Memoria para optar al título Profesional de Ingeniero Agrónomo Mención: Agroindustria / La granada es uno de los frutos comestibles más antiguos que existe y es ampliamente cultivado en países tropicales y subtropicales, además posee una gran diversidad genética. A pesar de su alta presencia en el mundo, no hay suficiente información respecto a las propiedades de este fruto. Sin embargo, algunas investigaciones recientes han destacado los compuestos bioactivos presentes en la granada y sus efectos benéficos para la salud. Por otra parte, la Universidad de Chile ha efectuado una selección de clones que está evaluando a fin de compararlos con la variedad Wonderful que se encuentra a escala comercial. En este contexto, el objetivo del proyecto fue evaluar el efecto de dos zonas de cultivo sobre las características físicas, químicas y sensoriales de los frutos de la variedad Wonderful y del clon UCH-AZA. Se evaluaron características físicas externas e internas del fruto, químicas y fenólicas del jugo y, además la calidad y aceptabilidad de los arilos. Algunos parámetros medidos corresponden a los siguientes: rendimiento de arilos (%) y jugo (%), sólidos solubles (ºBrix), acidez (% ac. cítrico), relación ss/acidez, fenoles totales (mg Equivalente Ácido Gálico L-1), antocianos totales (mg L-1) y capacidad antioxidante (FRAP). Existieron diferencias significativas entre las localidades en varios de los parámetros medidos, no obstante gran parte de estos se vieron afectados por la interacción presente entre los factores (localidad y variedad). Cuando existieron interacciones, se dejó fijo el factor variedad para evaluar más claramente el efecto localidad. En el análisis estadístico se aplicó ANDEVA y comparación de rangos múltiples de DUNCAN. De este análisis fue posible determinar que los frutos provenientes de la localidad de Vicuña tuvieron un alto rendimiento de arilos, rendimiento de jugo, sólidos solubles, contenido de antocianos, taninos, fenoles y consecuentemente una alta capacidad antioxidante. Esta última no tuvo una gran variación entre el clon UCH-AZA y la variedad Wonderful, si hubo una variación en el contenido de antocianos totales siendo 317,14 y 591,76 mg L-1 para el clon UCH-AZA y la variedad Wonderful, respectivamente. En cambio, en los fenoles totales los valores fueron similares entre el clon UCH-AZA y la variedad Wonderful, siendo superiores a 861,1 mg EAG L-1 . En las condiciones de este estudio la localidad influye positivamente sobre las características físicas, químicas, fenólicas y sensoriales de las granadas, siendo superiores en Vicuña la mayoría de los parámetros medidos. / Pomegranate (Punica granatum) is one of the most ancient edible fruits, being widely cultivated in tropical and subtropical countries, having a great genetic diversity. However, in despite of its prevalence around the world, there is insufficient knowledge regarding the properties of this fruit. Some research has recently highlighted the presence of bioactive compounds in pomegranates and their positive health effects. Researches done in University of Chile are evaluating a selection of clones, among them UCH-AZA, in order to compare with the commercial CV. Wonderful. The objective of this study was to evaluate the physical, chemical and sensory characteristics of CV. Wonderful and UCH-AZA clone cultivated in two locations of Chile (Curacaví and Vicuña). The study evaluated the inner and external physical characteristics of the fruit, the chemical and phenolic composition of the juice, as well as the quality and acceptability of the arils. The parameters measured were, aril and juice yields (%), soluble solids content (ºBrix), titratable acidity (% citric acid), soluble solids/acidity ratio, total phenolics (mg EAG L-1), total anthocyanins (mg L-1), and antioxidant capacity (FRAP). Significant differences were observed in several parameters, depending on the variety and the location. Interaction between variety and location was also observed. When such interactions appeared, the factor variety was fixed in the statistical analysis to clearly evaluate the effect of the location. ANDEVA and DUNCAN were used in the statistical analysis. These analyses allowed determining that the fruit from Vicuña had a relatively high aril and juice yield as well as high soluble solids content, anthocyanin, tannin, and phenolic content, and consequently a high antioxidant capacity. The last parameter did not show differences among the UCH-AZA clone and the CV. Wonderful, however there was a difference in total anthocyanins being 317.14 and 591.76 mg L-1 for the UCH-AZA clone and the CV. Wonderful, respectively. The total phenolics content were similar for both varieties, being higher than 861.1 mg EAG L-1 . Based upon the conditions of this study it was determined that the location had the strongest influence on the physical, chemical, phenolic, and sensory characteristics of pomegranates, being higher a great number of the parameters measured in the fruit produced in Vicuña.

