Les télomères sont les extrémités des chromosomes et sont protégés par le complexe shelterin pour ne pas être reconnus comme des cassures accidentelles d'ADN double brin. Un enjeu majeur dans la recherche sur les télomères est de comprendre comment l'intégrité des extrémités des chromosomes au cours de l'oncogenèse est modifiée. La perte de répétitions télomériques à chaque division cellulaire peut être compensée par l’activité de l’enzyme télomérase qui ajoute "de novo" des motifs télomériques. Bien que la télomérase soit surexprimée dans la majorité des cellules cancéreuses, l’impact de modifications des protéines shelterin qui coiffent les télomères dans le processus oncogénique n'est pas clair. Dans la première étude, nous avons analysé l'état des télomères de patients atteints de la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) uniquement au stade précoce de la LLC, stade A de Binet. La LLC est une leucémie commune aux pays occidentaux et se développe chez les personnes âgées. Nous avons montré que la majorité des patients atteints de la maladie présente des télomères dysfonctionnels. Les dommages télomériques ne corrèlent pas avec la longueur des télomères ou le statut mutationnel des patients, mais corrèlent avec la faible expression des protéines télomériques TIN2 et TPP1. Dans la seconde étude, nous avons montré que l'expression de l'oncogène H-RasV12 confère une résistance accrue vis-à-vis des télomères dysfonctionnels et aucun défaut de croissance n’est observable lorsque TRF2, une protéine télomérique est inhibée. Cet effet dépend de l'expression de l'interleukine 6 (IL-6), révélant un rôle inattendu de cette cytokine dans la fonction des télomères. De plus, la co-inhibition de TRF2 et IL-6 dans les cellules RasV12 conduit à blocage G2 / M associé à une séparation des chromatides sœurs. Ces résultats suggèrent que l'induction de la tumorigénicité par l’oncogène Ras protège les télomères contre les dommages et que la ségrégation des chromosomes est dépendante de TRF2 et IL-6. / Telomeres protect the chromosome extremities from being repaired and recognized as accidental DNA breaks double-strand. A major issue in telomere research is to understand how systems monitoring the integrity of chromosomes ends change during oncogenesis. Although telomerase overexpression occurs in the majority of cancer cells, whether other types of telomere changes play roles in the oncogenic process is unclear. In the first study, we analyzed the status of telomeres in patients with early stage Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL), which is a common leukemia in Western countries that develops in the elderly. We showed that the majority of CLL patients exhibit telomeric dysfunction. It does not correlate with telomere length or mutation status of patients, but correlates with low expression of telomeric proteins TIN2 and TPP1. In the second study, we showed that expression of the H-RasV12 oncogene confers increased resistance to telomere uncapping and protects against to growth defects when TRF2, a telomeric protein, is depleted. This effect depends upon the expression of interleukin 6 (IL-6), revealing an unexpected role for this cytokine in telomere function. Notably, the co-inhibition of TRF2 and IL-6 in RasV12 cells led to G2/M block associated with an increased incidence of premature sister chromatid separation. These findings suggest that the induction of a tumorigenic state by oncogenic Ras protects against telomere damage and chromosome segregation defects in TRF2-compromised cells through an increase of IL-6 expression

Sabe-se há décadas que mutações nos genes ras estão presentes em cerca de 20% dos cânceres humanos, mas o desenvolvimento de terapias eficazes para o tratamento de câncer dependente dos oncogenes ras permanece um desafio científico importante. Nesse contexto, o nosso grupo publicou recentemente resultados interessantes mostrando que FGF2 exógeno ou PMA, contrariamente à expectativa geral, inibem a proliferação de células de camundongo malignas dependentes dos oncogenes H- ou K-Ras. Para dar continuidade a estes estudos o projeto desta tese foi planejado para investigar os mecanismos subjacentes a possíveis efeitos citotóxicos de FGF2 e PMA em células humanas transformadas por ras. Para esse fim, a linhagem humana imortalizada HEK 293 foi condicionalmente transformada pela expressão ectópica da