Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems sind die häufigste Todesursache in Deutschland. Eine gestörte Funktion des Gefäßendothels spielt bei der Entstehung von Herz-Kreislauferkrankungen eine Schlüsselrolle. Das Risiko einer kardiovaskulären Erkrankung ist bei Diabetikern stark erhöht. Der Transkriptionsfaktor COUP-TFII spielt eine essentielle Rolle im Glukosemetabolismus. Gleichzeitig ist er für die Differenzierung von Endothelzellen von großer Bedeutung. Für die Differenzierung und Aufrechterhaltung des arteriellen und venösen Phänotyps von Endothelzellen sind dabei maßgeblich der NOTCH-Signalweg und insbesondere die Transkriptionsfaktoren HEY2 (arteriell) und COUP-TFII (venös) verantwortlich. Gesteigerte Glukosespiegel könnten somit Auswirkungen auf die Differenzierung von Endothelzellen haben und damit einen neuen Mechanismus für das erhöhte Risiko von Gefäßerkrankungen bei Diabetikern darstellen. Im Rahmen der Arbeit konnte die exklusive Expression von COUP-TFII im Zellkern von humanen venösen Endothelzellen nachgewiesen werden. Humane arterielle Endothelzellen zeigten keine Expression von COUP-TFII. Außerdem konnte im Rahmen der Arbeit erstmals die spezifische Expression von COUP-TFII in humanen Endothelzellen der Koronararterie nachgewiesen werden. Die Untersuchung der COUP-TFII Promotoraktivität konnte das Expressionsmuster von COUP-TFII bestätigen. Der Promotor zeigte sowohl in den venösen Endothelzellen der humanen Nabelschnur als auch in den humanen Endothelzellen der Koronararterie Aktivität. Die kurzzeitige Stimulation von venösen Endothelzellen mit Glukose führte zu einem starken Anstieg der COUP-TFII Expression. Eine Translokation von COUP-TFII aus dem Zellkern in das Zytoplasma konnte nicht nachgewiesen werden. Die Langzeitstimulation führte interessanterweise zu einer Verminderung der COUP-TFII Expression und zu einer Erhöhung der Expression von E-Selektin. In beiden Fällen zeigte sich keine Beeinträchtigung der Expression durch Insulin. Die durchgeführten Untersuchungen schließen eine Beteiligung des AKT-Signalweges an der Regulation aus. Es zeigte sich jedoch, dass humane venöse Endothelzellen als Insulin-sensitives Gewebe mit funktionsfähigem AKT-Signalweg einzustufen sind. Stimulationsversuche mit L-Glukose zeigten keine Regulation der COUP-TFII Expression. Eine osmotische Wirksamkeit der hohen Glukosekonzentration auf die Expression von COUP-TFII konnte somit ausgeschlossen werden. Die Deletionsanalyse des COUP-TFII Promotors konnte einen Glukose-sensitiven Bereich innerhalb des COUP-TFII Promotors identifizieren. Weiterhin konnte die Repression der Aktivität des COUP-TFII Promotors durch Hypoxie nachgewiesen werden. Eine der wichtigen Aufgaben von Endothelzellen ist die von der endothelialen NO-Synthase (eNOS) katalysierte Bildung von Stickstoffmonoxid (NO). NO hemmt die Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin. Eine verringerte NO-Produktion hat die Ausbildung einer endothelialen Dysfunktion zur Folge. In dieser Arbeit konnte erstmals eine Erhöhung der eNOS Expression nach Verminderung der Expression von COUP-TFII in humanen venösen Endothelzellen gezeigt werden. Diese könnte die Ursache für die Verminderung der E-Selektin Expression nach Herabregulation von COUP-TFII sein. Durch die Anwendung einer Plattenkegel-Viskometer-Apparatur konnte gezeigt werden, dass die NO-Abgabe entscheidend von den Strömungsbedingungen und Scherkräften abhängig ist. Die Stimulation arterieller Endothelzellen mit laminarer oder oszillatorischer Schubspannung führte zu einer Erhöhung der NO-Abgabe. Turbulente Schubspannung zeigte dagegen keinen Einfluss auf die NO-Abgabe. Durch Überexpression von COUP-TFII in Kombination mit laminarer Schubspannung wurde die NO-Abgabe weiter gesteigert. Die gezeigte direkte Regulation der HEY2 und COUP-TFII Promotoraktivität durch geänderte Strömungsbedingungen