Memoria para optar al título profesional de Ingeniero Agrónomo / Se evaluaron tres métodos de control del golpe de sol en granado (Punica granatum L.): aplicación de caolín, sombreamiento con malla y envoltura de frutos con cambuchos de papel. El estudio fue realizado en la localidad de Huechún, Provincia de Chacabuco Región Metropolitana, Chile. Se utilizaron 56 árboles a los que se les aplicaron 7 tratamientos (dos de aplicación de caolín en distintas dosis y fechas; sombreamiento con malla hasta la cosecha y hasta dos semanas antes de cosecha; envoltura individual de frutos con cambuchos de papel hasta la cosecha y hasta dos semanas antes de cosecha; y un tratamiento testigo), cada uno con cuatro repeticiones de dos árboles por unidad experimental. Durante la temporada se midió la temperatura superficial de frutos con un termómetro infrarrojo y se registró la temperatura y la radiación solar a través de una estación meteorológica durante los cuatro meses del ensayo. Al momento de la cosecha se evaluó la totalidad de los frutos en cada tratamiento determinando el número de frutos con daño por golpe de sol y agrupándolos en tres categorías de daño: leve (suave pardeamiento de la superficie), medio (fuerte pardeamiento de la superficie) y severo (ennegrecimiento de la superficie), y evaluando la presencia de residuos de caolín en frutos. Se obtuvo una muestra de 16 frutos por tratamiento para la medición de color con un colorímetro y se realizó una medición de profundidad del daño en una muestra de 20 frutos por categoría de daño. Para la determinación de la viabilidad económica de cada tratamiento se efectuó un estudio costo-beneficio.

Tesis para optar al título profesional de Ingeniero Agrónomo y al grado de Magíster en Ciencias Agropecuarias mención Producción Frutícola / Con el objetivo de determinar el efecto de la carga frutal en el tamaño promedio de los frutos y la productividad en un huerto de granados, se realizó un estudio en granados ‘Wonderful’ en dos localidades de Chile: Huechún (33° 07' 19,55'' S y 70° 48' 04,13'' O), Provincia Chacabuco, Región Metropolitana, y Cerrillos de Tamaya (30° 34' 5,78'' S; 71° 24' 36,74'' O), Provincia Limarí, Región de Coquimbo. En ambos casos se utilizaron 20 plantas, sobre las cuales se raleó manualmente un porcentaje de los frutos, con el objetivo de lograr un amplio espectro de carga frutal. En el primer año se calculó la el área de sección transversal ejes (ASTE); en el segundo año se ASTE y la fracción de radiación fotosintéticamente activa interceptada (PARf) para cada planta del ensayo; la carga frutal y la cosecha se determinó con respecto de los parámetros anteriormente mencionados. La productividad fue función de la carga frutal, en todas sus formas de expresión, con altos coeficientes de determinación para las regresiones lineales. El aumento de la carga frutal fue negativo sobre el tamaño de los frutos, independiente de sus formas de expresión. / In order to analyze the effect of crop load on the average fruit size and on the yield in pomegranate orchards, a study was conducted in 'Wonderful' pomegranates during two season, at two different locations in Chile: Huechún (33 ° 07 '19, 55'' S and 70 ° 48 '04.13'' W), Chacabuco Province, Region Metropolitana and Cerrillos de Tamaya (30 ° 34' 5.78'' S; 71 ° 24 '36.74'' W), Limarí Province, Coquimbo Region. In both cases, 20 plants were selected and submitted to a wide range of crop load, by hand thinning. Branch cross sectional area (BCSA) was calculated for both seasons. Additionally, the fraction of photosynthetically active radiation intercepted (PARf) for each plant were calculated during the second season; crop load, as a function of the above mentioned parameters was determined at harvest. Yield was found to be a direct function of the crop load for all expressions used in this work, having high determination coefficients for the linear between them. The increase of crop load was invertetly related to fruit size, for all expression of crop load.