construção quimérica de DNA ER:H-rasV12, que codifica a oncoproteína de fusão ER:H-RasV12, cuja atividade é induzível por 4-hidroxi-tamoxifen (4OHT). Essa abordagem nos permitiu verificar os efeitos de FGF2 e PMA em sublinhagens HEK/ER:HrasV12 fenotipicamente \"normais\" ou transformadas por níveis crescentes da oncoproteína H-RasV12. Os principais resultados mostraram que tanto FGF2 como PMA tem efeito dual promovendo ou inibindo a proliferação das células transformadas em função da concentração intracelular crescente de H-RasV12. Ensaios de crescimento de colônias em suspensão de agarose mostraram que: a) as células parentais HEK293 não desenvolveram colônias mesmo quando tratadas com FGF2 ou PMA, resultados que estão de acordo com seu fenótipo não tumoral; b) mas, as sublinhagens HEK/ER:HrasV12 deram origem a colônias mesmo quando tratadas com concentrações pequenas de 4OHT, que condicionaram níveis intracelulares baixos de ER:HRasV12; nestas condições experimentais, FGF2 foi um forte promotor do crescimento de colônias, condizente com sua reconhecida atividade promotora do crescimento de células tumorais em suspensão; ainda nestas condições, PMA não teve efeito significante sobre o crescimento de colônias; c) coerentemente, concentrações elevadas de 4-OHT levaram aos níveis intracelulares mais altos de ER:HRasV12 e, por conseguinte, a desenvolvimento máximo de colônias de células HEK/ER:HrasV12, no entanto, nestas condições, ambos FGF2 e PMA inibiram completamente o crescimento de colônias. Por outro lado, transformação de HEK293 com um vetor de expressão constitutiva de HrasV12 levou à seleção e isolamento das sublinhagens tumorais HEK/HrasV12, cujo fenótipo se caracterizou por: a) nenhum efeito de FGF2 sobre a sua proliferação e b) forte inibição de sua proliferação por PMA. A ação citotóxica de PMA exclusivamente observada em células HEK 293 transformadas por H-rasV12 se caracterizou por: a) total dependência de PKC, provavelmente mediada pela ativação proteolítica específica de PKC δ; b) envolvimento de níveis elevados e sustentados de ROS com disparo tardio de apoptose. / It is known for nearly 20 years that mutated ras oncogenes are found in 20% of human malignancies, however efficacious therapies are not yet available for Ras-driven cancer. Along of these lines, our group recently published provocative results showing, against common belief, that FGF2 and PMA inhibited proliferation of Ras-dependent malignant mouse cells. Aiming to gain insight into this intriguing phenomenon, the present thesis project was planned to investigate the possible cytotoxicity of FGF2 and PMA in human Ras-driven malignant cells. To this end an immortalized non-tumorigenic human cell line (HEK293) was stably transformed with the DNA construction ER:H-rasV12, which encodes the fusion protein ER:H-RasV12, whose activity requires activation by 4-hidroxitamoxifen (4-OHT). This approach allowed us to evaluate FGF2 and PMA effects on HEK/ER:HrasV12 sublines under switching from \"normal\" to transformed phenotypes upon 4-OHT induction. Our main results have shown that both FGF2 and PMA displayed dual effects promoting or inhibiting proliferation of HEK/ER:HrasV12 cells in function of ER:HRasV12 intracellular levels. Clonogenic assays in agarose suspension have shown: a) parental HEK293 line did not develop colonies under FGF2 and PMA treatment or not, in agreement with its non-tumorigenic nature; b) however, HEK/ER:HrasV12 sublines developed colonies even under low 4-OHT concentrations, which led to low ER:HRasV12 intracellular levels; under these conditions FGF2 strongly promoted colony growth and PMA had no effect; c) furthermore, in HEK/ER:HrasV12 sublines, elevated 4-OHT concentrations led to high ER:HRasV12 intracellular levels and maximal colony growth; but, under these experimental conditions both FGF2 and PMA abolished colony growth. On the other hand, HEK293 transformation with a vector that constitutively express HrasV12 yielded HEK/ER:HrasV12 sublines displaying the following phenotypic traits: a) non FGF2 effects on proliferation and b) severe proliferation inhibition by PMA. PMA toxicity, exclusively observed in HrasV12 -transformed HEK293 cells, was characterized by: a) total dependency on PKC, likely mediated by specific proteolytic activation of PKCδ; b) involvement of high and sustained ROS levels correlated with late apoptosis triggering.

