Störungen des PI3K-AKT-Signalweges treten besonders häufig in Endometrium und Ovarialkarzinomen auf. Ursache kann eine Überaktivierung von Wachstumsfaktor-Rezeptoren, Mutationen oder der Funktionsverlust von PTEN sein, was zu einer Störung der Regulation und damit zu einer Überaktivierung des PI3K-AKTSignalweges führt und so das Einleiten autophagischer Prozesse verhindert. Hierauf kommt es zu unkontrollierter Zellvermehrung, welche zur Tumorentstehung und Tumorprogression beiträgt [12][23]. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen konnten zeigen, dass die Hemmung des PI3K-AKT-Signalweges durch den PI3K-Inhibitor AEZS-126 erfolgversprechende antiproliferative Effekte in in vitro-Modellen des Ovarialkarzinoms zeigte. In vitro konnte die niedermolekulare Pyridopyrazin-Verbindung AEZS-126 das Wachstum und die Progression von Zellen der parentalen Ovarialkarzinom-Zelllinie A2780, der daraus abgeleiteten cis-Platin-resistenten Tochterzelllinie Acis2780 und der aus einem Ovar-Adenokarzinom gewonnenen Zelllinie SKOV-3 signifikant hemmen. In Vitalitätsassays ermittelte IC50-Werte lagen im mikromolaren Bereich und zeigten konzentrationsabhängige Antitumor-Effekte. Neben den AEZS-126-abhängigen Effekten wurde auch die Wirksamkeit des mTOR-Inhibitors Rapamycin auf die Zelllinien A2780 und Acis2780 untersucht. Es zeigten sich ebenfalls konzentrationsabhängige antiproliferative Effekte. Durch die Kombination der beiden Inhibitoren AEZS-126 und Rapamycin konnte zusätzlich eine gesteigerte Wirksamkeit gegen die Tumorzellen erzielt werden und synergistische Effekte traten auf. ImWestern-Blot konnte nach Inkubation der Ovarialkarzinomzelllinien mit AEZS-126 durch den Einsatz von AEZS-126 eine verminderte Expression von pAKT nachgewiesen werden, welche insbesondere bei den cis-Platin-resistenten Acis2780-Zellen durch die Kombination mit Rapamycin noch verstärkt wurde. Durch FACS-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Ovarialkarzinomzellen durch die Behandlung mit AEZS-126 im Wachstum gehemmt werden und unabhängig von ihrer Zellzyklusphase in den Zelltod geführt werden können. So zeigte sich in den Zellzyklusanalysen eine konzentrationsabhängige Verschiebung der Zellzahl von der G0/G1-Phase in die sub-G0-Phase, welche die Population der toten Zellen darstellt. Eine Spezifizierung des Zelltod-Mechanismuses erfolgte einerseits durch Annexin-V-FITC-FACS-Analysen und andererseits durch Vitalitätsassays mit Koinkubation von AEZS-126 mit dem Caspase-Inhibitor zVAD-fmk, dem Nekroptose-Inhibitor Necrostatin-1 und dem Nekrose-Inhibitor Necrox-2. Aus diesen Untersuchungen ging klar hervor, dass AEZS-126 in den Zelllinien A2780, Acis2780 und SKOV-3 Nekroptose induziert. Rapamycin alleine zeigte sowohl apoptotische als auch nekrotische Wirkmechanismen. Die Kombination der beiden Inhibitoren AEZS-126 und Rapamycin führte zu einer synergistischen Wirkverstärkung, was sich in einem verstärkten Absterben der Zellen schon bei geringeren eingesetzten Konzentrationen der beiden Inhibitoren zeigte. Auch hier traten hauptsächlich nekrotische Effekte auf. Von besonderem Interesse war die Interaktion von Ovarialkarzinomzellen (A2780, Acis2780), die mit AEZS-126 vorbehandelt worden waren, mit Zellen des Immunsystems. So konnte gezeigt werden, dass AEZS-126 eine verbesserte Zelllyse der Tumorzellen durch NK-Zellen ermöglicht. Zusätzlich konnten die cis-Platin-resistenten Acis2780-Zellen durch Vorbehandlung mit entsprechende Konzentrationen des PI3KInhibitors in vergleichbarem Ausmaß wie die parentalen A2780-Zellen für die Lyse durch NK-Zellen zugänglich gemacht werden. AEZS-126 scheint auf Grund dieser Ergebnisse und der schon nachgewiesenen guten antiproliferativen Wirkung von AEZS-126 auf verschiedene Zelllinien ein geeigneter Kandidat für weiterführende in vivo-Versuche zu sein. Zusätzlich sollte erwogen werden, neben der Inhibiton des PI3K-AKT-Signalweges eine zeitgleiche Hemmung des Ras-Raf-MEK-ERK-Signalweges in Betracht zu ziehen. Durch die