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4922_1.pdf: 2350753 bytes, checksum: 6f3d3de384154b6467e73089c613aff1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2002 / A Natureza é uma fonte de substâncias bioativas e pericarpo de Punica granatum Linn. (romã) tem sido usado em medicina popular. Proteínas hemaglutinantes (lectinas) interagem seletivamente e reversivelmente com carboidratos e glicoconjugados. O objetivo deste trabalho foi o isolamento da lectina de pericarpo de P. granatum (PgPeL) e sua imobilização para produzir uma matriz de afinidade. Extrato de pericarpo de Punica granatum foi submetido a precipitação com sulfato de amônio e as frações obtidas foram avaliadas quanto a seus efeitos sobre aglutinação de eritrócitos (tipos humanos e de coelho). A fração sobrenadante 60% (SF60) mais ativa foi usada para avaliar a especificidade da lectina (carboidratos e glicoproteínas), a estabilidade térmica da proteína (30 a 100°C, 30 min ou 100°C, 60 min), o efeito de íons (Ca2+ e Mg2+) e pH (valores de 6,5 a 8,0) sobre a atividade hemaglutinante. PgPeL obtida após cromatografia da SF60 em coluna de Sepharose CL-6B (purificação de 10 vezes) foi imobilizada em Dacron ferromagnetizado (FMD); PgPeL-FMD foi aplicada para o isolamento de fetuína e ovoalbumina. SF60 aglutinou todos os eritrócitos humanos (título de 512-1) mas o melhor resultado foi obtido com células de coelho (título de 2048-1). A atividade de PgPeL não foi estimulada por íons divalentes e foi inibida por frutose, manose, caseína, fetuína, ovoalbumina como também por tiroglobulina. A mais alta atividade lectínica (pH 7,5) foi totalmente perdida em pH 8,0. PgPel foi ativa (título de 4-1) após aquecimento a 100°C. PgPeL imobilizada (87%) foi capaz de ligar fetuína (160 μg), mas ovoalbumina não foi retida. PgPeL-FMD pode ser usada para purificação de glicoproteínas sendo um método simples e rápido

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:13:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2646_1.pdf: 4881014 bytes, checksum: c2c2e45d96e51c21b4c76b3c12792f5d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Radiomodificadores são substâncias que podem se comportar como radioprotetores ou radiosensibilizadores. E ainda podem alterar o metabolismo e captação dos radiofármacos na biodistribuição, o que pode resultar em erros no diagnóstico em medicina nuclear. Muitos produtos naturais podem se comportar como radiomodificadores, e a Punica granatum L. (Romã) apresenta diversas características, como a capacidade antioxidativa, que a indica como um provável radiomodificador. Dessa forma, o presente trabalho teve o objetivo de avaliar a capacidade que a polpa da Romã possui em alterar a captação do tecnécio-99m (99mTc) na biodistribuição, e comparar se essa captação modifica frente a animais sadios e com Sarcoma 180, bem como em relação a forma que é administrada. Associado a estes aspectos, avaliar a capacidade antitumoral, antinflamatória e radioprotetora. Em todo os experimentos foram empregados camundongos machos Swiss. Os animais sadios, receberam a implantação do Sarcoma 180 na região subaxilar direita. A biodistribuição foi realizada 24 horas após o tratamento com a Punica granatum L., e os animais foram eutanasiados rapidamente após 30 minutos da administração do 99mTc. Os órgãos foram retirados para pesagem e contagem da radiação em contador gama. A atividade antitumoral foi analisada baseada no indice de inibição tumoral (TWI). A avaliação antinflamatória foi realizada empregando o modelo da carragenina para provocar a ação inflamatória. E para avaliação do aspecto radioprotetor foi utilizada a dosagem da glutationa reduzida (GSH) após irradiação com cobalto-60 (60Co). Os resultados obtidos destacam-se pela possibilidade de demonstrar a ação da polpa de uma fruta tão exótica e de grande emprego pela população nordestina, resaltando que sua atividade pode ser modificada dependentemente da presença do câncer, e da sua forma de administração. Na biodistribuição foi demonstrado que a polpa da romã, nos animais que não tinham tumor, reduziu a captação do 99mTc apenas no intestino grosso e estomago, enquanto aumentou a captação na tireóide. Em animais com sarcoma 180, que foram tratados após a implantação do tumor ocorreu redução significativa da captação na grande maioria dos órgãos. Mas, nos animais que foram tratados antes e após a implantação do Sarcoma 180, ocorreu aumento da captação no pulmão, coração, pâncreas, estômago, tireóide e tumor. Estes resultados demonstram a capacidade que a polpa da romã possui em alterar a biodistribuição nos tecidos. A polpa da romã também apresentou atividade antitumoral, antinflamatória e provável ação radioprotetora decorrente da elevação dos níveis de GSH nos animais irradiados

