enthalten ist, bei abgesetzten pluriparen Sauen zu prüfen. Im ersten Versuchsabschnitt wurde die zweckmäßige Dosierung ermittelt. Im zweiten Versuchsabschnitt wurde die Wirkung von Maprelin® XP10 mit der einer eCG- und einer Placebobehandlung verglichen. Die Bedingungen waren für die Versuchstiere in beiden Versuchsabschnitten homogen (etwa vierter Wurf, Säugezeit vier Wochen, Brunstkontrolle zweimal täglich in Anwesenheit eines geschlechtsaktiven Ebers, zweimal täglich sonographische Ovaruntersuchung, duldungsorientierte Besamung einmal täglich). In der Dosisfindungsstudie, in die 88 Tiere einbezogen wurden, erwies sich die Dosierung von 150 µg Peforelin, 24 Stunden nach dem Absetzen appliziert, als zweckmäßig zur Brunststimulation. Andere getestete Varianten (100 µg 24 Stunden, 150 µg 0 Stunden, 150 µg 48 Stunden, 187,5 µg 24 Stunden, 255 µg 24 Stunden nach dem Absetzen) waren hierzu weniger geeignet. In der Untersuchung zur klinischen Wirksamkeit wurden die 313 einbezogenen Tiere in drei Gruppen aufgeteilt und erhielten 24 Stunden nach dem Absetzen pro Tier 150 µg Peforelin (Gruppe I), 800 IE eCG (Gruppe II) oder 2 ml physiologische NaCl-Lösung als Placebo (Gruppe III). Zur Befunderhebung an den Ovarien wurden die Tiere zweimal täglich sonographisch untersucht. Die Östrusrate nach der Peforelin-Behandlung war derjenigen nach eCG-Injektion gleichwertig (95,1 bzw. 96,3 %), beide waren der Placebobehandlung signifikant überlegen (80,6 %). In die weiteren Auswertungen wurden nur Tiere mit Brunstbeginn bis zum siebten Tag nach dem Absetzen einbezogen. Das Absetz-Östrus-Intervall betrug 100,5, 94,2 bzw. 104,1 Stunden in den Gruppen I, II bzw. III. In der Brunstdauer und dem Intervall vom Östrusbeginn bis zur Ovulation unterschieden sich die drei Gruppen nicht. Die durchschnittliche Follikelgröße war in allen drei Gruppen zum Zeitpunkt des Absetzens 4 mm und zum Zeitpunkt der ersten Duldung 6 mm. Die Ovulationen fanden sowohl nach eCG als auch nach Maprelin® XP10 zwischen dem Mittag des sechsten (13.00 h) und der Nacht des siebten Tages (1.00 h) nach dem Absetzen statt. Bei der sonographischen Trächtigkeitsuntersuchung in der vierten Woche post inseminationem waren 100,0, 99,0 bzw. 97,6 % in den Gruppen I, II bzw. III positiv. Die Trächtigkeitsrate betrug 96,9, 97,1 bzw. 91,6 % in den Gruppen I, II bzw. III. Die Abferkelrate ergab 92,2, 93,4 und 73,8 % in den Gruppen I, II und III. Das Abferkelergebnis war in allen drei Gruppen gleich (11,7, 12,0 bzw. 11,6 insgesamt geborene Ferkel in den Gruppen I, II bzw. III). Es wurde eine negative Korrelation zwischen der Dauer des Absetz-Östrus-Intervalls und der Brunstdauer bzw. dem Intervall vom Östrusbeginn bis zur Ovulation nachgewiesen. Darüber hinaus korrelierten die Brunstdauer und das Intervall Östrusbeginn bis Ovulation positiv miteinander. In allen drei Gruppen stand die Follikelgröße bei der ersten Duldung in positiver Korrelation mit der Länge des Absetz-Östrus-Intervalls. Nach längerer Säugezeit kamen die Sauen tendenziell und in der Gruppe I signifikant früher in die Brunst als nach kürzerer Laktation. Weitere überprüfte potentielle Einflussfaktoren hatten weder auf den Brunsteintritt noch auf die erzielten Wurfgrößen oder andere Parameter Auswirkungen. Mit der vorliegenden Untersuchung wurde erstmals die Wirksamkeit des synthetisch hergestellten Peforelin zur Brunststimulation bei abgesetzten pluriparen Sauen nachgewiesen. Inwieweit das Präparat für diese Indikation auch bei primiparen Sauen oder Jungsauen wirksam eingesetzt werden kann, bleibt weiteren klinischen Prüfungen vorbehalten.