Die Neuralentwicklung wird durch eine Vielzahl von Genen reguliert. Hierbei scheint der Notch-Signaltransduktionsweg eine wichtige Rolle zu spielen. Die primären Zielgene der Notch-Signalkaskaskade sind die Hes- und Hey-Gene. Die genaue Bedeutung der Signalkaskade, der Hes- und insbesondere der Hey-Gene für den Differenzierungsprozess neuraler Stamm- und Vorläuferzellen ist noch nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, die Aufgaben von Notch und der Hey-Gene beim Differenzierungsprozess neuraler Stamm- und Vorläuferzellen genauer zu untersuchen. Da das gezielte Ausschalten eines Gens eine aussagekräftige Methode zur Erforschung seiner Funktion ist, wurden zunächst neurale Stamm- und Vorläuferzellen in Form von sogenannten Neurosphären von Hey1-/- und Hey2-/- Mäuseembryonen mit denen von Wildtyp-Mäuseembryonen verglichen. Dabei differenzierten bei den Hey1-/- Neurosphärenkulturen ca. 6,6% (bei den Kontrollen 6,6%) und bei den Hey2-/- Kulturen 10,9% (Kontrollen 8,7%) der Zellen zu Neuronen. Eine komplette Inhibierung der Notch-Signalkaskade wurde durch das Etablieren von RBP-Jκ-/- Kulturen erreicht. RBP-Jκ-/- Zellen waren jedoch während der Differenzierung nur noch zu einem kleinen Teil in der Lage zu adhärieren, was weitere Experimente mit den Zellen unmöglich machte. Als nächstes sollten Neurosphären mit einer Überexpression von Hey1 mit Wildtyp-Neurosphären verglichen werden. Es gelang allerdings aufgrund einer schon hohen Ausgangsexpression von Hey1 in Neurosphären nur, die Expression zu verdreifachen, was für weitere Experimente nicht ausreichend schien. Um die Prozesse, die auf Genebene während der Differenzierung neuraler Stamm- und Vorläuferzellen ablaufen, besser zu verstehen, wurden die Expression von Genen, die in der Neuralentwicklung und in der Notch-Signalkaskade eine Rolle spielen, in Wildtyp-Neurosphärenzellen mittels qRT-PCR zu verschiedenen Differenzierungszeitpunkten quantifiziert. Die Genexpression von Hes1 und Hes5, sowie Hey2 wurde während der Differenzierung zum Teil deutlich herunterreguliert. Die Gene Hes3, Hey1 und Id4 hingegen stiegen zunächst bis Tag 3 stark an, um dann an Tag 7 und 14 etwa wieder den Ausgangswert zu erreichen. Die Regulation der Gene war insgesamt recht uneinheitlich und nicht immer nachvollziehbar. Da diese teils widersprüchlichen Ergebnisse auf die vorgegebene Heterogenität einer Neurosphärenkultur zurückzuführen sein könnten, wurde nach einer Alternative zur Neurosphärenkultur gesucht. Deshalb wurde im Weiteren versucht homogene Monolayerkulturen nach einem Protokoll von Conti et al. (2005) zu etablieren. Das Protokoll musste aber an einigen Stellen angepasst werden, um adäquate Kulturen zu erhalten. Da die Monolayerkulturen auf Gelatine nicht gut hafteten wurde auf eine Polyornithin-Beschichtung umgestellt. Außerdem wurde das NS-A Medium mit N-2 Zusatz aufgrund schlechter Proliferation der Zellen auf Neurobasalmedium mit B-27 Zusatz umgestellt. Färbungen dieser Monolayerkulturen zeigten, dass sich fast alle Zellen mit dem Stammzellmarker Nestin anfärben ließen und keine Zellen Tuj1+ (Neuronen) und nur einige wenige Zellen Gfap+ (Astrozyten) waren. Es ist deshalb wahrscheinlich, dass die Zellen in einer Monolayerkultur unter den oben beschriebenen Bedingungen hauptsächlich undifferenziert sind und neuralen Stamm- bzw. Vorläuferzellcharakter haben. / Neural development go on in three sequential processes. First expansion of neural stem