Sabe-se há décadas que mutações nos genes ras estão presentes em cerca de 20% dos cânceres humanos, mas o desenvolvimento de terapias eficazes para o tratamento de câncer dependente dos oncogenes ras permanece um desafio científico importante. Nesse contexto, o nosso grupo publicou recentemente resultados interessantes mostrando que FGF2 exógeno ou PMA, contrariamente à expectativa geral, inibem a proliferação de células de camundongo malignas dependentes dos oncogenes H- ou K-Ras. Para dar continuidade a estes estudos o projeto desta tese foi planejado para investigar os mecanismos subjacentes a possíveis efeitos citotóxicos de FGF2 e PMA em células humanas transformadas por ras. Para esse fim, a linhagem humana imortalizada HEK 293 foi condicionalmente transformada pela expressão ectópica da construção quimérica de DNA ER:H-rasV12, que codifica a oncoproteína de fusão ER:H-RasV12, cuja atividade é induzível por 4-hidroxi-tamoxifen (4OHT). Essa abordagem nos permitiu verificar os efeitos de FGF2 e PMA em sublinhagens HEK/ER:HrasV12 fenotipicamente \"normais\" ou transformadas por níveis crescentes da oncoproteína H-RasV12. Os principais resultados mostraram que tanto FGF2 como PMA tem efeito dual promovendo ou inibindo a proliferação das células transformadas em função da concentração intracelular crescente de H-RasV12. Ensaios de crescimento de colônias em suspensão de agarose mostraram que: a) as células parentais HEK293 não desenvolveram colônias mesmo quando tratadas com FGF2 ou PMA, resultados que estão de acordo com seu fenótipo não tumoral; b) mas, as sublinhagens HEK/ER:HrasV12 deram origem a colônias mesmo quando tratadas com concentrações pequenas de 4OHT, que condicionaram níveis intracelulares baixos de ER:HRasV12; nestas condições experimentais, FGF2 foi um forte promotor do crescimento de colônias, condizente com sua reconhecida atividade promotora do crescimento de células tumorais em suspensão; ainda nestas condições, PMA não teve efeito significante sobre o crescimento de colônias; c) coerentemente, concentrações elevadas de 4-OHT levaram aos níveis intracelulares mais altos de ER:HRasV12 e, por conseguinte, a desenvolvimento máximo de colônias de células HEK/ER:HrasV12, no entanto, nestas condições, ambos FGF2 e PMA inibiram completamente o crescimento de colônias. Por outro lado, transformação de HEK293 com um vetor de expressão constitutiva de HrasV12 levou à seleção e isolamento das sublinhagens tumorais HEK/HrasV12, cujo fenótipo se caracterizou por: a) nenhum efeito de FGF2 sobre a sua proliferação e b) forte inibição de sua proliferação por PMA. A ação citotóxica de PMA exclusivamente observada em células HEK 293 transformadas por H-rasV12 se caracterizou por: a) total dependência de PKC, provavelmente mediada pela ativação proteolítica específica de PKC δ; b) envolvimento de níveis elevados e sustentados de ROS com disparo tardio de apoptose. / It is known for nearly 20 years that mutated ras oncogenes are found in 20% of human malignancies, however efficacious therapies are not yet available for Ras-driven cancer. Along of these lines, our group recently published provocative results showing, against common belief, that FGF2 and PMA inhibited proliferation of Ras-dependent malignant mouse cells. Aiming to gain insight into this intriguing phenomenon, the present thesis project was planned to investigate the possible cytotoxicity of FGF2 and PMA in human Ras-driven malignant cells. To this end an immortalized non-tumorigenic human cell line (HEK293) was stably transformed with the DNA construction ER:H-rasV12, which encodes the fusion protein ER:H-RasV12, whose activity requires activation by 4-hidroxitamoxifen (4-OHT). This approach allowed us to evaluate FGF2 and PMA effects on HEK/ER:HrasV12 sublines under switching from \"normal\" to transformed phenotypes upon 4-OHT induction. Our main results have shown that both FGF2 and PMA displayed dual effects promoting or inhibiting proliferation of HEK/ER:HrasV12 cells in function of ER:HRasV12 intracellular levels. Clonogenic assays in agarose suspension have shown: a) parental HEK293 line did not develop colonies under FGF2 and PMA treatment or not, in agreement with its non-tumorigenic nature; b) however, HEK/ER:HrasV12 sublines developed colonies even under low 4-OHT concentrations, which led to low ER:HRasV12 intracellular levels; under these conditions FGF2 strongly promoted colony growth and PMA had no effect; c) furthermore, in HEK/ER:HrasV12 sublines, elevated 4-OHT concentrations led to high ER:HRasV12 intracellular levels and maximal colony growth; but, under these experimental conditions both FGF2 and PMA abolished colony growth. On the other hand, HEK293 transformation with a vector that constitutively express HrasV12 yielded HEK/ER:HrasV12 sublines displaying the following phenotypic traits: a) non FGF2 effects on proliferation and b) severe proliferation inhibition by PMA. PMA toxicity, exclusively observed in HrasV12 -transformed HEK293 cells, was characterized by: a) total dependency on PKC, likely mediated by specific proteolytic activation of PKCδ; b) involvement of high and sustained ROS levels correlated with late apoptosis triggering.