Interaktionen der beiden Signalwege könnte es sonst bei der Inaktivierung des einen zur Aktivierung des anderen Signalweges kommen [143]. Durch eine Überexpression von pAKT durch eine PTEN-Mutation kommt es beispielsweise zur Inaktivierung von Ras und der darauf folgenden Signalkaskade, während ein erhöhtes Expressionsniveau an pAKT im PI3K-AKT-Signalweg zu einer Aktivierung von mTOR und damit zur Hemmung autophagischer Prozesse führt [23]. So kann die Phosphorylierung des Proteins p70S6K, dem Schlüsselmolekül zwischen den beiden Signalwegen, welches mTOR nachgeschaltet ist, durch Rapamycin gehemmt werden und damit zu einer erhöhten Aktivierung von AKT und ERK führen [143]. Durch die Kombinationsbehandlung mit Inhibitoren des PI3K-AKT-Signalweges, die an verschiedenen Stellen der Signalkaskade angreifen, kann, wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, die Antitumorwirkung verstärkt werden. Die in dieser Arbeit untersuchten Inhibitoren AEZS-126 und Rapamycin zeigten bei den parentalen Ovarialkarzinom- zellen A2780 und den cis-Platin-resistenten Acis2780-Zellen in der Kombinationsbehandlung synergistische Effekte und führten schon bei geringen Konzentrationen zu verstärkter antiproliferativer Wirksamkeit. Aus den erzielten Ergebnissen geht hervor, dass die Kombinationsbehandlung mit AEZS-126 und Rapamycin geeignet wäre, in in vivo-Experimenten weiter untersucht zu werden. / Purpose Platinum resistance is the most crucial problem for treatment of ovarian cancer. There is a clinical need for new treatment strategies which overcome platinum resistance. Recently high level of AKT was shown to be involved in platinum resistance and furthermore in resistance against Natural-killer (NK)-cell mediated killing in ovarian cancer. Methods Here, we investigate the ability of the PI3K/AKT inhibitor AEZS-126 alone and in combination with rapamycin to selectively target ovarian cancer cell proliferation and survival in vitro by MTT-assays and FACS based analysis. Furthermore the mechanism of cytotoxicity is analysed by FACS based assays. The NK-killing efficiency of ovarian cancer cells with and without pre-treatment with AEZS-126 was analysed. Results AEZS-126 showed good anti-tumour activity in in vitro models of ovarian cancer. Main mechanism of cytotoxicity seems to be necroptosis which could be abrogated by co-incubation with necrostatin-1. Furthermore pre-treatment of platinum resistant cells with AEZS-126 resulted in an increased accessibility of these tumour cells for killing by NK-cells. Conclusion We demonstrated the highly efficient anti-tumour activity of AEZS-126 in in vitro models of ovarian cancer. Due to the good anti-tumour activity and the expected increase in NK-cell mediated killing even of platinum resistant tumour cells, AEZS-126 seems to be a promising candidate for clinical testing in ovarian cancer.

Die Neuralentwicklung wird durch eine Vielzahl von Genen reguliert. Hierbei scheint der Notch-Signaltransduktionsweg eine wichtige Rolle zu spielen. Die primären Zielgene der Notch-Signalkaskaskade sind die Hes- und Hey-Gene. Die genaue Bedeutung der Signalkaskade, der Hes- und insbesondere der Hey-Gene für den Differenzierungsprozess neuraler Stamm- und Vorläuferzellen ist noch nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, die Aufgaben von Notch und der Hey-Gene beim Differenzierungsprozess neuraler Stamm- und Vorläuferzellen genauer zu untersuchen. Da das gezielte Ausschalten eines Gens eine aussagekräftige Methode zur Erforschung seiner Funktion ist, wurden zunächst neurale Stamm- und Vorläuferzellen in Form von sogenannten Neurosphären von Hey1-/- und Hey2-/- Mäuseembryonen mit denen von Wildtyp-Mäuseembryonen verglichen. Dabei differenzierten bei den Hey1-/- Neurosphärenkulturen ca. 6,6% (bei den Kontrollen 6,6%) und bei den Hey2-/- Kulturen 10,9% (Kontrollen 8,7%) der Zellen zu Neuronen. Eine komplette Inhibierung der Notch-Signalkaskade wurde durch das Etablieren von RBP-Jκ-/- Kulturen erreicht. RBP-Jκ-/- Zellen