and precursor cells, then neurogenesis and last the gliogenesis take place. There are different methods to analyse this development in vitro. Cultivation of neurospheres and monolayers are two important possibilities. The cultivation is followed by differentiation to neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Many protocols for cultivation and differentiation of neurospheres and monolayers were tested. But no method did work adequately. So an own procedure was established. Monolayer culturing on polyornithine with Neurobasalmedium®(Gibco) supplemented with B27®(Gibco), FGF and EGF and passaging with Accutase®(PAA) worked best. Differentiation with NeuroCult® NSC Differentiation Supplement(StemCell Technologies) added to Neurobasalmedium showed best results. The neural development is regulated by a lot of genes. Especially the Notch signaling cascade seams to play a central role. The exact role of this cascade and particularly of Hey and Hes genes is not known yet. To analyse the importance of these genes for the differentiation process, the expression of some of these and other genes were quantified by qRT-PCR. The results revealed, that Blbp and Hes5 were downregulated massively. Several differentiated Hey1-/- and Hey2-/- were compared with wildtype lineages. No significant differences in number of neurons (about 8%) and astrocytes (about 85%) were seen. A complete inihibtion of the Notch signaling cascade was reached through establishment of RBP-Jκ-/- lineages. RBP-Jκ-/- cells were no longer able to attach, but didn’t die, after differentiation was initiated. So RBP-Jκ may play a role for the attachment of differentiating neural stem and precursor cells.

Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems sind die häufigste Todesursache in Deutschland. Eine gestörte Funktion des Gefäßendothels spielt bei der Entstehung von Herz-Kreislauferkrankungen eine Schlüsselrolle. Das Risiko einer kardiovaskulären Erkrankung ist bei Diabetikern stark erhöht. Der Transkriptionsfaktor COUP-TFII spielt eine essentielle Rolle im Glukosemetabolismus. Gleichzeitig ist er für die Differenzierung von Endothelzellen von großer Bedeutung. Für die Differenzierung und Aufrechterhaltung des arteriellen und venösen Phänotyps von Endothelzellen sind dabei maßgeblich der NOTCH-Signalweg und insbesondere die Transkriptionsfaktoren HEY2 (arteriell) und COUP-TFII (venös) verantwortlich. Gesteigerte Glukosespiegel könnten somit Auswirkungen auf die Differenzierung von Endothelzellen haben und damit einen neuen Mechanismus für das erhöhte Risiko von Gefäßerkrankungen bei Diabetikern darstellen. Im Rahmen der Arbeit konnte die exklusive Expression von COUP-TFII im Zellkern von humanen venösen Endothelzellen nachgewiesen werden. Humane arterielle Endothelzellen zeigten keine Expression von COUP-TFII. Außerdem konnte im Rahmen der Arbeit erstmals die spezifische Expression von COUP-TFII in humanen Endothelzellen der Koronararterie nachgewiesen werden. Die Untersuchung der COUP-TFII Promotoraktivität konnte das Expressionsmuster von COUP-TFII bestätigen. Der Promotor zeigte sowohl in den venösen Endothelzellen der humanen Nabelschnur als auch in den humanen Endothelzellen der Koronararterie Aktivität. Die kurzzeitige Stimulation von venösen Endothelzellen mit Glukose führte zu einem starken Anstieg der COUP-TFII Expression. Eine Translokation von COUP-TFII aus dem Zellkern in das Zytoplasma konnte nicht nachgewiesen