Hintergrund und Fragestellung/Hypothese Trotz verbesserter Diagnose und Therapiestrategien in der Behandlung von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs (HNSCC) in den letzten Jahrzehnten liegt das 5-Jahres-Überleben der Patienten bei nur etwa 60 %. Die hohe Mortalität ist zurückzuführen auf eine hohe Rezidivrate nach Radio- und Radiochemotherapie. Experimentelle und klinische Daten zeigen in dieser Tumorentität eine häufige Dysregulation des PI3K/AKT-Signalweges, der an verschiedenen Resistenzmechanismen beteiligt ist. Die Zielmoleküle des Signalweges sind involviert in DNA-Reparatur, Reoxygenierung und Repopulierung. Aufgrund der bekannten Beteiligung des PI3K/AKT-Signalweges an diesen wichtigen radiobiologischen Resistenzmechanismen beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit folgenden Fragestellungen: 1. Charakterisierung des Aktivierungsstatus des PI3K/AKT-Signalweges in Korrelation mit radiobiologischen Parametern in HNSCC-Experimentaltumoren 2. Bestimmung der Wirksamkeit des selektiven PI3K-Inhibitors Bay 80-6946 in HNSCC-Zelllinien in vitro 3. Untersuchung der Wirksamkeit von Bay 80-6946 in einem Panel von HNSCC-Experimentaltumoren in vivo mit und ohne Bestrahlung sowie des Einflusses der PI3K-Inhibition auf radiobiologische Parameter Material und Methode/Ergebnisse 1. Charakterisierung des Aktivierungsstatus des PI3K/AKT-Signalweges in Korrelation mit radiobiologischen Parametern in HNSCC-Experimentaltumoren Für die vorliegende Untersuchung wurde auf Tumormaterial von sechs verschiedenen Plattenepithelkarzinomzelllinien (FaDu, SAS, XF354, UT-SCC-5, UT-SCC-14, UT-SCC-15) aus einer Biobank zurückgegriffen. Analysiert wurden Xenografttumoren, die mit 0, 3, 5 oder 10 Fraktionen bestrahlt worden waren. Die Aktivierung des PI3K/AKT-Signalweges wurde mittels Western Blot-Analyse untersucht. Die publizierten Daten der lokalen Tumorkontrolle nach 30 Fraktionen in sechs Wochen, der Pimonidazol hypoxischen Fraktion und der HIF-1α-Proteinexpression wurden mit der pAKT-Expression korreliert. In allen unbehandelten Tumoren konnte pAKT nachgewiesen werden, wobei sich eine intratumorale Heterogenität in der Expression zeigte. Unter fraktionierter Strahlentherapie konnte in dem Panel von sechs Tumorlinien keine einheitliche Aktivierung des PI3K/AKT-Signalweges nachgewiesen werden. Die Expression des endogenen Hypoxiemarkers HIF 1α korrelierte in unbehandelten Tumoren mit der pAKT-Proteinexpression. Kein Zusammenhang wurde zwischen dem Gehalt von pAKT und der Pimonidazol hypoxischen Fraktion sowie der lokalen Tumorkontrolle nach 30 Fraktionen in sechs Wochen gefunden. 2. Bestimmung der Wirksamkeit des selektiven PI3K-Inhibitors Bay 80-6946 in HNSCC-Zelllinien in vitro Die Experimente wurden an den humanen Plattenepithelkarzinomzelllinien Cal33, FaDu, UT-SCC-5 und UT-SCC-14 durchgeführt. In Proliferationsassays und weiteren Zellkultur-experimenten wurde der Effekt des selektiven PI3K-Inhibitors Bay 80-6946 auf die Proliferation, die Phosphorylierung von AKT sowie die Dauer des inhibitorischen Effektes untersucht. Das klonogene Zellüberleben wurde bestimmt, indem die Tumorzellen mit 0, 2, 4, 6 oder 8 Gy bestrahlt, 24 Stunden mit dem Inhibitor inkubiert und die entstandenen Kolonien nach 14 Tagen ausgezählt wurden. Eine deutliche Hemmung der Proliferation konnte an den Plattenepithelkarzinomzelllinien schon bei geringen Konzentrationen von Bay 80-6946 gezeigt werden. Die Zelllinie Cal33, welche eine bekannte PI3K Mutation besitzt, reagierte am empfindlichsten auf die Inhibition von PI3K, gefolgt von UT-SCC-14 und FaDu. Nach Inkubation mit 1 µM Bay 80 6946 konnte in keiner der drei Tumorlinien phosphoryliertes AKT nachgewiesen werden. Die Dauer der Inhibition hielt allerdings nur für die Dauer der Inkubation mit Bay 80-6946 an. Das klonogene Zellüberleben nach Bestrahlung wurde durch die Behandlung mit dem Inhibitor nicht signifikant verändert. 