waren jedoch während der Differenzierung nur noch zu einem kleinen Teil in der Lage zu adhärieren, was weitere Experimente mit den Zellen unmöglich machte. Als nächstes sollten Neurosphären mit einer Überexpression von Hey1 mit Wildtyp-Neurosphären verglichen werden. Es gelang allerdings aufgrund einer schon hohen Ausgangsexpression von Hey1 in Neurosphären nur, die Expression zu verdreifachen, was für weitere Experimente nicht ausreichend schien. Um die Prozesse, die auf Genebene während der Differenzierung neuraler Stamm- und Vorläuferzellen ablaufen, besser zu verstehen, wurden die Expression von Genen, die in der Neuralentwicklung und in der Notch-Signalkaskade eine Rolle spielen, in Wildtyp-Neurosphärenzellen mittels qRT-PCR zu verschiedenen Differenzierungszeitpunkten quantifiziert. Die Genexpression von Hes1 und Hes5, sowie Hey2 wurde während der Differenzierung zum Teil deutlich herunterreguliert. Die Gene Hes3, Hey1 und Id4 hingegen stiegen zunächst bis Tag 3 stark an, um dann an Tag 7 und 14 etwa wieder den Ausgangswert zu erreichen. Die Regulation der Gene war insgesamt recht uneinheitlich und nicht immer nachvollziehbar. Da diese teils widersprüchlichen Ergebnisse auf die vorgegebene Heterogenität einer Neurosphärenkultur zurückzuführen sein könnten, wurde nach einer Alternative zur Neurosphärenkultur gesucht. Deshalb wurde im Weiteren versucht homogene Monolayerkulturen nach einem Protokoll von Conti et al. (2005) zu etablieren. Das Protokoll musste aber an einigen Stellen angepasst werden, um adäquate Kulturen zu erhalten. Da die Monolayerkulturen auf Gelatine nicht gut hafteten wurde auf eine Polyornithin-Beschichtung umgestellt. Außerdem wurde das NS-A Medium mit N-2 Zusatz aufgrund schlechter Proliferation der Zellen auf Neurobasalmedium mit B-27 Zusatz umgestellt. Färbungen dieser Monolayerkulturen zeigten, dass sich fast alle Zellen mit dem Stammzellmarker Nestin anfärben ließen und keine Zellen Tuj1+ (Neuronen) und nur einige wenige Zellen Gfap+ (Astrozyten) waren. Es ist deshalb wahrscheinlich, dass die Zellen in einer Monolayerkultur unter den oben beschriebenen Bedingungen hauptsächlich undifferenziert sind und neuralen Stamm- bzw. Vorläuferzellcharakter haben. / Neural development go on in three sequential processes. First expansion of neural stem and precursor cells, then neurogenesis and last the gliogenesis take place. There are different methods to analyse this development in vitro. Cultivation of neurospheres and monolayers are two important possibilities. The cultivation is followed by differentiation to neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Many protocols for cultivation and differentiation of neurospheres and monolayers were tested. But no method did work adequately. So an own procedure was established. Monolayer culturing on polyornithine with Neurobasalmedium®(Gibco) supplemented with B27®(Gibco), FGF and EGF and passaging with Accutase®(PAA) worked best. Differentiation with NeuroCult® NSC Differentiation Supplement(StemCell Technologies) added to Neurobasalmedium showed best results. The neural development is regulated by a lot of genes. Especially the Notch signaling cascade seams to play a central role. The exact role of this cascade and particularly of Hey and Hes genes is not known yet. To analyse the importance of these genes for the differentiation process, the expression of some of these and other genes were quantified by qRT-PCR. The results revealed, that Blbp and Hes5 were downregulated massively. Several differentiated Hey1-/- and Hey2-/- were compared with wildtype lineages. No significant differences in number of neurons (about 8%) and astrocytes (about 85%) were seen. A complete inihibtion of the Notch signaling cascade was reached through establishment of RBP-Jκ-/- lineages. RBP-Jκ-/- cells were no longer able to attach, but didn’t die, after differentiation was initiated. So RBP-Jκ may play a role for the attachment of differentiating neural stem and precursor cells.