werden. Die Langzeitstimulation führte interessanterweise zu einer Verminderung der COUP-TFII Expression und zu einer Erhöhung der Expression von E-Selektin. In beiden Fällen zeigte sich keine Beeinträchtigung der Expression durch Insulin. Die durchgeführten Untersuchungen schließen eine Beteiligung des AKT-Signalweges an der Regulation aus. Es zeigte sich jedoch, dass humane venöse Endothelzellen als Insulin-sensitives Gewebe mit funktionsfähigem AKT-Signalweg einzustufen sind. Stimulationsversuche mit L-Glukose zeigten keine Regulation der COUP-TFII Expression. Eine osmotische Wirksamkeit der hohen Glukosekonzentration auf die Expression von COUP-TFII konnte somit ausgeschlossen werden. Die Deletionsanalyse des COUP-TFII Promotors konnte einen Glukose-sensitiven Bereich innerhalb des COUP-TFII Promotors identifizieren. Weiterhin konnte die Repression der Aktivität des COUP-TFII Promotors durch Hypoxie nachgewiesen werden. Eine der wichtigen Aufgaben von Endothelzellen ist die von der endothelialen NO-Synthase (eNOS) katalysierte Bildung von Stickstoffmonoxid (NO). NO hemmt die Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin. Eine verringerte NO-Produktion hat die Ausbildung einer endothelialen Dysfunktion zur Folge. In dieser Arbeit konnte erstmals eine Erhöhung der eNOS Expression nach Verminderung der Expression von COUP-TFII in humanen venösen Endothelzellen gezeigt werden. Diese könnte die Ursache für die Verminderung der E-Selektin Expression nach Herabregulation von COUP-TFII sein. Durch die Anwendung einer Plattenkegel-Viskometer-Apparatur konnte gezeigt werden, dass die NO-Abgabe entscheidend von den Strömungsbedingungen und Scherkräften abhängig ist. Die Stimulation arterieller Endothelzellen mit laminarer oder oszillatorischer Schubspannung führte zu einer Erhöhung der NO-Abgabe. Turbulente Schubspannung zeigte dagegen keinen Einfluss auf die NO-Abgabe. Durch Überexpression von COUP-TFII in Kombination mit laminarer Schubspannung wurde die NO-Abgabe weiter gesteigert. Die gezeigte direkte Regulation der HEY2 und COUP-TFII Promotoraktivität durch geänderte Strömungsbedingungen spielt in diesem Prozess möglicherweise eine bedeutende Rolle. Die beschriebene Regulation von COUP-TFII durch Glukose in Endothelzellen könnte eine neue Erklärung für die gesteigerte Rate an Gefäßerkrankungen von Typ2-Diabetikern darstellen. Bei der Regulation der endothelialen NO-Synthase und E-Selektin durch COUP-TFII handelt es sich möglicherweise um einen neuen, anti-adhäsiven Feedback-Mechanismus, der zur Verringerung der Leukozyten-Adhäsion an Endothelzellen und damit zur Gefäßprotektion beitragen könnte. Die differentielle Expression der arteriellen Markergene HEY2 und CD44 konnte in humanen venösen und arteriellen Endothelzellen gezeigt werden. Die Untersuchung der Expression von FOXC1 legt nahe, dass es sich bei diesem Transkriptionsfaktor ebenfalls um ein in Endothelzellen arteriovenös differentiell exprimiertes Gen handelt. Die differentielle Exprimierung von HEY2 in Endothelzellen konnte auf transkriptioneller Ebene zusätzlich durch ein HEY2 Promotor Funktionsassay gezeigt werden. Die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne führte zur Induktion der endogenen Expression der NOTCH-Zielgene HEY1 und HEY2 in HEK 293T Zellen. In dem Zelltyp durchgeführte Reportergenassays zeigten ebenfalls eine deutliche Aktivierung des HEY2 Promotors durch die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne. Durch