For several centuries, Punica granatum L. has been utilized in traditional medicine to treat various ailments including diabetes, diarrhea, and parasitic and microbial infections. Current scientific research suggests that the unique phytochemical composition of the botanical is largely responsible for the range of biological activities demonstrated by the different components of P. granatum L. The objective of this study was to evaluate the effects of the fruit extract of P. granatum L. on the following parameters of skin health: facial wrinkle severity, sebum production, transepidermal water loss, melanin index, and erythema index. The hypothesis was that oral pomegranate supplementation improves the facial appearance of wrinkles and the biophysical properties of the skin because of the well-studied antioxidant and anti-inflammatory properties of the phytochemicals in the fruit extract. A prospective, double-blind, placebo-controlled study was conducted in which subjects were supplemented daily with a punicalagin-enriched oral pomegranate extract for four weeks. The study was performed at Integrative Skin Science and Research (Sacramento, California, USA) and included 18 healthy males and females, aged 25–55 years, who were asked to restrict the intake of other polyphenolic-rich foods. A facial image collection and analysis system was used to assess the facial appearance of wrinkle severity, and standardized, noninvasive tools were used to collect information on facial sebum production, transepidermal water loss, melanin index, and erythema index. In addition, self-reports of quality of life and digestive health were collected from the subjects. These parameters were assessed at pretreatment baseline and after four weeks of oral supplementation. The results showed statistically significant reductions in the melanin index of the cheeks (p < 0.01), transepidermal water loss from the stratum corneum of the cheeks (p < 0.01), and facial appearance of average wrinkle severity (p < 0.01). Furthermore, a significant reduction was found in facial transepidermal water loss among females of the intervention group (p < 0.01). No adverse effects were reported over the four weeks of the study. In conclusion, this study demonstrated an improvement in several biophysical properties of the skin with oral pomegranate extract supplementation. As a result, oral pomegranate extract could be used as an effective agent for the maintenance of skin appearance and skin health.

‘Wonderful’ pomegranate flowering and fruiting habits are not well understood. Characterizing any relationship between flowering habit and fruit size and quality could lead to effective cultural practices for producing high-value fruit. Five mature ‘Wonderful’ pomegranate trees were monitored every 5-14 days throughout the 2015 growing season. Newly emerged flowers were tagged and characterized with respect to sex (determined by ovary shape and style length at anthesis), clustering habit, age of wood on which floral buds were borne, and direction of wood growth. More than 1,100 hermaphroditic flowers were identified and ovary/fruit diameter was recorded throughout the season. In addition to tagging 1,800 staminate flowers at anthesis, approximately 14,000 abscised staminate flowers were collected and used to estimate total flower number and the ratio of hermaphroditic (fruit producing) to staminate flowers. Trees were strip picked at harvest. Fruit weight, maximum hemispheric diameter and exocarp color were recorded. Arils (seeds with a fleshy seed coat) were removed and weighed; aril number was estimated from the weight of 100 arils, and aril titratable acidity and total soluble solids were measured. The age of wood on which flowers were borne was a significant predictor of flower sexual condition. One-year-old wood produced the highest number of flowers (70% of total) with the smallest proportion of hermaphroditic flowers (5%) for any age of wood. Two-year-old wood produced fewer flowers (19% of total) with 10% hermaphroditic flowers. Wood that was greater than two years old produced 10% of total flowers and 20% were hermaphroditic. Overall, 93% of the flowers were staminate. Despite the low proportion of hermaphroditic flowers produced on one-year-old wood, 57% of marketable sized fruit were produced on one-year-old wood. There were three distinct bloom periods, the first lasting approximately 6 weeks. Bloom time was highly predictive of fruit quality. Late-blooming flowers produced low-quality fruit that were smaller in diameter with fewer arils and poor exocarp color. Such fruit accounted for approximately 13% of total fruit weight. Location within the canopy influenced fruit diameter significantly. Flowering rarely occurred in the typically “closed” interior of the canopy and flowers in the northwest tree quadrant were less likely to be early blooming or hermaphroditic than flowers in other quadrants. The results suggest that development of cultural methods that limit excessive production of staminate flowers reduce late-season flowering and/or fruit production and/or increase light exposure to fruiting wood could increase the production of high-value fruit for ‘Wonderful’ pomegranate.