Die Signalübertragung durch Wnt/beta-Catenin stellt einen der wichtigsten Signalwege während der Embryogenese sowie im adulten Organismus dar. Die homologen Gerüstproteine Conductin und Axin stehen im Mittelpunkt eines zentralen Multiproteinkomplexes, der im Zytoplasma für die Regulation des Wnt/beta-Catenin-Signalwegs verantwortlich ist. In der vorliegenden Arbeit habe ich eine kombinierte genetische Analyse von Conductin und Axin in der Maus durchgeführt. Dazu habe ich mit Hilfe der Technik der homologen Rekombination das Conductin-Gen deletiert und ein Reportergen unter die Kontrolle des endogenen Conductin-Promotors gebracht. Im Weiteren habe ich festgestellt, dass der gemeinsame Verlust von Conductin und einem Axin-Allel (Con-/-;Ax+/-) zu Holoprosenzephalie (HPE) führt, die durch schwere kraniofazialen und Vorderhirndefekten in der Maus charakterisiert ist. Dabei zeigte die detaillierte Analyse eine genetische Interaktion des Wnt-Signalwegs mit dem Shh-Signalweg. Störungen im Shh-Signalweg sind auch beim Menschen für die Ausbildung von HPE verantwortlich gemacht worden. Daneben führt die gleichzeitige Abwesenheit von Conductin und Axin (Con-/-;Ax-/-) zum Verlust der anterior-posterioren Achse in einem frühen Entwicklungsstadium und zum Absterben der Embryonen nach dem Tag 6,5 der Entwicklung. Die vorliegende Arbeit zeigt, wie Unterschiede in der biologischen Bedeutung zweier funktionell redundanter Faktoren mit genetischen Methoden in der Maus aufgeklärt werden können. / The Wnt/beta-Catenin pathway represents one of the most important signaling cascades during development as well as in the adult organism. The homologous scaffolding proteins Conductin and Axin are the backbone of a central multi protein complex that is responsible for the tight regulation of the Wnt/beta-Catenin pathway in the cytoplasm. In the present study I have performed a combined genetic analysis of Conductin and Axin in the mouse. To this end I have deleted the Conductin gene by homologous recombination in embryonic stem cells and inserted a reporter gene under the control of the endogenous Conductin promoter. I could show that the simultaneous loss of Conductin and one Axin allele (Con-/-;Ax+/-) causes Holoprosencephaly (HPE), which is characterized by severe craniofacial and forebrain defects in the mouse. The detailed analysis of the mutant mice reveals a genetic interaction of Wnt and Shh signaling and defective Shh signaling has previously been implicated in the formation of HPE in human patients. Moreover, complete absence of both Conductin and Axin (Con-/-;Ax-/-) leads to loss of the anterior-posterior axis early in development and death of the embryos after E6.5. The present study exemplifies how differences in the biological function of two mechanistically redundant factors can be studied by genetic means in the mouse.

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Das seit 1957 als essentiell klassifizierte Spurenelement Selen vermittelt seine Funktion hauptsächlich durch seinen Einbau in Selenoproteine in Form der 21. proteinogenen Aminosäure Selenocystein. Insgesamt wurden 25 humane Gene für Selenoproteine identifiziert, deren genaue Funktion häufig noch nicht bekannt ist. Selen ist das einzige Mitglied aus der Gruppe der Mikronährstoffe, für das nach wie vor eine antikanzerogene Funktion vor allem in Bezug auf Darmkrebs postuliert wird. Die Grundlage dafür liefert eine Interventionsstudie, bei der 1.312 Probanden für 4,5 Jahre mit 200 μg Selen/Tag supplementiert wurden. Dies resultierte in einer Senkung der Gesamtkrebsmortalität um 50 %. Die Fragen einer optimalen Selenzufuhr, die nicht nur den Bedarf deckt, sondern auch die Entfaltung der antikanzerogenen Wirkung von Selen gewährleistet und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch ungeklärt. Zudem liegt die Selenzufuhr bei einem Großteil der europäischen Bevölkerung unter den Empfehlungen. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit vier Wochen alte Mäuse für sechs Wochen marginal defizient (0,086 mg/kg Futter) bzw. selenadäquat (0,15 mg/kg Futter) gefüttert. Dieser geringe Unterschied im Selengehalt resultierte in einer Senkung des Plasmaselenspiegels der selenarmen Tiere auf 13 % und der GPx-Aktivität in der Leber auf 35 %. Zunächst wurde der Einfluss von Selen auf die globale Genexpression im murinen Colon mittels Microarray untersucht. Von den im Colon exprimierten Selenoproteinen reagierte die mRNA von SelW, SelH, GPx1 und SelM im Selenmangel besonders deutlich mit Expressionsverlust. Da diese Selenoproteine nicht nur im Colon, sondern auch in Leukozyten reguliert waren, sind sie auch als humane Biomarker für die in dieser Studie gewählte Schwankung des Selengehalts geeignet. Des Weiteren wurde auf Basis der Microarraydaten eine Signalweganalyse durchgeführt, die der Identifizierung krebsrelevanter Signalwege diente, um mögliche molekularbiologische Erklärungsansätze für die Rolle von Selen im Krebsgeschehen zu finden. Es zeigte sich, dass die mRNA von Schlüsselgenen des Wnt-Signalwegs wie β-Catenin, Gsk3β, Dvl2, Tle2, Lef1 und c-Myc auf Schwankungen des Selengehalts reagiert. Vor allem die Induktion von c-Myc, einem Zielgen des Wnt-Signalwegs, deutet darauf hin, dass