eine Deletionsanalyse konnte der Bereich, der für die Aktivierung verantwortlichen DNA-Sequenz-Motive stark eingegrenzt werden. Weiterhin konnte die Induktion des HEY2 Promotors durch VEGF und seine Repression durch einen γ-Sekretase Inhibitor nachgewiesen werden. Die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne führte zur Verringerung der mRNA- und Protein-Expression von COUP-TFII in HEK 293T Zellen. Dieses Ergebnis konnte zusätzlich durch ein COUP-TFII Promotor Aktivitätsassay nach Überexpression des NOTCH-Zielgens HEY2 gezeigt werden. Die Deletionsanalyse des COUP-TFII Promotors lässt eine direkte Inhibition von COUP-TFII durch HEY2 vermuten. Die Überexpression von COUP-TFII führte zu einer starken Induktion der COUP-TFII mRNA- und Protein-Expression, jedoch weder in HEK 293T Zellen noch in Endothelzellen zu einer Änderung der HEY2 Promotoraktivität. Die Überexpression von FOXC1 und FOXC2 bewirkte eine Inhibition der HEY2 Promotoraktivität in HEK 293T Zellen. Die in der Arbeit gezeigte hohe Expression von FOXC1 in venösen Endothelzellen könnte somit in Kombination mit COUP-TFII für die komplette Repression der Aktivität des HEY2 Promotors in venösen Endothelzellen verantwortlich sein. Die durchgeführte Deletionsanalyse des HEY2 Promotors legt eine direkte Bindung von FOXC1 und FOXC2 an den HEY2 Promotor nahe. Die erzielten Ergebnisse dieser Arbeit sprechen im Kontext mit der Literatur für eine zelltypspezifische Regulierung/Aktivierung des NOTCH-Signalweges und lassen folgendes Modell zur Differenzierung des venösen oder arteriellen endothelialen Phänotyps vermuten: Die Determinierung des Phänotyps wird entschieden durch das Gleichgewicht der Expression der Interaktionspartner des NOTCH-Signalweges. Der VEGF Co-Rezeptor NRP1 und der VEGFR2 sind die entscheidenden Aktivatoren des NOTCH-Signalweges. Die Balance der Bindung des Repressors COUP-TFII an den NRP1 und VEGFR2 Promotor sowie des Aktivatorkomplexes NICD/RBP-JК an den NRP1 Promotor sind damit entscheidend für die Aktivität des NOTCH-Signalweges. NRP1 bindet VEGF und steigert gleichzeitig dessen Bindung an den VEGFR2. Dies führt zur Induktion von DLL4. Die Bindung von DLL4 an die NOTCH1/4 Rezeptoren führt zur Abspaltung der NOTCH intrazellulären Domäne (NICD) des Rezeptors. Die NICD wandert in den Zellkern und aktiviert dort zusammen im Komplex mit dem Transkriptionsfaktor RBP-JК die Gene HEY1, HEY2 und NRP1. Die Transkriptionsfaktoren HEY1 und HEY2 reprimieren über einen Feedback-Mechanismus direkt die Aktivität des COUP-TFII Promotors.

Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems sind die häufigste Todesursache in Deutschland. Eine gestörte Funktion des Gefäßendothels spielt bei der Entstehung von Herz-Kreislauferkrankungen eine Schlüsselrolle. Das Risiko einer kardiovaskulären Erkrankung ist bei Diabetikern stark erhöht. Der Transkriptionsfaktor COUP-TFII spielt eine essentielle Rolle im Glukosemetabolismus. Gleichzeitig ist er für die Differenzierung von Endothelzellen von großer Bedeutung. Für die Differenzierung und Aufrechterhaltung des arteriellen und venösen Phänotyps von Endothelzellen sind dabei maßgeblich der NOTCH-Signalweg und insbesondere die Transkriptionsfaktoren HEY2 (arteriell) und COUP-TFII (venös) verantwortlich. Gesteigerte Glukosespiegel könnten somit Auswirkungen auf die Differenzierung von Endothelzellen haben und damit einen neuen Mechanismus für das erhöhte Risiko