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Este trabalho tem por objetivo avaliar mulheres portadoras de endometriose em uso de anÃlogos de GnRH investigando o metabolismo Ãsseo e massa Ãssea atravÃs da dosagem de marcadores sÃricos e realizaÃÃo de ultra-sonometria do calcÃneo, respectivamente. Trata-se de estudo observacional transversal tipo caso â controle prospectivo. Foi desenvolvido na Maternidade-Escola Assis Chateaubriand (MEAC) â UFC. Foram avaliadas 99 mulheres, divididas em 3 grupos, sendo 32 portadoras de endometriose diagnosticada cirurgicamente e tratadas com goserelina 3,6mg SC a cada 28 dias (4 doses) â grupo endometriÃtico. O segundo grupo foi composto de 25 mulheres nÃo endometriÃticas e no menacme (controle negativo). O terceiro grupo foi composto de 42 mulheres nÃo endometriÃticas e menopausadas por no mÃnimo dois anos, os dois Ãltimos grupos sem uso de medicaÃÃes. Foi realizada avaliaÃÃo Ãssea atravÃs da ultra-sonometria do calcÃneo com o aparelho Achilles, da LunarÂ, sendo determinado o âstiffnessâ de cada grupo (uma combinaÃÃo de velocidade do som e grau de atenuaÃÃo ultra-sonogrÃfica), juntamente com as dosagens sÃricas de magnÃsio, fosfato, urÃia, creatinina, cÃlcio, fosfatase alcalina (FA), PTH, cortisol e hidroxiprolina, alÃm das dosagens de cÃlcio urinÃrio, cÃlcio urinÃrio/creatinina, e hidroxiprolina/creatinina. O grupo endometriÃtico somente foi submetido a esta avaliaÃÃo apÃs o uso da medicaÃÃo. A anÃlise estatÃstica foi realizada pelo programa SPSS for Windows 11.0.0. As dosagens de FA, cÃlcio urinÃrio e cÃlcio urinÃrio/creatinina foram semelhantes no grupo endometriÃtico (40,8Â7,7U/mL; 47,15Â10,8mmol/L; e 78,76Â23,0, respectivamente) e no grupo menopausado (38,65Â5,1U/mL; 36,8Â4,3mmol/L; e 55,21Â8,21, respectivamente) alÃm de significativamente superiores aos do grupo no menacme (28,5Â2,54U/mL; 26,4Â3,4mmol/L; e 39,52Â7,7, respectivamente). As dosagens de PTH do grupo endometriÃtico (23,99Â3,35nmol/L) foram semelhantes as das mulheres no menacme (29,15Â4,09nmol/L), ambas sendo significativamente menores que as mulheres menopausadas (41,14Â3,7nmol/L). As demais anÃlises foram semelhantes entre os grupos. Na avaliaÃÃo Ãssea o âstiffnessâ foi similar entre o grupo endometriÃtico (88,16Â2,86) e as mulheres menopausadas (83,70Â1,8), sendo ambos significativamente inferiores Ãs mulheres no menacme (97,02Â1,46). Conclui-se que as portadoras de endometriose apÃs tratamento com goserelina apresentaram intenso metabolismo Ãsseo e piora no padrÃo do tecido Ãsseo avaliada pela ultra-sonometria do calcÃneo aproximando-se do quadro encontrado em mulheres menopausadas hà pelo menos dois anos. NÃo se pode afirmar, no entanto, se tais alteraÃÃes sÃo devidas exclusivamente ao uso do anÃlogo do GnRH ou somam-se à prÃpria manifestaÃÃo da endometriose. Sugere-se que a endometriose e o uso de anÃlogos do GnRH sejam considerados como fatores de risco para o desenvolvimento de osteoporose, principalmente se associados a uma histÃria de uso crÃnico de corticÃides a qualquer Ãpoca da vida. / This