dieser im Selenmangel tatsächlich aktiver ist als bei selenadäquater Versorgung. Ein weiterer möglicher Erklärungsansatz für die postulierte präventive Funktion von Selen gegenüber Darmkrebs ist die gastrointestinale Glutathionperoxidase (GPx2), die physiologisch in den proliferierenden Zellen des Kryptengrunds exprimiert wird. Die Regulation dieses Enzyms durch den Wnt-Signalweg, der ebenfalls in proliferierenden Zellen aktiv ist, konnte mittels Reportergenanalyse und endogen auf mRNA- und Proteinebene in Zellkultur gezeigt werden. Die Aktivierung verkürzter Promotorkonstrukte und die Mutation eines potentiellen Bindeelements identifizierten den für die Bindung von TCF und β-Catenin verantwortlichen Bereich. Als Zielgen des Wnt-Signalwegs scheint GPx2 zu den an Proliferationsprozessen beteiligten Genen zu gehören, was unter physiologischen Bedingungen die Aufrechterhaltung des intestinalen Epithels gewährleistet. Bei der Entstehung intestinaler Tumore, die in der Initiationsphase zu über 90 % mit einer konstitutiven Aktivierung des Wnt-Signalwegs einhergeht, wirkt GPx2 möglicherweise prokanzerogen. Die genaue Funktion von GPx2 während der Kanzerogenese bleibt weiter zu untersuchen. / Suboptimal selenium (Se) status has been suggested to be associated with a higher risk of developing various cancers, especially colon cancer. In mammals, Se exerts its functions through selenoproteins into which it is incorporated as selenocysteine. Since the function of many selenoproteins has not been identified the underlying mechanisms of the anti-carcinogenic function of Se remains unclear. Therefore, mice were fed either a marginal Se-deficient diet (0.086 mg Se/kg) or a Se-adequate diet (0.15 mg Se/kg) for six weeks. The plasma Se level was reduced to 13 % in the Se-deficient group while GPx activity in the liver was reduced to 35 %. The influence of Se on the global gene expression pattern was analysed using microarray technology. Among selenoproteins SelW, GPx1, SelH and SelM were consistently lower expressed in animals fed with the Se-deficient diet. As the mRNA of these genes was regulated in leucocytes as well, they are possible new biomarkers for the Se status in human studies. In addition, pathway analysis revealed that the cancer-relevant Wnt pathway was affected by the Se status, indicated by changes in the mRNA expression of key proteins like β-catenin, Gsk3β, Dvl2, Tle2, Lef1 and the Wnt target gene c-Myc. The regulation of these genes by Se points to a slightly increased basal activity level of the Wnt pathway in the Se poor state and may therefore contribute to the higher cancer risk in a marginal Se deficiency. Another possible explanation for anti-carcinogenic effects of Se is the gastrointestinal glutathione peroxidase GPx2, a selenoprotein predominantly expressed in proliferating cells at the crypt grounds of the intestine. The regulation of GPx2 via the Wnt pathway was confirmed by reporter gene experiments and by analysing endogenous GPx2 expression on the mRNA as well as on the protein level in different cell culture systems. Shortened promoter constructs and the mutation of a potential TCF binding element identified the area responsible for β-catenin/TCF binding. GPx2 is the first selenoprotein identified as a target of the Wnt pathway. This finding suggests a function of GPx2 in the maintenance of normal renewal of the intestinal epithelium as well as in cancer development.

Hedgehog is a lipid-linked morphogen that is carried on lipoprotein particles and that regulates both patterning and proliferation in a wide variety of vertebrate and invertebrate tissues. Hyperactivity of Hedgehog signaling causes numerous forms of cancer. Hedgehog acts by binding to its receptor Patched, relieving the suppression of Smoothened and initiating Smoothened signaling. The mechanism by which Patched represses Smoothened has been unclear, but correlates with reduced Smoothened levels on the basolateral membrane. The structural homology of Patched with the Niemann-Pick-Type C1 protein and bacterial transmembrane transporters suggests that Patched might regulate lipid trafficking to repress Smoothened. However, no endogenous lipid regulators of Smoothened have yet been identified, nor has it ever been shown that Patched actually controls lipid trafficking. This work shows that, in Drosophila melanogaster, the Sterol-Sensing Domain of Patched regulates Smoothened trafficking from Patched-positive endosomes. Furthermore, it demonstrates that Patched recruits internalized lipoproteins to Patched-positive endosomes. Thereby, Patched regulates the efflux of specific lipoprotein-derived lipids from this compartment via its Sterol-Sensing Domain and utilizes these lipids to destabilize Smoothened on the basolateral membrane. We propose that Patched normally promotes Smoothened degradation and subsequently downregulates its activity by changing the lipid composition of endosomes through which Smoothened passes. For this purpose, Patched utilizes a specific lipid – possibly a modified sterol or sphingolipid – derived from lipoproteins. Further, we suggest that the presence of Hedgehog on lipoprotein particles inhibits utilization of their lipids by Patched.