3. Untersuchung der Wirksamkeit von Bay 80-6946 in einem Panel von HNSCC-Experimentaltumoren in vivo mit und ohne Bestrahlung sowie des Einflusses der PI3K-Inhibition auf radiobiologische Parameter Die Wirksamkeit von Bay 80-6946 wurde in einer Gruppe von neun verschiedenen Kopf-Hals-Tumorlinien sowie zwei NSCLC-Tumorlinien untersucht (A549, Cal33, FaDu, GLF, H460, SAS, SAT, UT-SCC-5, UT-SCC-8, UT-SCC-14 und XF354). Experimenteller Endpunkt war die Tumorwachstumsverzögerung. Bay 80-6946 wurde insgesamt fünfmal im Abstand von 48 Stunden in einer Konzentration von 20 mg/kg KG intravenös injiziert. Die Behandlung begann bei einem Tumordurchmesser von 7 mm. In den drei Tumorlinien Cal33, FaDu und UT-SCC-5 wurde Bay 80-6946 zusätzlich zur Monotherapie auch in Kombination mit fraktionierter Bestrahlung untersucht. Diese Tumormodelle wurden ausgewählt, da sie die intertumorale Heterogenität im Ansprechen auf die alleinige PI3K-Inhibition widerspiegeln. Die Tiere wurden mit 5 x 2 Gy täglich (Gesamtdosis 10 Gy) bestrahlt. Bay 80-6946 wurde einmal wöchentlich in einer Konzentration von 20 mg/kg KG über einen Zeitraum von 29 Tagen verabreicht. Die Behandlung begann eine Woche vor der ersten Bestrahlungsfraktion. Aufgrund des verlängerten Gesamtbehandlungs-zeitraums begann die Behandlung bereits bei einem Tumordurchmesser von 4 mm. In allen Experimentalarmen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Tumoren entnommen und immunhistochemisch auf die radiobiologischen Parameter Hypoxie, Anzahl der Gefäße und Perfusion untersucht. Hinsichtlich der Wirksamkeit von Bay 80-6946 auf unbehandelte Plattenepithelkarzinome lassen sich drei Gruppen abgrenzen: starkes Ansprechen bei Cal33, intermediäres Ansprechen (SAS, UT-SCC-8, SAT, FaDu) und fehlendes Ansprechen (XF354, GLF, UT SCC-5, UT-SCC-14). Die NSCLC-Modelle A549 und H460 sprachen moderat auf Bay 80 6946 an. Bei der Kombinationstherapie von Bay 80-6946 mit fraktionierter Bestrahlung deutet sich bei Cal33 ein additiver und bei FaDu ein supraadditiver Effekt an. Bei UT-SCC-5 war in der Kombinationstherapie kein signifikanter Effekt auf das Tumorwachstum nachweisbar. Die immunhistochemischen Analysen zeigten in allen drei Tumorlinien weder bei der Mono- noch bei der Kombinationstherapie einen Einfluss des Inhibitors auf die Parameter Hypoxie, Anzahl der Gefäße und Perfusion im Vergleich zur Kontrolle. Schlussfolgerung Die in einem Panel von Experimentaltumoren gewonnen Daten unterstützen derzeit nicht den Einsatz von pAKT als Biomarker, um das Ansprechen auf eine fraktionierte Strahlentherapie vorherzusagen. Vielmehr scheinen die gewonnenen Ergebnisse im Einklang zu den kontroversen und teilweise inkonsistenten Daten anderer Arbeitsgruppen zu stehen. Somit sind trotz klarer radiobiologischer Rationale weitere methodische und translationale Untersuchungen zum potenziellen Stellenwert des AKT-Signalweges als prognostischer Biomarker für die Strahlentherapie von Kopf-Hals-Tumoren notwendig. Durch die Kombination einer fraktionierten Strahlentherapie mit einem selektiven PI3K-Inhibitior konnte in der vorliegenden experimentellen Arbeit ein deutlicher Effekt auf die Tumorwachstumsverzögerung von Kopf-Hals-Tumoren gezeigt werden. Das Ausmaß des Ansprechens unterschied sich jedoch zwischen den drei untersuchten Tumorlinien und wirft die Frage nach der Ursache dieser Variabilität auf. Vor dem Einsatz eines PI3K-Inhibitors unter fraktionierter Strahlentherapie sollte in weiteren Experimenten der zugrundeliegende Mechanismus der Strahlensensibilisierung geklärt werden. Als zentrale Mechanismen sollten dabei vertiefend der Einfluss der selektiven PI3K-Inhibition auf das Tumormikromilieu sowie die Beteiligung des PI3K-Inhibitors an der Reparatur strahleninduzierter Schäden untersucht werden.