A tecnologia de impressão para incorporação do princípio ativo tem se mostrado promissora para o desenvolvimento de filmes para liberação oral. Estudos mostram que esta técnica foi eficiente na incorporação de fármacos sintéticos, entretanto pode ser interessante avaliar a possibilidade do uso desta técnica para incorporação de extratos naturais, devido as diversas atividades farmacológicas que eles podem apresentar. Dentre as fontes naturais, a romã (Punica granatum L.) tem se destacado pelo seu potencial antioxidante, anti-inflamatório e antimicrobiano. Este trabalho teve como objetivo avaliar as diferentes partes da Punica granatum L. como fonte de compostos ativos e analisar a possibilidade do uso da técnica de impressão para incorporação destes compostos em substratos para liberação oral. A extração dos compostos ativos foi avaliada para as diferentes partes da romã (casca, folha, mesocarpo e semente) em relação ao rendimento de sólidos solúveis totais, concentração de compostos fenólicos e flavonoides. O melhor extrato foi concentrado em rotaevaporador e avaliado em relação aos parâmetros importantes para uma solução de impressão (tensão superficial e viscosidade). Para utilização como substrato foram avaliados filmes à base de carboximetilcelulose (CMC), hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) e blenda (CMC:HPMC - 1:1) produzidos pela técnica de tape-casting e papel comestível comercial. O extrato foi impresso utilizando uma impressora jato de tinta (L375, EPSON). Os substratos foram impressos com diferentes números de camada (1 à 4 camadas de impressão) e caracterizados em relação ao conteúdo de água, cor, pH de superfície, microscopia eletrônica de varredura e de força atômica, tempo de desintegração, concentração de compostos fenólicos, liberação in vitro, cinética de liberação, espectroscopia de infravermelho, difração de raio-X e estabilidade dos compostos fenólicos. A melhor extração foi obtida do mesocarpo, utilizando-se a temperatura de 70 ºC, tempo de 30 min e solução hidroalcoólica com 70% de álcool. Observou-se que os extratos obtidos do mesorcarpo (sem e com concentração) apresentaram intervalos de valores de tensão superficial e viscosidade dentro dos valores observados na literatura para impressora, entretato o extrato obtido do mesocarpo com remoção de 40% de solvente apresentou maior concentração de compostos fenólicos e por isso foi utilizado como solução de impressão. Analisando os substratos, observou-se que os filmes obtidos por tape-casting apresentaram maior tensão na ruptura, elongação e módulo elástico que o papel comestível comercial. Adicionalmente, os extratos apresentaram boa afinidade com os substratos testados. Os filmes à base de HPMC e blenda de CMC:HPMC não foram utilizados para impressão por curvarem rapidamente após serem retirados da placa, visto que essa deformação impediu que passassem pela cabeça de impressão sem serem danificados. Em relação aos filmes impressos, observou-se que o aumento do número de camadas aumentou a concentração de compostos fenólicos, possibilitando a produção sob demanda, de acordo com a necessidade individual. Não houve variação do pH de superfície e o tempo de desintegração do papel comestível comercial foi superior aos filmes à base de carboximetilcelulose. A liberação dos compostos foi influenciada pelo substrato utilizado e o lado de exposição (lado sem impressão e lado impresso). Os compostos fenólicos foram estáveis nos filmes no intervalo de 196 dias. Desta forma, pode-se concluir que a técnica de impressão pode ser utilizada para incorporação dos compostos fenólicos