spielt in diesem Prozess möglicherweise eine bedeutende Rolle. Die beschriebene Regulation von COUP-TFII durch Glukose in Endothelzellen könnte eine neue Erklärung für die gesteigerte Rate an Gefäßerkrankungen von Typ2-Diabetikern darstellen. Bei der Regulation der endothelialen NO-Synthase und E-Selektin durch COUP-TFII handelt es sich möglicherweise um einen neuen, anti-adhäsiven Feedback-Mechanismus, der zur Verringerung der Leukozyten-Adhäsion an Endothelzellen und damit zur Gefäßprotektion beitragen könnte. Die differentielle Expression der arteriellen Markergene HEY2 und CD44 konnte in humanen venösen und arteriellen Endothelzellen gezeigt werden. Die Untersuchung der Expression von FOXC1 legt nahe, dass es sich bei diesem Transkriptionsfaktor ebenfalls um ein in Endothelzellen arteriovenös differentiell exprimiertes Gen handelt. Die differentielle Exprimierung von HEY2 in Endothelzellen konnte auf transkriptioneller Ebene zusätzlich durch ein HEY2 Promotor Funktionsassay gezeigt werden. Die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne führte zur Induktion der endogenen Expression der NOTCH-Zielgene HEY1 und HEY2 in HEK 293T Zellen. In dem Zelltyp durchgeführte Reportergenassays zeigten ebenfalls eine deutliche Aktivierung des HEY2 Promotors durch die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne. Durch eine Deletionsanalyse konnte der Bereich, der für die Aktivierung verantwortlichen DNA-Sequenz-Motive stark eingegrenzt werden. Weiterhin konnte die Induktion des HEY2 Promotors durch VEGF und seine Repression durch einen γ-Sekretase Inhibitor nachgewiesen werden. Die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne führte zur Verringerung der mRNA- und Protein-Expression von COUP-TFII in HEK 293T Zellen. Dieses Ergebnis konnte zusätzlich durch ein COUP-TFII Promotor Aktivitätsassay nach Überexpression des NOTCH-Zielgens HEY2 gezeigt werden. Die Deletionsanalyse des COUP-TFII Promotors lässt eine direkte Inhibition von COUP-TFII durch HEY2 vermuten. Die Überexpression von COUP-TFII führte zu einer starken Induktion der COUP-TFII mRNA- und Protein-Expression, jedoch weder in HEK 293T Zellen noch in Endothelzellen zu einer Änderung der HEY2 Promotoraktivität. Die Überexpression von FOXC1 und FOXC2 bewirkte eine Inhibition der HEY2 Promotoraktivität in HEK 293T Zellen. Die in der Arbeit gezeigte hohe Expression von FOXC1 in venösen Endothelzellen könnte somit in Kombination mit COUP-TFII für die komplette Repression der Aktivität des HEY2 Promotors in venösen Endothelzellen verantwortlich sein. Die durchgeführte Deletionsanalyse des HEY2 Promotors legt eine direkte Bindung von FOXC1 und FOXC2 an den HEY2 Promotor nahe. Die erzielten Ergebnisse dieser Arbeit sprechen im Kontext mit der Literatur für eine zelltypspezifische Regulierung/Aktivierung des NOTCH-Signalweges und lassen folgendes Modell zur Differenzierung des venösen oder arteriellen endothelialen Phänotyps vermuten: Die Determinierung des Phänotyps wird entschieden durch das Gleichgewicht der Expression der Interaktionspartner des NOTCH-Signalweges. Der VEGF Co-Rezeptor NRP1 und der VEGFR2 sind die entscheidenden Aktivatoren des NOTCH-Signalweges. Die Balance der Bindung des Repressors COUP-TFII an den NRP1 und VEGFR2 Promotor sowie des Aktivatorkomplexes NICD/RBP-JК an den NRP1 Promotor sind damit entscheidend für die Aktivität des NOTCH-Signalweges. NRP1 bindet VEGF und steigert gleichzeitig dessen Bindung an den VEGFR2. Dies führt zur Induktion von DLL4. Die Bindung von DLL4 an die NOTCH1/4 Rezeptoren führt zur Abspaltung der NOTCH intrazellulären Domäne (NICD) des Rezeptors. Die NICD wandert in den Zellkern und aktiviert dort zusammen im Komplex mit dem Transkriptionsfaktor RBP-JК die Gene HEY1, HEY2 und NRP1. Die Transkriptionsfaktoren HEY1 und HEY2 reprimieren über einen Feedback-Mechanismus direkt die Aktivität des COUP-TFII Promotors.

Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems sind die häufigste Todesursache in Deutschland. Eine gestörte Funktion des Gefäßendothels spielt bei der Entstehung von Herz-Kreislauferkrankungen eine Schlüsselrolle. Das Risiko einer kardiovaskulären Erkrankung ist bei Diabetikern stark erhöht. Der Transkriptionsfaktor COUP-TFII spielt eine essentielle Rolle im Glukosemetabolismus. Gleichzeitig ist er für die Differenzierung von Endothelzellen von großer Bedeutung. Für die Differenzierung und Aufrechterhaltung des arteriellen und venösen Phänotyps von Endothelzellen sind dabei maßgeblich der NOTCH-Signalweg und insbesondere die Transkriptionsfaktoren HEY2 (arteriell) und COUP-TFII (venös) verantwortlich. Gesteigerte Glukosespiegel könnten somit Auswirkungen auf die Differenzierung von Endothelzellen haben und damit einen neuen Mechanismus für das erhöhte Risiko von Gefäßerkrankungen bei Diabetikern darstellen. Im Rahmen der Arbeit konnte die exklusive Expression von COUP-TFII im Zellkern von humanen venösen Endothelzellen nachgewiesen werden. Humane arterielle Endothelzellen zeigten keine Expression von COUP-TFII. Außerdem konnte im Rahmen der Arbeit erstmals die spezifische Expression von COUP-TFII in humanen Endothelzellen der Koronararterie nachgewiesen werden. Die Untersuchung der COUP-TFII Promotoraktivität konnte das Expressionsmuster von COUP-TFII bestätigen. Der Promotor zeigte sowohl in den venösen Endothelzellen der humanen Nabelschnur als auch in den humanen Endothelzellen der Koronararterie Aktivität. Die kurzzeitige Stimulation von venösen Endothelzellen mit Glukose führte zu einem starken Anstieg der COUP-TFII Expression. Eine Translokation von COUP-TFII aus dem Zellkern in das Zytoplasma konnte nicht nachgewiesen werden. Die Langzeitstimulation führte interessanterweise zu einer Verminderung der COUP-TFII Expression und zu einer Erhöhung der Expression von E-Selektin. In beiden Fällen zeigte sich keine Beeinträchtigung der Expression durch Insulin. Die durchgeführten Untersuchungen schließen eine Beteiligung des AKT-Signalweges an der Regulation aus. Es zeigte sich jedoch, dass humane venöse Endothelzellen als Insulin-sensitives Gewebe mit funktionsfähigem AKT-Signalweg einzustufen sind. Stimulationsversuche mit L-Glukose zeigten keine Regulation der COUP-TFII Expression. Eine osmotische Wirksamkeit der hohen Glukosekonzentration auf die Expression von COUP-TFII konnte somit ausgeschlossen werden. Die Deletionsanalyse des COUP-TFII Promotors konnte einen Glukose-sensitiven Bereich innerhalb des COUP-TFII Promotors identifizieren. Weiterhin konnte die Repression der Aktivität des COUP-TFII Promotors durch Hypoxie nachgewiesen werden. Eine der wichtigen Aufgaben von Endothelzellen ist die von der endothelialen NO-Synthase (eNOS) katalysierte Bildung von Stickstoffmonoxid (NO). NO hemmt die Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin. Eine verringerte NO-Produktion hat die Ausbildung einer endothelialen Dysfunktion zur Folge. In dieser Arbeit konnte erstmals eine Erhöhung der eNOS Expression nach Verminderung der Expression von COUP-TFII in humanen venösen Endothelzellen gezeigt werden. Diese könnte die Ursache für die Verminderung der E-Selektin Expression nach Herabregulation von COUP-TFII sein. Durch die Anwendung einer Plattenkegel-Viskometer-Apparatur konnte gezeigt werden, dass die NO-Abgabe entscheidend von den Strömungsbedingungen und Scherkräften abhängig ist. Die Stimulation arterieller Endothelzellen mit laminarer oder oszillatorischer Schubspannung führte zu einer Erhöhung der NO-Abgabe. Turbulente Schubspannung zeigte dagegen keinen Einfluss auf die NO-Abgabe. Durch Überexpression von COUP-TFII in Kombination mit laminarer Schubspannung wurde die NO-Abgabe weiter gesteigert. Die gezeigte direkte Regulation der HEY2 und COUP-TFII Promotoraktivität durch geänderte Strömungsbedingungen