research had as an objective of evaluate endometriotic women treated with GnRH analogues by investigating their bone turnover and bone structure using serum bone turnover markers and calcaneous ultrasonometry, respectively. This is a transversal, observational, prospective caseâcontrol study. It was developed at Maternidade-Escola Assis Chateaubriand (MEAC) â UFC. Ninety nine women, divided into three groups were analyzed. Thirty two endometriotic women were treated with goserelin 3,6mg SC 28/28d (4 doses) â Endometriotic group. Their disease had been confirmed by surgery. The second group had twenty five non endometriotic women and having menses (control group). The third group had 42 not endometriotic menopausal women, they were at menopause at least for 2 years. The latest two groups were not taking any treatment. The Achilles device from Lunar, had being used to analyse the bone structure through calcaneous ultrasonometry. We calculated the âstiffnessâ value for each group (a combination of sound velocity and ultrasonographic attenuation), and we also analysed the values of magnesium, phosphate, urea, creatinine, serum calcium, alkaline phosphatase (ALP), parathyroid hormone (PTH), cortisol, hydroxyproline, urinary calcium, urinary calcium/creatinine, and hydroxyproline/creatinine. The endometriotic group was evaluated only after the treatment. The statistical analysis had being done by SPSS program for Windows version 11.0.0. The values of ALP, urinary calcium and urinary calcium/creatinine were similar to endometriotic group (40.8Â7.7U/mL; 47.15Â10.8mmol/L; and 78.76Â23.0, respectively) and to menopausal group (38.65Â5.1U/mL; 36.8Â4.3mmol/L; and 55.21Â8.21, respectively) although significantly higher than control group (28.5Â2.54U/mL; 26.4Â3.4mmol/L; and 39.52Â7.7, respectively). The values of PTH from endometriotic group (23.99Â3.35nmol/L) were similar to control group (29.15Â4.09nmol/L), and both were significantly lower than menopausal one (41.14Â3.7nmol/L). The other values were equal between groups. At the evaluation of bone âstiffnessâ the values were similar between endometriotic (88.16Â2.86) and menopausal groups (83.70Â1.8), and both were significantly lower than control group (97.02Â1.46). Concluding the endometriotic women who received treatment with goserelin showed an intense bone metabolism and a bone deficit at calcaneous ultrasonometry almost like women at post-menopausal at least two years. Therefore, we can not affirm if these alterations were caused exclusively by the GnRH-analogue therapy or were influenciated by endometriosis itself. We suggest that endometriosis and treatment with GnRH analogues might be considered as risks factors for the development of osteoporosis, principally if they are associated with chronic corticoid treatment at any point in a lifetime.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die brunststimulierende Wirkung des synthetisch hergestellten Gonadorelin[5-His, 6-Asp, 7-Trp, 8-Lys] (International Nonproprietary Name: Peforelin), das in dem Präparat Maprelin® XP10 enthalten ist, bei abgesetzten pluriparen Sauen zu prüfen. Im ersten Versuchsabschnitt wurde die zweckmäßige Dosierung ermittelt. Im zweiten Versuchsabschnitt wurde die Wirkung von Maprelin® XP10 mit der einer eCG- und einer Placebobehandlung verglichen. Die