extraídos do mesocarpo da romã. / Printing technology for incorporation of the active compounds has shown promise for the development of oral release films. Studies show that this technique was efficient in the incorporation of synthetic drugs, however it may be interesting to evaluate the possibility of using this technique to incorporate natural extracts, due to the various pharmacological activities that they can present. Among the natural sources, pomegranate (Punica granatum L.) has been highlighted by its antioxidant, anti-inflammatory and antimicrobial potential. This work aimed to evaluate the different parts of Punica granatum L. as a source of active compounds and to analyze the possibility of using the printing technique to incorporate these compounds into substrates for oral release. The extraction of the active compounds was evaluated for different parts of the pomegranate (bark, leaf, mesocarp and seed) in relation to the yield of total soluble solids, concentration of phenolic compounds and flavonoids. The best extract was concentrated in a rotavaporator and evaluated in relation to the parameters important for a printing solution (surface tension and viscosity). Films based on carboxymethylcellulose (CMC), hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) and blend (CMC: HPMC - 1: 1) produced by the tape-casting technique and commercial edible paper were evaluated for use as substrate. The extract was printed using a piezoelectric inkjet printer (L375, EPSON). The substrates were printed with different numbers of layers (1 to 4 printing layers) and characterized in relation to water content, color, surface pH, scanning and atomic force electron microscopy, disintegration time, phenolic compound concentration, release in vitro, release kinetics, infrared spectroscopy, X-ray diffraction and stability of phenolic compounds. The best extract was obtaind from the mesocarp, using the extraction temperature of 70ºC, time of 30 min and hydroalcoholic solution with 70% ethyl alcohol. It was observed that the extracts obtained from the mesorcarp (without concentration and with different percentages of concentration) presented ranges of values of surface tension and viscosity within the values observed in the literature for printer, and the extract with removal of 40 % of solvent present hither concentration of phenolic compounds and therefore was used as print solution. By analyzing the substrates, it was observed that the films obtained by tape-casting had a higher tension in the rupture, elongation and elastic modulus than commercial edible paper. In addition, the extracts showed good affinity with the substrates tested. HPMC-based films and blends (HPMC:CMC) were not used for printing by bending rapidly after being removed from the plate as this deformation prevented them from passing through the print head without being damaged. In relation to the printed films, it was observed that the increase in the number of layers also increased the concentration of phenolic compounds, allowing the production on demand, according to the individual needs. There was no variation of the surface pH and the disintegration time of the commercial edible paper was higher than the carboxymethylcellulose based films. The release of the compounds was influenced by the substrate used and the exposure side (unprinted side and printed side). The phenolic compounds were stable in the films within the 196 day. In this way, it can be concluded that the printing technique can be used to incorporate the phenolic compounds extracted from the mesocarp of the pomegranate.