spielt in diesem Prozess möglicherweise eine bedeutende Rolle. Die beschriebene Regulation von COUP-TFII durch Glukose in Endothelzellen könnte eine neue Erklärung für die gesteigerte Rate an Gefäßerkrankungen von Typ2-Diabetikern darstellen. Bei der Regulation der endothelialen NO-Synthase und E-Selektin durch COUP-TFII handelt es sich möglicherweise um einen neuen, anti-adhäsiven Feedback-Mechanismus, der zur Verringerung der Leukozyten-Adhäsion an Endothelzellen und damit zur Gefäßprotektion beitragen könnte. Die differentielle Expression der arteriellen Markergene HEY2 und CD44 konnte in humanen venösen und arteriellen Endothelzellen gezeigt werden. Die Untersuchung der Expression von FOXC1 legt nahe, dass es sich bei diesem Transkriptionsfaktor ebenfalls um ein in Endothelzellen arteriovenös differentiell exprimiertes Gen handelt. Die differentielle Exprimierung von HEY2 in Endothelzellen konnte auf transkriptioneller Ebene zusätzlich durch ein HEY2 Promotor Funktionsassay gezeigt werden. Die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne führte zur Induktion der endogenen Expression der NOTCH-Zielgene HEY1 und HEY2 in HEK 293T Zellen. In dem Zelltyp durchgeführte Reportergenassays zeigten ebenfalls eine deutliche Aktivierung des HEY2 Promotors durch die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne. Durch eine Deletionsanalyse konnte der Bereich, der für die Aktivierung verantwortlichen DNA-Sequenz-Motive stark eingegrenzt werden. Weiterhin konnte die Induktion des HEY2 Promotors durch VEGF und seine Repression durch einen γ-Sekretase Inhibitor nachgewiesen werden. Die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne führte zur Verringerung der mRNA- und Protein-Expression von COUP-TFII in HEK 293T Zellen. Dieses Ergebnis konnte zusätzlich durch ein COUP-TFII Promotor Aktivitätsassay nach Überexpression des NOTCH-Zielgens HEY2 gezeigt werden. Die Deletionsanalyse des COUP-TFII Promotors lässt eine direkte Inhibition von COUP-TFII durch HEY2 vermuten. Die Überexpression von COUP-TFII führte zu einer starken Induktion der COUP-TFII mRNA- und Protein-Expression, jedoch weder in HEK 293T Zellen noch in Endothelzellen zu einer Änderung der HEY2 Promotoraktivität. Die Überexpression von FOXC1 und FOXC2 bewirkte eine Inhibition der HEY2 Promotoraktivität in HEK 293T Zellen. Die in der Arbeit gezeigte hohe Expression von FOXC1 in venösen Endothelzellen könnte somit in Kombination mit COUP-TFII für die komplette Repression der Aktivität des HEY2 Promotors in venösen Endothelzellen verantwortlich sein. Die durchgeführte Deletionsanalyse des HEY2 Promotors legt eine direkte Bindung von FOXC1 und FOXC2 an den HEY2 Promotor nahe. Die erzielten Ergebnisse dieser Arbeit sprechen im Kontext mit der Literatur für eine zelltypspezifische Regulierung/Aktivierung des NOTCH-Signalweges und lassen folgendes Modell zur Differenzierung des venösen oder arteriellen endothelialen Phänotyps vermuten: Die Determinierung des Phänotyps wird entschieden durch das Gleichgewicht der Expression der Interaktionspartner des NOTCH-Signalweges. Der VEGF Co-Rezeptor NRP1 und der VEGFR2 sind die entscheidenden Aktivatoren des NOTCH-Signalweges. Die Balance der Bindung des Repressors COUP-TFII an den NRP1 und VEGFR2 Promotor sowie des Aktivatorkomplexes NICD/RBP-JК an den NRP1 Promotor sind damit entscheidend für die Aktivität des NOTCH-Signalweges. NRP1 bindet VEGF und steigert gleichzeitig dessen Bindung an den VEGFR2. Dies führt zur Induktion von DLL4. Die Bindung von DLL4 an die NOTCH1/4 Rezeptoren führt zur Abspaltung der NOTCH intrazellulären Domäne (NICD) des Rezeptors. Die NICD wandert in den Zellkern und aktiviert dort zusammen im Komplex mit dem Transkriptionsfaktor RBP-JК die Gene HEY1, HEY2 und NRP1. Die Transkriptionsfaktoren HEY1 und HEY2 reprimieren über einen Feedback-Mechanismus direkt die Aktivität des COUP-TFII Promotors.