An 100 Tumorproben mit HNSCC (head and neck squamous cell carcinoma) von 92 Patienten wurde mit Hilfe des FLAVINO-Assays erstmalig das Adhärenzverhalten von Plattenepithelzellen bei unterschiedlichen Beschichtungen untersucht und anschließend eine Ex-vivo-Chemoresponsetestung durchgeführt. Hierbei kamen als Beschichtungsproteine humanes Laminin [L], humanes Fibronektin [hFN], Kollagen I [K] aus Rattenschwänzen und eine vorteilhafte Mischung aus unterschiedlichen extrazellulären Proteinen [ECM] zur Anwendung. Zusätzlich wurde eine ECM-Platte noch mit 2,2 Gy einmalig bestrahlt. Ziel der Chemo-responsetestung war es, den Einfluss des Integrin-Inhibitor Cilengitide [Cil] auf HNSCC gegenüber den Standardtherapeutika Cisplatin [Cis], Docetaxel [DTX] und Cetuximab [Cetux] zu testen und letztendlich eine optimale Kombination zur Verbesserung der Prognose für HNSCC zu gewinnen. 41% der Tumorproben zeigten ein Koloniewachstum, wobei die höchste Koloniebildung auf der bestrahlten ECM-Beschichtung ausgezählt werde konnte, dicht gefolgt von der Kollagenbeschichtung. 10 µM Cil als Monotherapie konnten bei HNSCC eine Koloniereduktion von 23% erzielen, 66,6 µg/ml Cetux von 53% und beide in Kombination 55%. Cis als potente Monosubstanz in Verwendung 6,667 µM erzielten eine fast vollständige Koloniereduktion von 96%, wohingegen 550 nm DTX nur 66% Reduktion erreichten. In binärer, tertiärer und quartärer Kombination aller vier Chemotherapeutika ist nur eine komplette Koloniereduktion zu erreichen, wenn Cis in der Dosierung 6,667 µM verwendet wird. Cil in Kombination mit DTX, Cetux und Cis konnte nach zusätzlicher Bestrahlung eine 100%ige Koloniereduktion erreichen und kann somit als potenter Radiosensitizer angesehen werden.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression des Hedgehog Signaltransduktionsweges (Hh) in Kopf-Hals-Tumoren (Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC) im Vergleich zu gesunder Mukosa immunhistochemisch untersucht und quantitativ analysiert. Dabei wurde die Expressionsstärke mit Hilfe einer eigens weiterentwickelten objektiven Auswertungsmethode analysiert, die sich auf die Rot-Grün-Blau(RGB)-Farblehre stützte. Untersucht wurden histologisch gesicherte Proben von Kopf-Hals-Tumoren und gesunde Mukosa der Mundhöhle. Nach Färbung mittels spezifischen Immunfluoreszenzantikörpern gegen die Hedgehog Komponenten Sonic Hedgehog (SHH), Patched-1 (PTCH1), Patched-2 (PTCH2), Smoothened (SMO), Glioma-Associated Oncogene Homolog-1, -2 und -3 (Gli-1, Gli-2 und Gli-3) erfolgte die bildanalytische Auswertung der Fluoreszenzsignale. Dabei zeigte sich eine deutliche Überexpression aller Hh-Komponenten in den Tumorproben gegenüber der gesunden Mukosa. Die Expression des Transkriptionsfaktors Gli-1 erreichte dabei etwa zehnfach höhere Werte als in der Mukosa und die des Liganden SHH etwa vierfach höhere Werte. Die nachgewiesene Überexpression des Hh-Signalwegs in den Tumorproben deuten wir als potentiellen Kofaktor in der Genese von Kopf-Hals-Tumoren. Eine mögliche Bedeutung für neue zielgerichtete Therapieansätze in der Zukunft wird diskutiert.