Despite therapeutic advances, opportunistic fungal infectious diseases have increased in prevalence and have become a universal public health problem. Candida albicans (CA) is a commensal fungus that under certain environmental conditions can act as an opportunistic pathogen and colonize mucous membranes and tissues causing local and systemic infections. The emergence of drug resistant strains, as well as the increase of immunosuppressed patients, has limited therapeutic options. Therefore the aim of this study was to evaluate 1) The antifungal activity of Punicalagin (P), alone or in combination with Nystatin (N), against two CA strains. 2) The cytotoxicity effect of P and N, as well as the combination of both, on human primary cells. In the first step, yeasts of CA ATCC 90028 and SC5314 were exposed to P and N for 24 hours. The Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of P (50 g/mL) and N (3.9 g/mL) were determined by the broth microdilution assay. The Checkerboard Assay was performed to verify the synergism between the combinations (8: PN, P8 N/4, P/8 N/2, P/8 N, P/4 N/2, P/4 N, P/2 N/4 and P/2 N/2), which were selected from the 56 combinations initially tested. The fungal metabolism was assessed by the metabolic reduction assay XTT (24h) and Minimum Microbicidal Concentration (MMC) was determined by Colony-forming unit (CFU/mL, 24h). The evaluation of virulence factors gene expression was amplified and quantified by PCR real time (Polymerase Chain Reaction-RT-qPCR, only for P/8 N/4 in 24h). The analysis of proteins related to essential biological processes of the fungus was performed by LC-MS/MS (24h). MIC and MMC of P were significantly reduced in the presence of N, indicating synergism between both. Once the antifungal potential of P was verified, we proposed to evaluate whether this drug acts through the same mechanism of action of N, altering the permeability of the cell membrane of the fungus (binding ergosterol). The evaluation of gene expression has demonstrated upregulation of some genes that may be related to a defense mechanism associated with stress or cell death. The proteomics analysis revealed alterations in the expression of several proteins in the fungi exposed to P/8 N/4 in relation to negative control, correlated with important biological processes, such as, energy metabolism, stress response, drug metabolism, among others. In the second step, cytotoxicity assays involving P and N, as well as the combination of both, were undertaken on human palate epithelial cells (HPEC) and human gingival fibroblasts cells (HGF) by Alamarblue dye. Similarly, P cytotoxicity was reduced when used in combination with N. Based on these in vitro results, the synergistic antifungal activity produced between P and N suggested that the combination of drugs, at the concentrations tested, may be a topical therapeutic or preventive alternative to be used in cases of superficial candidiasis, such as denture stomatitis. / Apesar dos avanços terapêuticos, doenças infecciosas por fungos oportunistas têm aumentado em prevalência e tornaram-se um problema universal de saúde pública. Candida albicans (CA) é um fungo comensal que, sob certas condições ambientais, pode atuar como um patógeno oportunista e colonizar mucosas e tecidos causando infecções locais e sistêmicas. O surgimento de cepas resistentes às drogas convencionalmente utilizadas, assim como aumento de pacientes imunodeprimidos, tem limitado as opções terapêuticas. Portanto o objetivo deste estudo foi avaliar: 1) a atividade antifúngica de Punicalagina (P), com ou sem a associação de Nistatina (N), contra duas cepas de CA. 2) O efeito citotóxico de P e N, assim como suas combinações, em culturas primárias humanas de células epiteliais de palato (CEPH) e de fibroblastos gengivais (FGH). Na primeira etapa, leveduras de CA ATCC 90028 e SC5314 foram expostas a P e N, por 24 horas. As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) de P (50 g/mL) e N (3,9 g/mL) foram determinadas pelo método de diluição em caldo. O Ensaio Checkerboard foi realizado para verificar o sinergismo entre as combinações (8: PN, P8 N/4, P/8 N/2, P/8 N, P/4 N/2, P/4 N, P/2 N/4 e P/2 N/2), as quais foram selecionadas a partir de 56 combinações inicialmente testadas. O metabolismo fúngico foi avaliado pelo método do XTT (24h) e a Concentração Mínima Microbicida (CMM) foi realizada através de Unidades formadoras de colônias (UFC/mL, 24h). A avaliação da expressão gênica de fatores de virulência foi amplificada e quantificada por PCR em tempo real (Reação em Cadeia da Polimerase-RT-qPCR, apenas para P/8 N/4 em 24h). A análise proteômica para identificação de proteínas alteradas foi realizada