von Gefäßerkrankungen bei Diabetikern darstellen. Im Rahmen der Arbeit konnte die exklusive Expression von COUP-TFII im Zellkern von humanen venösen Endothelzellen nachgewiesen werden. Humane arterielle Endothelzellen zeigten keine Expression von COUP-TFII. Außerdem konnte im Rahmen der Arbeit erstmals die spezifische Expression von COUP-TFII in humanen Endothelzellen der Koronararterie nachgewiesen werden. Die Untersuchung der COUP-TFII Promotoraktivität konnte das Expressionsmuster von COUP-TFII bestätigen. Der Promotor zeigte sowohl in den venösen Endothelzellen der humanen Nabelschnur als auch in den humanen Endothelzellen der Koronararterie Aktivität. Die kurzzeitige Stimulation von venösen Endothelzellen mit Glukose führte zu einem starken Anstieg der COUP-TFII Expression. Eine Translokation von COUP-TFII aus dem Zellkern in das Zytoplasma konnte nicht nachgewiesen werden. Die Langzeitstimulation führte interessanterweise zu einer Verminderung der COUP-TFII Expression und zu einer Erhöhung der Expression von E-Selektin. In beiden Fällen zeigte sich keine Beeinträchtigung der Expression durch Insulin. Die durchgeführten Untersuchungen schließen eine Beteiligung des AKT-Signalweges an der Regulation aus. Es zeigte sich jedoch, dass humane venöse Endothelzellen als Insulin-sensitives Gewebe mit funktionsfähigem AKT-Signalweg einzustufen sind. Stimulationsversuche mit L-Glukose zeigten keine Regulation der COUP-TFII Expression. Eine osmotische Wirksamkeit der hohen Glukosekonzentration auf die Expression von COUP-TFII konnte somit ausgeschlossen werden. Die Deletionsanalyse des COUP-TFII Promotors konnte einen Glukose-sensitiven Bereich innerhalb des COUP-TFII Promotors identifizieren. Weiterhin konnte die Repression der Aktivität des COUP-TFII Promotors durch Hypoxie nachgewiesen werden. Eine der wichtigen Aufgaben von Endothelzellen ist die von der endothelialen NO-Synthase (eNOS) katalysierte Bildung von Stickstoffmonoxid (NO). NO hemmt die Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin. Eine verringerte NO-Produktion hat die Ausbildung einer endothelialen Dysfunktion zur Folge. In dieser Arbeit konnte erstmals eine Erhöhung der eNOS Expression nach Verminderung der Expression von COUP-TFII in humanen venösen Endothelzellen gezeigt werden. Diese könnte die Ursache für die Verminderung der E-Selektin Expression nach Herabregulation von COUP-TFII sein. Durch die Anwendung einer Plattenkegel-Viskometer-Apparatur konnte gezeigt werden, dass die NO-Abgabe entscheidend von den Strömungsbedingungen und Scherkräften abhängig ist. Die Stimulation arterieller Endothelzellen mit laminarer oder oszillatorischer Schubspannung führte zu einer Erhöhung der NO-Abgabe. Turbulente Schubspannung zeigte dagegen keinen Einfluss auf die NO-Abgabe. Durch Überexpression von COUP-TFII in Kombination mit laminarer Schubspannung wurde die NO-Abgabe weiter gesteigert. Die gezeigte direkte Regulation der HEY2 und COUP-TFII Promotoraktivität durch geänderte Strömungsbedingungen spielt in diesem Prozess möglicherweise eine bedeutende Rolle. Die beschriebene Regulation von COUP-TFII durch Glukose in Endothelzellen könnte eine neue Erklärung für die gesteigerte Rate an Gefäßerkrankungen von Typ2-Diabetikern darstellen. Bei der Regulation der endothelialen NO-Synthase und E-Selektin durch COUP-TFII handelt es sich möglicherweise um einen neuen, anti-adhäsiven Feedback-Mechanismus, der zur Verringerung der