Bei dieser Arbeit handelt es sich um eine retrospektive Studie bezüglich Inzidenz und Therapie von Mundhöhlen- und Oropharynxkarzinomen, welche in dem Zeitraum von 1993 bis 2009 in der HNO-Klinik der Universität Leipzig als „High Volume Center“ behandelt wurden, mit besonderem Augenmerk auf die Stadien III-IV nach UICC/AJCC. In unserer Studie konnten wir eine Zunahme der an der Universität in Leipzig registrierten Patienten mit Mundhöhlen- und Oropharynxkarzinomen über die Jahre 1993 bis 2009 verzeichnen. Männer waren mehr als fünfmal so häufig betroffen wie Frauen. Diese Verteilung hielt sich über den Beobachtungszeitraum konstant. Bei den weiblichen Patientinnen wurden im Durchschnitt niedrigere Tumorstadien bei Erstdiagnose festgestellt. Frauen hatten insgesamt eine höhere 5-Jahresüberlebensrate. Die Stadienverteilung nach UICC/AJCC bei Erstdiagnose eines Mundhöhlen- und Oropharynxkarzinoms blieb über die Jahre hinweg annähernd gleich. Es wurden meist hohe Stadien festgestellt (62,7% Stadium IV). Das mittlere Erkrankungsalter von Mundhöhlen- und Oropharynxkarzinomen sank über den Beobachtungszeitraum. Das Alter bei Rezidivmanifestation blieb allerdings über die Jahre gleich und lag unter dem durchschnittlichen Alter bei Erstdiagnosestellung. In diesem Zeitraum wird in der Literatur eine zunehmende Infektionsrate mit HPV beschrieben, welche gemäß der Literaturdaten mit einem jüngeren Erkrankungsalter einhergeht. Über die Jahre fanden wir in dem von uns untersuchten Patientenkollektiv der Universitätsklinik Leipzig eine stetige Verbesserung der mittleren Überlebensraten. In zeitlicher Assoziation zu dieser Entwicklung fand eine Änderung der Therapiemodalitäten insbesondere mit Einführung der systemischen Chemotherapie ab ca. 2004 in Richtung einer zunehmenden multimodalen Therapie statt. Es konnte ein Vorteil im Gesamtüberleben nach einer kombiniert-operativen Therapie mit adjuvanter Radiochemotherapie gegenüber allen anderen Therapieformen gezeigt werden. Insbesondere im Stadium IV nach UICC/AJCC zeigte sich ebenfalls ein Vorteil der kombinierten Radiochemotherapie gegenüber einer alleinigen Radiotherapie.