por LC-MS/MS (24h). A MIC e MMC de P foram significativamente reduzidas na presença de N, indicando sinergismo entre ambas. Confirmado o potencial antifúngico, o Ensaio de mecanismo de ação (teste do ergosterol) foi realizado e não foi confirmada a ação de P através da ligação ao ergosterol. A avaliação da expressão gênica demonstrou regulação positiva de alguns genes que pode estar relacionado a um mecanismo de defesa associado ao estress ou a morte celular. A análise proteômica revelou proteínas diferencialmente expressas nos fungos expostos a P/8 N/4 em relação ao controle negativo (sem tratamento), as quais estão relacionadas ao processo de metabolismo energético, resposta ao estress e metabolismo de drogas, dentre outros. Na segunda etapa, CEPH e FGH foram expostas a P e N e suas combinações por 24h para realização dos ensaios de viabilidade por Alamarblue. Combinada à N, a Punicalagina apresentou-se menos citotóxica do que de forma isolada. Com base nesses resultados in vitro, o sinergismo antifúngico produzido entre P e N sugere que a combinação das drogas pode ser uma alternativa terapêutica tópica para ser utilizada nos casos de candidose localizada, como por exemplo, a estomatite protética.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-22Bitstream added on 2014-06-13T20:01:18Z : No. of bitstreams: 1 werkman_c_dr_sjc.pdf: 10285491 bytes, checksum: 01c6d6c66160e4dd0d380e7874948436 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Embora diversos estudos já tenham sido realizados sobre a Punica granatum L., seus possíveis efeitos citotóxicos não são bem conhecidos. No presente trabalho foi avaliada a toxicidade da Punica granatum L. (PG) por meio de cultura celular com duas linhagens: fibroblastos humanos de mucosa oral (FLM) e células de carcinoma epidermóide oral humano (KB). As células foram submetidas ao teste de viabilidade celular por 24 horas em placas de 96 poços nas concentrações da PG (1%, 0,5%, 0,25%, 0,125%, 0,062% e 0,031%) e aos testes de citotoxicidade celular em placas de 24 poços, em cinco períodos diferentes (4 horas, 1, 3, 5 e 7 dias) e com quatro diferentes concentrações (1%, 0,5%, 0,25%, 0,062%). Todos os testes foram realizados em triplicata e em três momentos diferentes. Foram adicionados dois grupos, um controle negativo (Tryton 10%) e um controle positivo constituído de meio de cultura acrescido de soro bovino fetal 10% e sem o extrato de PG. A quantificação celular foi realizada pelo método do Resazurin, com avaliação por espectrofotometria óptica (espectrofotômetro UVM340 - Asys Hitech GmbH) e leitura de absorbância dos comprimentos de onda de 570 nm a 600 nm. Os dados obtidos foram submetidos à ANOVA (5%). Os resultados de viabilidade mostraram que nas concentrações de 0.031%; 0,062%; 0,125%; 0,25% e 0,05% o extrato de PG inibiu a viabilidade celular (≥ 40%) principalmente das células KB. O teste de citotoxicidade mostrou que apenas as culturas tratadas com PG a 0,062% exibiram citotoxicidade para as linhagens celulares. A PG a 1% foi tóxica para as células FLM e KB. O extrato de PG inibiu a citotoxicidade celular nas demais concentrações testadas. Estes resultados podem ser relacionados a propriedade anticarcinogênica da Punica granatum L. / Several studies have been conducted on Punica granatum L., but their cytotoxic effects are not well known. The purpose of this study was to evaluate the cytotoxicity of Punica granatum L. extract (PG) in two cell lines: human oral mucosa fibroblasts (FLM) and cells of human oral squamous cell carcinoma (KB). The cells were analized to viability on 24 h using different concentrations of PG (1%, 0.5%, 0.25%, 0.125%, 0.062% and 0.031%) and to cell proliferation in five different periods (4 h, 1, 3, 5 and 7 days) using four different concentrations of PG (1%, 0.5%, 0.25%, 0.062%). All tests were performed in triplicate and in three different times. There were a negative control (Tryton 10%) and a positive control (culture medium plus 10% SBF, without PG extract). Cell quantification was performed by the Resazurin method, with evaluation by optical spectrophotometry (spectrophotometer UVM340 - Asys Hitech GmbH) and measure of absorbance at a wavelength of 570 nm to 600 nm. Data were submitted to ANOVA (5%). The results showed inhibition of cell proliferation in 0,031%, 0.062%, 0.125%, 0.25% and 0.05% concentrations of PG extract (≥ 40%) specialty to KB cells in comparison to FLM cells. PG 1% was toxic to KB and FLM cells. The proliferation test showed cell proliferation only when using PG 0,062%, for both cell lines and inhibited proliferation whith all other PG concentrations. These effects might be related to the anticarcinogenic properties of PG.