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The interplay between biochemical signals and mechanical processes during animal development is key for the formation of tissues and organs with distinct shapes and functions. An important step during the formation of many tissues is the formation of compartment boundaries which separate cells of different fates and functions. Compartment boundaries are lineage restrictions that are characterized by a straight morphology. Biochemical signaling across compartment boundaries induce the expression of morphogens in the cells along the boundaries. These morphogens then act at long-range to direct growth and patterning of the whole tissue. Compartment boundaries stabilize the position of morphogens and thereby contribute to proper tissue development. The straight morphology of compartment boundaries is challenged by cell rearrangements caused by cell division and tissue reshaping. Physical mechanisms are therefore required to maintain the straight morphology of compartment boundaries. The anteroposterior (A/P) compartment boundary in the developing Drosophila melanogaster wing is established by biochemical signals. Furthermore, mechanical processes are required to maintain the straight shape of the A/P boundary. Recent studies show that mechanical tension mediated by actomyosin motor proteins is increased along the A/P boundary. However, it was not understood how biochemical signals interact with mechanical processes to maintain the A/P boundary. Here I provide the first evidence that Hedgehog signaling regulates mechanical tension along the A/P boundary. I was able to show that differences in Hedgehog (Hh) signal transduction activity between the anterior and posterior compartments are necessary and sufficient to maintain the straight shape of the A/P boundary, which is crucial for patterning and growth of the adult wing. Moreover, differences in Hh signal transduction activity are necessary and sufficient for the increase in mechanical tension along the A/P boundary. In addition, differences in Hh signal transduction activity are sufficient to generate smooth borders and to increase mechanical tension along ectopic interfaces. Furthermore, the differential expression of the transmembrane protein Capricious is sufficient to increase mechanical tension along ectopic interfaces. It was previously suggested that mechanical tension is generated by an actomyosin-cable through which the increase in mechanical tension is transmitted between the junctions along the A/P boundary. Here I show that mechanical tension is generated locally at each cell bond and not transmitted between junctions by an actomyosin cable. My results provide new insights for our understanding of the interplay between biochemical signals and mechanical processes during animal development.

Die Inzidenz des Barrett-assoziierten ösophagealen Adenokarzinoms (EAC) steigt in den westlichen Ländern stetig an. Die molekularen Mechanismen in der Pathophysiologie während der neoplastischen Progression von der Barrett-Metaplasie zum Adenokarzinom sind jedoch weitgehend unbekannt. Das Gen Dickkopf 1 (DKK1) kodiert für ein Sekretionsprotein, welches den Wnt/β-Catenin Signalweg inhibiert. DKK1, welches auch ein Wnt-Zielgen ist, ist parallel zum konsekutiv aktiven Wnt/β- Catenin Signalweg im EAC überexprimiert. Daher ist für DKK1 im EAC ein defekter negativer Rückkopplungs-Mechanismus anzunehmen. Ziel dieser Arbeit war es, die Anwendung von DKK1 als einen serologischen Biomarker und die Rolle von DKK1 in der Tumorbiologie anhand eines in vitro Zellkultur-Modells zu untersuchen. Die DKK1-Serumkonzentrationen von EAC-Patienten (n=18) wurden mittels ELISA vor und nach der chirurgischen Tumorresektion bestimmt und mit dem histopathologischen Tumorstadium (TNM-Klassifikation) sowie mit dem Differenzierungsgrad der ösophagealen Karzinomzellen (Grading) korreliert. Die DKK1-Serumkonzentrationen von Barrett-Metaplasie-Patienten (n=18) und gesunden Kontrollpersonen (n=17) wurden ebenfalls bestimmt und in die Analyse mit einbezogen. Die ösphagealen Plattenepithelzelllinien EPC1-hTERT und EPC2- hTERT, die nicht-dysplastische Barrett-Epithelzelllinie CP-A und die HGD-Barrett- Epithelzelllinie CP-B, als auch die beiden ösophagealen Adenokarzinomzelllinien OE33 und OE19 wurden für die Expression und Sekretion von DKK1 mittels RT-PCR, qRT-PCR und Western Blot charakterisiert. Die Funktion von DKK1 wurde in der ösophagealen Adenokarzinomzelllinie OE33 durch Behandlung mit rhDKK1 und rhWnt3a sowie mittels spezifischem siRNA-vermitteltem Knockdown untersucht. Die DKK1-Konzentrationen im Blutserum der gesunden Kontrollpersonen, Barrett- Metaplasie-Patienten und EAC-Patienten zeigten keine signifikanten Unterschiede, obwohl bei den EAC-Patienten deutlich höhere Maximalkonzentrationen von DKK1 detektiert