Aufgrund der heterogenen Tumorbiologie variiert der Therapieerfolg bei lokal fortgeschrittenen Plattenepithelkarzinomen stark, woraus ein mittleres 5-Jahres-Überleben dieser Patienten von etwa 50% resultiert. Um die Therapie besser an die Tumoreigenschaften anzupassen, muss die Therapieresistenz der Tumoren vor der Behandlung bestimmt werden. In dieser Dissertationsschrift werden Methoden aus dem Bereich des maschinellen Lernens angewandt um Genexpressionsdaten zu analysieren, um so Signaturen und Modelle zu erzeugen die eine Klassifizierung der Tumoren in verschiedene Risikogruppen bezüglich der loko-regionären Tumorkontrolle erlauben. Für Patienten, die mit postoperativer Radiochemotherapie behandelt wurden, konnte eine 7-Gen Signatur entwickelt und erfolgreich validiert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass verschiedene Signaturen ähnlich gut zur Patientenklassifizierung geeignet sein können. Daher wurde eine Methode vorgeschlagen, die es erlaubt verschiedene prognostiche Modelle zu kombinieren. Weiterhin wurden verschiedene genbasierte Biomarker zwischen verschiedenen Genexpressionsmessmethoden verglichen. In den resultierenden Patienteneinteilungen zeigten Biomarker, die auf Signaturen basieren, eine geringere Variabilität als Biomarker, die auf einzelnen Genen basieren.:Abbreviations VII Figures IX Tables XII 1 Introduction 1 2 Biological & Statistical Background 4 2.1 Head and Neck Squamous Cell Carcinoma 4 2.1.1 Tumorigenesis 4 2.1.2 Biomarkers 8 2.2 Statistics 14 2.2.1 Survival analysis 14 2.2.2 Model and data evaluation 18 2.2.3 Data sampling methods 22 2.3 Machine learning algorithms 23 2.3.1 Feature selection algorithms 24 2.3.2 Prognostic models 27 2.4 Gene expression measurement methods 30 2.4.1 Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) 31 2.4.2 nCounter® gene expression 32 2.4.3 In situ-synthesized oligonucleotide microarrays 32 3 Material and methods 35 3.1 Patient cohorts 35 3.1.1 Primary radiochemotherapy (pRCTx) cohorts 35 3.1.2 Postoperative radio(chemo)therapy (PORT-C) cohorts 36 3.1.3 Clinical endpoints 38 3.2 Gene expression analyses 39 3.2.1 HPV status 39 3.2.2 Immunohistochemical staining 39 3.2.3 RT-PCR measurements 40 3.2.4 nCounter® measurements 40 3.2.5 GeneChip® analyses (only training cohorts) 41 3.3 Machine learning framework 41 3.3.1 Pre-processing of gene expression data 41 3.3.2 Determination of the ensemble gene signature 42 3.3.3 Expanding the ensemble signature by highly correlated genes 43 3.3.4 Independent validation and patient stratification 45 4 Identification of gene expression signatures as prognostic biomarkers 46 4.1 Hypoxia classification 46 4.2 nCounter® gene expression based signatures 50 4.2.1 Patients treated with primary radiochemotherapy 50 4.2.2 Clinical Features 55 4.2.3 Signature extension using clinical features 64 4.2.4 Patients treated with postoperative radiochemotherapy 65 4.2.5 Signature extension using clinical features – Port-C 72 4.3 GeneChip® gene expression-based signatures 78 4.3.1 Pre-selection 78 4.3.2 Patients treated with primary radiochemotherapy 79 4.3.3 Patients treated with postoperative radiochemotherapy 87 4.4 Combined models for PORT-C 91 4.4.1 Creation of a consensus model 92 4.4.2 Consensus model based on 2 models 93 4.4.3 Consensus model based on more than 2 models 97 4.4.4 Discussion and summary of model combination 101 5 Stability of gene expression-based biomarkers 102 5.1 Reproducibility depending on time of nCounter® 102 5.2 Comparison of nCounter® and GeneChip® gene expression 106 5.2.1 Introduction 106 5.2.2 Correlation analyses 106 5.2.3 Model and biomarker transfer 108 6 Conclusion and outlook 123 Zusammenfassung 125 Summary 128 Appendix 130 A. Supplementary Figures 130 B. Supplementary Tables 133 Bibliography 147 Acknowledgements 188 Erklärungen 189 / Due to heterogeneous tumour biology, the treatment response of locally advanced head and neck squamous cell carcinoma differs largely between patients, resulting in a mean 5-year survival of about 50%. In order to adapt the treatment to the properties of the tumour, the therapy resistance of the tumours must be assessed before treatment. In this thesis, gene expression data were analysed to identify novel gene signatures and models that allow for stratifying patients into risk groups with low and high risk of loco-regional tumour recurrence. To identify those signatures, methods from the field of machine learning were applied. For patients treated with postoperative radiochemotherapy, a 7-gene signature was developed and successfully validated. Furthermore, it was shown that