Bedingungen waren für die Versuchstiere in beiden Versuchsabschnitten homogen (etwa vierter Wurf, Säugezeit vier Wochen, Brunstkontrolle zweimal täglich in Anwesenheit eines geschlechtsaktiven Ebers, zweimal täglich sonographische Ovaruntersuchung, duldungsorientierte Besamung einmal täglich). In der Dosisfindungsstudie, in die 88 Tiere einbezogen wurden, erwies sich die Dosierung von 150 µg Peforelin, 24 Stunden nach dem Absetzen appliziert, als zweckmäßig zur Brunststimulation. Andere getestete Varianten (100 µg 24 Stunden, 150 µg 0 Stunden, 150 µg 48 Stunden, 187,5 µg 24 Stunden, 255 µg 24 Stunden nach dem Absetzen) waren hierzu weniger geeignet. In der Untersuchung zur klinischen Wirksamkeit wurden die 313 einbezogenen Tiere in drei Gruppen aufgeteilt und erhielten 24 Stunden nach dem Absetzen pro Tier 150 µg Peforelin (Gruppe I), 800 IE eCG (Gruppe II) oder 2 ml physiologische NaCl-Lösung als Placebo (Gruppe III). Zur Befunderhebung an den Ovarien wurden die Tiere zweimal täglich sonographisch untersucht. Die Östrusrate nach der Peforelin-Behandlung war derjenigen nach eCG-Injektion gleichwertig (95,1 bzw. 96,3 %), beide waren der Placebobehandlung signifikant überlegen (80,6 %). In die weiteren Auswertungen wurden nur Tiere mit Brunstbeginn bis zum siebten Tag nach dem Absetzen einbezogen. Das Absetz-Östrus-Intervall betrug 100,5, 94,2 bzw. 104,1 Stunden in den Gruppen I, II bzw. III. In der Brunstdauer und dem Intervall vom Östrusbeginn bis zur Ovulation unterschieden sich die drei Gruppen nicht. Die durchschnittliche Follikelgröße war in allen drei Gruppen zum Zeitpunkt des Absetzens 4 mm und zum Zeitpunkt der ersten Duldung 6 mm. Die Ovulationen fanden sowohl nach eCG als auch nach Maprelin® XP10 zwischen dem Mittag des sechsten (13.00 h) und der Nacht des siebten Tages (1.00 h) nach dem Absetzen statt. Bei der sonographischen Trächtigkeitsuntersuchung in der vierten Woche post inseminationem waren 100,0, 99,0 bzw. 97,6 % in den Gruppen I, II bzw. III positiv. Die Trächtigkeitsrate betrug 96,9, 97,1 bzw. 91,6 % in den Gruppen I, II bzw. III. Die Abferkelrate ergab 92,2, 93,4 und 73,8 % in den Gruppen I, II und III. Das Abferkelergebnis war in allen drei Gruppen gleich (11,7, 12,0 bzw. 11,6 insgesamt geborene Ferkel in den Gruppen I, II bzw. III). Es wurde eine negative Korrelation zwischen der Dauer des Absetz-Östrus-Intervalls und der Brunstdauer bzw. dem Intervall vom Östrusbeginn bis zur Ovulation nachgewiesen. Darüber hinaus korrelierten die Brunstdauer und das Intervall Östrusbeginn bis Ovulation positiv miteinander. In allen drei Gruppen stand die Follikelgröße bei der ersten Duldung in positiver Korrelation mit der Länge des Absetz-Östrus-Intervalls. Nach längerer Säugezeit kamen die Sauen tendenziell und in der Gruppe I signifikant früher in die Brunst als nach kürzerer Laktation. Weitere überprüfte potentielle Einflussfaktoren hatten weder auf den Brunsteintritt noch auf die erzielten Wurfgrößen oder andere Parameter Auswirkungen. Mit der vorliegenden Untersuchung wurde erstmals die Wirksamkeit des synthetisch hergestellten Peforelin zur Brunststimulation bei abgesetzten pluriparen Sauen nachgewiesen. Inwieweit das Präparat für diese Indikation auch bei primiparen Sauen oder Jungsauen wirksam eingesetzt werden kann, bleibt weiteren klinischen Prüfungen vorbehalten.