Einführung - Periphere Blutmonozyten spielen eine Rolle in der Pathogenese der Arteriosklerose. Bei spontan hypertensiven Ratten wurden im Vergleich zu normotonen Wistar-Kyoto-Ratten signifikant erhöhte Zahlen aktivierter Monozyten beobachtet [Liu 1996]. Wir untersuchten Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie und von gesunden Probanden hinsichtlich möglicher Unterschiede in der Aktivierung anhand ihrer Adhäsion an von uns kultivierte (HAEC) und isolierte (HSVEC, HUVEC, HUAEC) humane Endothelzellen. Wir bestimmten die Adhäsionsmoleküle ICAM-1, VCAM-1 sowie E-Selektin und analysierten die Superoxidfreisetzung von humanem Endothel und Monozyten. Methoden - Humane periphere Blutmonozyten wurden mittels Dichtegradienten-zentrifugation und Plastikadhärenz isoliert und mit LPS, Angiotensin II (Ang II), und Ang II nach Vorinkubation mit dem AT1-Antagonisten Eprosartan stimuliert. Die Monozyten wurden auf einschichtigem Endothel ausgesät und die Adhäsion als Prozentsatz der initial gesäten Zellen erfasst. Die durch PMA induzierte Superoxidfreisetzung des Endothels oder der Monozyten wurde mittels Chemilumineszenz bestimmt. Ergebnisse - Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie hefteten sich im Vergleich zu gesunden Probanden spontan und nach Stimulation mit Ang II signifikant verstärkt an HAEC und HUVEC-Monolayer an. Die Spiegel von ICAM-1 und VCAM-1 waren bei Patienten mit arterieller Hypertonie im Vergleich zu den gesunden Kontrollpersonen signifikant erhöht. Die Chemilumineszenzaktivität postkonfluenter Endothelzellen erhöhte sich nach Stimulation mit Ang II im Vergleich zur Messung ohne vorherige Stimulierung. Nach Stimulation mit PMA oder mit Ang II wurden bei Hypertonikern signifikant höhere Werte für die Chemilumineszenzaktivität der Monozyten gemessen als bei gesunden Kontrollpersonen. Schluss - Mit diesen Versuchen an humanen Monozyten und Endothelzellen wurde ein weiterer Beweis für die Aktivierung der Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie erbracht. Meine Ergebnisse unterstützen die Sicht einer Monozytenbeteiligung an der Pathogenese atherosklerotischer Läsionen, die mit arterieller Hypertonie in Zusammenhang stehen. / Introduction - Peripheral blood monocytes are involved in the pathogenesis of atherosclerosis. Significantly elevated numbers of activated monocytes were observed in spontaneously hypertensive rats compared to those in normotensive Wistar-Kyoto rats [Liu 1996]. We isolated and cultivated human endothelial cells and examined monocytes from patients with arterial hypertension and healthy volunteers to identify possible differences in their adhesion behavior to human endothelial cells (HAEC, HSVEC, HUVEC, HUAEC). We determined the levels of ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin, and we analyzed superoxide release by human endothelium and human monocytes. Methods - Peripheral blood monocytes were isolated by density gradient centrifugation and plastic adherence. Subsets of the samples were stimulated with LPS, Angiotensin II, Angiotensin II following preincubation with the AT1-antagonist eprosartan or left without a stimulant. After incubation, monocytes were seeded onto confluent monolayers of human aortic endothelial cells and the adhesion was determined as the percentage of the initially seeded cells. Oxygen species release induced by PMA was analyzed for endothelium and monocytes in suspension by chemiluminescence. Results - Peripheral blood monocytes of patients with essential hypertension performed a significantly increased spontaneous adhesion and adhesion following stimulation with Angiotensin II to HAEC- and HUVEC-monolayers. Levels of human soluble adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1 were significantly raised in hypertensive patients. Chemiluminescence activity of post confluent endothelial cells was increased after stimulation with Angiotensin II compared to the measurement before stimulation. Following stimulation with PMA or Angiotensin II, significantly higher chem-iluminescence levels were measured in hypertensive patients compared to healthy volunteers. Conclusion - These data indicate that monocytes of patients with essential hypertension may be preactivated. My results support the view of a monocyte involvement in the pathogenesis of atherosclerotic lesions that are related to arterial hypertension.