werden konnten als bei den gesunden Kontrollpersonen. Nach der chirurgischen Tumorresektion zeigten die EAC-Patienten eine Tendenz hin zu niedrigeren DKK1-Serumkonzentrationen. Die Ausdehnung des Primärtumors, der Ausmaß des Lymphknotenbefalls und der Differenzierungsgrad der Karzinomzellen hatten jedoch keinen Einfluss auf die DKK1-Serumkonzentrationen. Die ösophageale Adenokarzinomzelllinie OE33 zeigte von allen ösophagealen Zelllinien die stärkste DKK1-Expression. Eine Stimulation mit exogenem rhDKK1 hatte keinen Einfluss auf die Aktivität des Wnt/β-Catenin Zielgens DKK1 und die Zellviabilität, während eine Herunterregulation der endogenen DKK1-Expression mittels siRNA-vermitteltem Knockdown zu einer deutlichen Hemmung der Zellviabilität und Motilität der OE33- Zellen führte. Es zeigte sich eine intrazelluläre Stabilisierung von β-Catenin bei unveränderter Wnt-Zielgenexpression und eine signifikante Dephosphorylierung von der Kinase Akt (*=p<0,05). Außerdem konnte eine Zunahme in der Genexpression von p21 detektiert werden. Die Behandlung der DKK1-Knockdown-OE33-Zellen mit rhWnt3a führte zu keinem veränderten Aktivierungsmuster von GSK3β und hatte zudem keinen Einfluss auf die Wnt-Zielgenexpression und die Zellviabilität. Es konnte gezeigt werden, dass DKK1 in der ösophagealen Adenokarzinomzelllinie OE33 Wnt-unabhängige intrazelluläre Signalwege reguliert, welche die Zellviabilität und Motilität der Karzinomzellen steigern. Über noch unbekannte Mechanismen kommt es dabei zu einer verstärkten Aktivierung der Kinase Akt, welche ihrerseits, vermutlich auch über eine Inaktivierung von p21, eine wichtige Rolle in der Tumorbiologie spielt. Der Verlust der inhibitorischen Funktion von DKK1 im Stadium der Barrett-Metaplasie könnte zudem für die Heraufregulation des Wnt/β-Catenin Signalwegs mitverantwortlich sein und auf diese Weise zusätzlich zur Tumorprogression beitragen. Wnt3a hingegen hat vermutlich auf Grund der konsekutiven Aktivierung des Wnt/β-Catenin Signalwegs in den OE33-Zellen seine Funktion als ein Hauptaktivator verloren. Die weiterführende Untersuchung von DKK1 als ein Mediator der Karzinogenese im ösophagealen Adenokarzinom ist von großer klinischer Relevanz. Ebenfalls sind im Hinblick auf die Funktion von DKK1 als ein potentieller serologischer Biomarker größere klinische Studien notwendig.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................. 3 Einleitung ......................................................................................................................6 1.1. Das ösophageale Adenokarzinom ........................................................................6 1.1.1. Epidemiologie und Prognose .............................................................................6 1.1.2. Die Barrett-Metaplasie als eine präkanzeröse Läsion ........................................9 1.1.3. Früherkennungsstrategien und Therapieoptionen .............................................11 1.2. Wnt/β-Catenin Signalweg......................................................................................13 1.2.1. Bedeutung und Funktionsprinzip .......................................................................13 1.2.2. Das Dickkopfprotein 1 (DKK1).............................................................................14 1.3. Zum Stand der Forschung .....................................................................................15 1.4. Hypothese ..............................................................................................................18 2. Materialien und Methoden ........................................................................................19 2.1. Materialien ............................................................................................................. 19 2.2. Methoden................................................................................................................28 2.2.1. Zellkultur ..............................................................................................................28 2.2.2. Molekularbiologische Arbeiten.............................................................................33 3. Ergebnisse .................................................................................................................43 3.1. Analyse der DKK1-Serumkonzentrationen von EAC-Patienten .............................43 3.2. DKK1-Expression in den ösophagealen Zelllinien ..................................................47 3.3. Funktion von DKK1 in der ösophagealen Adenokarzinomzelllinie OE33 ...............50 4. Diskussion ................................................................................................................ 