Leukozyten-Adhäsion an Endothelzellen und damit zur Gefäßprotektion beitragen könnte. Die differentielle Expression der arteriellen Markergene HEY2 und CD44 konnte in humanen venösen und arteriellen Endothelzellen gezeigt werden. Die Untersuchung der Expression von FOXC1 legt nahe, dass es sich bei diesem Transkriptionsfaktor ebenfalls um ein in Endothelzellen arteriovenös differentiell exprimiertes Gen handelt. Die differentielle Exprimierung von HEY2 in Endothelzellen konnte auf transkriptioneller Ebene zusätzlich durch ein HEY2 Promotor Funktionsassay gezeigt werden. Die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne führte zur Induktion der endogenen Expression der NOTCH-Zielgene HEY1 und HEY2 in HEK 293T Zellen. In dem Zelltyp durchgeführte Reportergenassays zeigten ebenfalls eine deutliche Aktivierung des HEY2 Promotors durch die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne. Durch eine Deletionsanalyse konnte der Bereich, der für die Aktivierung verantwortlichen DNA-Sequenz-Motive stark eingegrenzt werden. Weiterhin konnte die Induktion des HEY2 Promotors durch VEGF und seine Repression durch einen γ-Sekretase Inhibitor nachgewiesen werden. Die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne führte zur Verringerung der mRNA- und Protein-Expression von COUP-TFII in HEK 293T Zellen. Dieses Ergebnis konnte zusätzlich durch ein COUP-TFII Promotor Aktivitätsassay nach Überexpression des NOTCH-Zielgens HEY2 gezeigt werden. Die Deletionsanalyse des COUP-TFII Promotors lässt eine direkte Inhibition von COUP-TFII durch HEY2 vermuten. Die Überexpression von COUP-TFII führte zu einer starken Induktion der COUP-TFII mRNA- und Protein-Expression, jedoch weder in HEK 293T Zellen noch in Endothelzellen zu einer Änderung der HEY2 Promotoraktivität. Die Überexpression von FOXC1 und FOXC2 bewirkte eine Inhibition der HEY2 Promotoraktivität in HEK 293T Zellen. Die in der Arbeit gezeigte hohe Expression von FOXC1 in venösen Endothelzellen könnte somit in Kombination mit COUP-TFII für die komplette Repression der Aktivität des HEY2 Promotors in venösen Endothelzellen verantwortlich sein. Die durchgeführte Deletionsanalyse des HEY2 Promotors legt eine direkte Bindung von FOXC1 und FOXC2 an den HEY2 Promotor nahe. Die erzielten Ergebnisse dieser Arbeit sprechen im Kontext mit der Literatur für eine zelltypspezifische Regulierung/Aktivierung des NOTCH-Signalweges und lassen folgendes Modell zur Differenzierung des venösen oder arteriellen endothelialen Phänotyps vermuten: Die Determinierung des Phänotyps wird entschieden durch das Gleichgewicht der Expression der Interaktionspartner des NOTCH-Signalweges. Der VEGF Co-Rezeptor NRP1 und der VEGFR2 sind die entscheidenden Aktivatoren des NOTCH-Signalweges. Die Balance der Bindung des Repressors COUP-TFII an den NRP1 und VEGFR2 Promotor sowie des Aktivatorkomplexes NICD/RBP-JК an den NRP1 Promotor sind damit entscheidend für die Aktivität des NOTCH-Signalweges. NRP1 bindet VEGF und steigert gleichzeitig dessen Bindung an den VEGFR2. Dies führt zur Induktion von DLL4. Die Bindung von DLL4 an die NOTCH1/4 Rezeptoren führt zur Abspaltung der NOTCH intrazellulären Domäne (NICD) des Rezeptors. Die NICD wandert in den Zellkern und aktiviert dort zusammen im Komplex mit dem Transkriptionsfaktor RBP-JК die Gene HEY1, HEY2 und NRP1. Die Transkriptionsfaktoren HEY1 und HEY2 reprimieren über einen Feedback-Mechanismus direkt die Aktivität des COUP-TFII Promotors.