several models based on different gene signatures may be equally suitable for patient stratification. A method is presented that combines those distinct prognostic models. In addition, gene-expression-based biomarkers were transferred between different gene expressions measurement methods with the result that signatures showed less variability in patient stratification than single-gene biomarkers.:Abbreviations VII Figures IX Tables XII 1 Introduction 1 2 Biological & Statistical Background 4 2.1 Head and Neck Squamous Cell Carcinoma 4 2.1.1 Tumorigenesis 4 2.1.2 Biomarkers 8 2.2 Statistics 14 2.2.1 Survival analysis 14 2.2.2 Model and data evaluation 18 2.2.3 Data sampling methods 22 2.3 Machine learning algorithms 23 2.3.1 Feature selection algorithms 24 2.3.2 Prognostic models 27 2.4 Gene expression measurement methods 30 2.4.1 Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) 31 2.4.2 nCounter® gene expression 32 2.4.3 In situ-synthesized oligonucleotide microarrays 32 3 Material and methods 35 3.1 Patient cohorts 35 3.1.1 Primary radiochemotherapy (pRCTx) cohorts 35 3.1.2 Postoperative radio(chemo)therapy (PORT-C) cohorts 36 3.1.3 Clinical endpoints 38 3.2 Gene expression analyses 39 3.2.1 HPV status 39 3.2.2 Immunohistochemical staining 39 3.2.3 RT-PCR measurements 40 3.2.4 nCounter® measurements 40 3.2.5 GeneChip® analyses (only training cohorts) 41 3.3 Machine learning framework 41 3.3.1 Pre-processing of gene expression data 41 3.3.2 Determination of the ensemble gene signature 42 3.3.3 Expanding the ensemble signature by highly correlated genes 43 3.3.4 Independent validation and patient stratification 45 4 Identification of gene expression signatures as prognostic biomarkers 46 4.1 Hypoxia classification 46 4.2 nCounter® gene expression based signatures 50 4.2.1 Patients treated with primary radiochemotherapy 50 4.2.2 Clinical Features 55 4.2.3 Signature extension using clinical features 64 4.2.4 Patients treated with postoperative radiochemotherapy 65 4.2.5 Signature extension using clinical features – Port-C 72 4.3 GeneChip® gene expression-based signatures 78 4.3.1 Pre-selection 78 4.3.2 Patients treated with primary radiochemotherapy 79 4.3.3 Patients treated with postoperative radiochemotherapy 87 4.4 Combined models for PORT-C 91 4.4.1 Creation of a consensus model 92 4.4.2 Consensus model based on 2 models 93 4.4.3 Consensus model based on more than 2 models 97 4.4.4 Discussion and summary of model combination 101 5 Stability of gene expression-based biomarkers 102 5.1 Reproducibility depending on time of nCounter® 102 5.2 Comparison of nCounter® and GeneChip® gene expression 106 5.2.1 Introduction 106 5.2.2 Correlation analyses 106 5.2.3 Model and biomarker transfer 108 6 Conclusion and outlook 123 Zusammenfassung 125 Summary 128 Appendix 130 A. Supplementary Figures 130 B. Supplementary Tables 133 Bibliography 147 Acknowledgements 188 Erklärungen 189

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common malignancy worldwide. The 5-year survival rate when the cancer remains as a primary tumor is 81% but when it metastasizes to distant sites, defined as a metastatic cancer, it decreases dramatically to 26%. Approaches to prevent these cancers from undergoing these metastatic changes can greatly improve the survival and outcome of these cancer victims. This current study is examining the expression profiles of chemokines and VEGFs in HNSCC. By investigation the underlying pathways involved in the expressions of chemokines and VEGFS we hope to sort out the transcriptional regulation of these molecules. We used pharmological inhibitors of several important kinase pathways and the receptors involved in the transcription of chemokines and VEGFs. This study specifically looked at the proangiogenetic chemokines, CXCL5 and CXCL8, and their receptor CXCR2, and their possible impact on VEGFs, specifically VEGF-C and VEGF-A. From experimentation we concluded that HNSCC uses the MAPK pathway for regulation of the chemokines CXCL5 and CXCL8, but not for its downregulation. VEGF-A showed to be positively controlled by the MAPK pathway. The Akt pathway was found to downregulate VEGF-C, possibly from CXCR2. VEGF-C was not under control of the chemokines’ expression, VEGF-C and VEGF-A were also differentially regulated. The current study has begun to sort out the expression and regulation of chemokines and VEGFs in HNSCC. There are still many unanswered questions about the role these molecules play in HNSCC, but hopefully these conclusions will aid in finding improved treatments for patients diagnosed with head and neck cancer.