74 4.1. Interpretation...........................................................................................................74 4.1.1. DKK1 als ein serologischer Biomarker für das EAC............................................ 75 4.1.2. Expression von DKK1 während der neoplastischen Progression........................78 4.1.3. DKK1 als ein Mediator der Karzinogenese im EAC..............................................80 4.1.4. Effekt von DKK1 auf die Aktivität des Wnt/β-Catenin Signalwegs.......................86 4.1.5. Effekt von Wnt3a auf die Aktivität des Wnt/β-Catenin Signalwegs.....................88 4.2. Ausblick...................................................................................................................89 5. Zusammenfassung.................................................................................................... 90 6. Literaturverzeichnis ...................................................................................................92 Anlagen ...................................................................................................................... 103 Abbildungsverzeichnis ............................................................................................... 105 Tabellenverzeichnis .....................................................................................................107 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit ............................................ 108 Lebenslauf................................................................................................................... 109 Danksagung ............................................................................................................... 111

Die angeborene Zwerchfellhernie (congenital diaphragmatic hernia, CDH) ist eine Erkrankung von Neugeborenen, welche mit signifikanten Störungen der Lungenentwicklung einhergeht. Insbesondere die assoziierte pulmonale Hypoplasie und pulmonal arterielle Hypertension stellen die Therapie noch immer vor enorme Herausforderungen. Trotz langjähriger Forschung ist der Pathomechanismus der angeborenen Zwerchfellhernie nicht ausreichend verstanden. Mithilfe des international anerkannten Nitrofen Ratten Modells konnten wir in der vorliegenden Arbeit neue Erkenntnisse der pathobiologischen Vorgänge der Lungenentwicklung bei angeborener Zwerchfellhernie generieren. Im Gegensatz zu vorherigen Experimenten nutzen wir u.a. proteomanalytische Methoden, um eine Vielzahl krankhaft veränderter Signalwege zu detektieren. Dabei wurden fötale Lungen in späten pränatalen Stadien der Lungenentwicklung auf ihr Proteinexpressionsmuster untersucht. Insbesondere die Proteine Tenascin C, CREB-binding protein (CREBBP) sowie Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) waren in CDH-Lungen signifikant verändert. Tenascin C war deutlich reduziert, wohingegen CREBBP und insbesondere STAT3 eine erhöhte Expression aufwiesen. Die Expressionsminderung von Tenascin C bei angeborener Zwerchfellhernie konnten wir in humanen CDH-Lungen bestätigen. Mithilfe von Immunfluoreszenzfärbungen konnte die Expressionssteigerung von STAT3 insbesondere in den bronchialen Epithelzellen dargestellt werden. Wir nutzten ein ex-vivo Modell hypoplastischer Lungen, um den zuvor identifizierten pathologisch veränderten STAT3 Signalweg näher zu untersuchen. Dazu erfolgte die Isolation und in-vitro Kultivierung fötaler Rattenlungen an Tag 15 der embryonalen Entwicklung. Die externe Applikation des Herbizids Nitrofen führte dabei erwartungsgemäß zur Induktion einer pulmonalen Hypoplasie, angezeigt durch eine Abnahme der peripheren Lungenverzweigungen, sowie zu einer Zunahme der peripheren Mesenchymstärke. Auf Proteinebene zeigte sich in den hypoplastischen Lungen eine Aktivierung des STAT3 Signalweges durch eine signifikante Zunahme von phosphoryliertem STAT3 (pSTAT3). Die Applikation des spezifischen STAT3-Inhibitors S3I-201 erzielte eine Korrektur des Lungenwachstums und eine Normalisierung der STAT3 Phosphorylierung. STAT3 und dessen Aktivität ist dieser Arbeit zufolge in CDH-Rattenlungen krankhaft erhöht und die spezifische Inhibition von STAT3 verbessert im ex-vivo hypoplastischen Lungen-Modell das Lungenwachstum signifikant.:Inhaltsverzeichnis BIBLIOGRAPHISCHE BEZEICHNUNG 1. Einführung 1 1.1. Krankheitsbild 1 1.2. Tiermodell 2 1.3. Physiologische Lungenentwicklung 3 1.3.1. Morphologische Entwicklung der Lunge 3 1.3.2. Molekularbiologische Ebene der Lungenentwicklung 4 1.4. Abnormale Lungenentwicklung bei CDH 7 1.5. „Lung explant“ Modell der Lungenhypoplasie 9 1.6. Ziele der Arbeit 10 2. Publikationsmanuskript 11 2.1. Abstract 11 2.2. Methods 12 2.3. Results 13 2.4. Discussion 17 2.5. References 20 2.6. Supplements 22 3. Zusammenfassung der Arbeit 23 4. Referenzen 28 5. Anlagen 33 5.1 Erklärung über den wissenschaftlichen Beitrag des Promovenden zur Publikation 33 5.2. Erklärung über die eigenständige Anfertigung der Arbeit 35 5.3. Curriculum Vitae 36 5.4 Danksagung 39