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a type of cancer that begins in the epithelial cells that line the mucosal surfaces of the head and neck, including the oral cavity, pharynx, larynx, paranasal sinuses, nasal cavity, and salivary glands. Head and neck cancer is the sixth most common type of cancer with a 5-year survival rate of 60% for all cases. Over the past few years, a subset of cells with stem-like properties, called cancer stem cells, are believed to have tumor-initiation capabilities and are responsible for maintaining on-going tumor growth. Previous data from our lab suggested that cells grown in suspension, called spheroids, may have stem cell like properties. We employed a model system where a primary HNSCC cell line, HN4, was used to set up spheroids. We found that expression of EPS8 and its downstream targets, FOXM1 and CXCL5, was increased in HN4 spheroids. In addition, we measured the expression of Nanog, as it is a transcription factor involved in the self-renewal of human embryonic stem cells. We also used a metastatic HNSCC cell line, HN12, to see how it compared to spheroids. We wanted to investigate the hypothesis that activation of Src potentiates EPS8 function to deregulate downstream signaling pathways. We used a small molecule tyrosine kinase inhibitor, Dasatinib, on HN4 spheroids and HN12 cells. We found that when Src is inhibited, EPS8 expression is decreased in HN4 spheroids and it also interferes with spheroid formation. The results of the current study were also able to show that the proliferation capability of HN12 cells is greatly diminished when treated with Dasatinib, due to G1 arrest in the cell cycle. When we measured for FOXM1, which is a cell cycle regulator, we found the levels were reduced in Dasatinib treated cells, preventing the cells from completing mitosis. With all of the data taken together, it suggests that Src does in fact play a role in regulating the downstream signaling pathways of EPS8, and its inhibition leads to the loss of cell proliferation. Additional studies need to be performed to discover whether Src inhibition will stop the proliferation of cancer stem cells, which are believed to be more resistant to cytotoxic therapies.

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Yes / Background - Previous studies have demonstrated that a number of HOX genes, a family of transcription factors with key roles in early development, are up-regulated in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and other cancers. The loci of several Homeobox (HOX) genes also contain microRNAs (miRs), including miR-196a. Methods - Global miR expression and expression of all 39 HOX genes in normal oral keratinocytes (NOKs), oral pre-malignant (OPM) and HNSCC cells was assessed by expression microarray and qPCR and in tissues by immunohistochemistry (IHC) and qPCR of laser microdissected (LCM) tissues. Expression of miR196a and HOXB9 was reduced using anti-miR-196a and siRNA, respectively. Expression microarray profiles of anti-miR196a and pre-miR196a transfected cells were compared to parental cells in order to identify novel targets of miR- 196a. Putative miR196a targets were validated by qPCR and were confirmed as binding to the 3’UTR of miR196a by a dual luciferase reporter assay combined with mutational analysis of the miR-196a binding site. Results - miR-196a and HOXB9 are highly expressed in HNSCC compared to NOKs, a pattern also seen in HNSCC tissues by HOXB9 IHC and qPCR of miR-196a in LCM tissue. Knock-down of miR-196a expression decreased HNSCC cell migration, invasion and adhesion to fibronectin, but had no effect on proliferation. Furthermore, knock-down of HOXB9 expression decreased migration, invasion and proliferation but did not alter adhesion. We identified a novel primary mRNA transcript containing HOXB9 and miR196a-1 as predicted from in-silico analysis. Expression array analysis identified a number of miR196a targets, including MAMDC2 and HOXC8. We confirmed that MAMDC2 is a novel miR-196a target using a dual luciferase reporter assay with the effect abolished on mutation of the binding site. Conclusions - These results show that miR-196a and HOXB9 are overexpressed, perhaps co-ordinately, as HNSCC develops and exert a pro-tumourigenic phenotype in HNSCC and OPM cells.

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