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Das seit 1957 als essentiell klassifizierte Spurenelement Selen vermittelt seine Funktion hauptsächlich durch seinen Einbau in Selenoproteine in Form der 21. proteinogenen Aminosäure Selenocystein. Insgesamt wurden 25 humane Gene für Selenoproteine identifiziert, deren genaue Funktion häufig noch nicht bekannt ist. Selen ist das einzige Mitglied aus der Gruppe der Mikronährstoffe, für das nach wie vor eine antikanzerogene Funktion vor allem in Bezug auf Darmkrebs postuliert wird. Die Grundlage dafür liefert eine Interventionsstudie, bei der 1.312 Probanden für 4,5 Jahre mit 200 μg Selen/Tag supplementiert wurden. Dies resultierte in einer Senkung der Gesamtkrebsmortalität um 50 %. Die Fragen einer optimalen Selenzufuhr, die nicht nur den Bedarf deckt, sondern auch die Entfaltung der antikanzerogenen Wirkung von Selen gewährleistet und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch ungeklärt. Zudem liegt die Selenzufuhr bei einem Großteil der europäischen Bevölkerung unter den Empfehlungen. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit vier Wochen alte Mäuse für sechs Wochen marginal defizient (0,086 mg/kg Futter) bzw. selenadäquat (0,15 mg/kg Futter) gefüttert. Dieser geringe Unterschied im Selengehalt resultierte in einer Senkung des Plasmaselenspiegels der selenarmen Tiere auf 13 % und der GPx-Aktivität in der Leber auf 35 %. Zunächst wurde der Einfluss von Selen auf die globale Genexpression im murinen Colon mittels Microarray untersucht. Von den im Colon exprimierten Selenoproteinen reagierte die mRNA von SelW, SelH, GPx1 und SelM im Selenmangel besonders deutlich mit Expressionsverlust. Da diese Selenoproteine nicht nur im Colon, sondern auch in Leukozyten reguliert waren, sind sie auch als humane Biomarker für die in dieser Studie gewählte Schwankung des Selengehalts geeignet. Des Weiteren wurde auf Basis der Microarraydaten eine Signalweganalyse durchgeführt, die der Identifizierung krebsrelevanter Signalwege diente, um mögliche molekularbiologische Erklärungsansätze für die Rolle von Selen im Krebsgeschehen zu finden. Es zeigte sich, dass die mRNA von Schlüsselgenen des Wnt-Signalwegs wie β-Catenin, Gsk3β, Dvl2, Tle2, Lef1 und c-Myc auf Schwankungen des Selengehalts reagiert. Vor allem die Induktion von c-Myc, einem Zielgen des Wnt-Signalwegs, deutet darauf hin, dass dieser im Selenmangel tatsächlich aktiver ist als bei selenadäquater Versorgung. Ein weiterer möglicher Erklärungsansatz für die postulierte präventive Funktion von Selen gegenüber Darmkrebs ist die gastrointestinale Glutathionperoxidase (GPx2), die physiologisch in den proliferierenden Zellen des Kryptengrunds exprimiert wird. Die Regulation dieses Enzyms durch den Wnt-Signalweg, der ebenfalls in proliferierenden Zellen aktiv ist, konnte mittels Reportergenanalyse und endogen auf mRNA- und Proteinebene in Zellkultur gezeigt werden. Die Aktivierung verkürzter Promotorkonstrukte und die Mutation eines potentiellen Bindeelements identifizierten den für die Bindung von TCF und β-Catenin verantwortlichen Bereich. Als Zielgen des Wnt-Signalwegs scheint GPx2 zu den an Proliferationsprozessen beteiligten Genen zu gehören, was unter physiologischen Bedingungen die Aufrechterhaltung des intestinalen Epithels gewährleistet. Bei der Entstehung intestinaler Tumore, die in der Initiationsphase zu über 90 % mit einer konstitutiven Aktivierung des Wnt-Signalwegs einhergeht, wirkt GPx2 möglicherweise prokanzerogen. Die genaue Funktion von GPx2 während der Kanzerogenese bleibt weiter zu untersuchen. / Suboptimal selenium (Se) status has been suggested to be associated with a higher risk of developing various cancers, especially colon cancer. In mammals, Se exerts its functions through selenoproteins into which it is incorporated as selenocysteine. Since the function of many selenoproteins has not been identified the underlying mechanisms of the anti-carcinogenic function of Se remains unclear. Therefore, mice were fed either a marginal Se-deficient diet (0.086 mg Se/kg) or a Se-adequate diet (0.15 mg Se/kg) for six weeks. The plasma Se level was reduced to 13 % in the Se-deficient group while GPx activity in the liver was reduced to 35 %. The influence of Se on the global gene expression pattern was analysed using microarray technology. Among selenoproteins SelW, GPx1, SelH and SelM were consistently lower expressed in animals fed with the Se-deficient diet. As the mRNA of these genes was regulated in leucocytes as well, they are possible new biomarkers for the Se status in human studies. In addition, pathway analysis revealed that the cancer-relevant Wnt pathway was affected by the Se status, indicated by changes in the mRNA expression of key proteins like β-catenin, Gsk3β, Dvl2, Tle2, Lef1 and the Wnt target gene c-Myc. The regulation of these genes by Se points to a slightly increased basal activity level of the Wnt pathway in the Se poor state and may therefore contribute to the higher cancer risk in a marginal Se deficiency. Another possible explanation for anti-carcinogenic effects of Se is the gastrointestinal glutathione peroxidase GPx2, a selenoprotein predominantly expressed in proliferating cells at the crypt grounds of the intestine. The regulation of GPx2 via the Wnt pathway was confirmed by reporter gene experiments and by analysing endogenous GPx2 expression on the mRNA as well as on the protein level in different cell culture systems. Shortened promoter constructs and the mutation of a potential TCF binding element identified the area responsible for β-catenin/TCF binding. GPx2 is the first selenoprotein identified as a target of the Wnt pathway. This finding suggests a function of GPx2 in the maintenance of normal renewal of the intestinal epithelium as well as in cancer development.

Die Inzidenz des Barrett-assoziierten ösophagealen Adenokarzinoms (EAC) steigt in den westlichen Ländern stetig an. Die molekularen Mechanismen in der Pathophysiologie während der neoplastischen Progression von der Barrett-Metaplasie zum Adenokarzinom sind jedoch weitgehend unbekannt. Das Gen Dickkopf 1 (DKK1) kodiert für ein Sekretionsprotein, welches den Wnt/β-Catenin Signalweg inhibiert. DKK1, welches auch ein Wnt-Zielgen ist, ist parallel zum konsekutiv aktiven Wnt/β- Catenin Signalweg im EAC überexprimiert. Daher ist für DKK1 im EAC ein defekter negativer Rückkopplungs-Mechanismus anzunehmen. Ziel dieser Arbeit war es, die Anwendung von DKK1 als einen serologischen Biomarker und die Rolle von DKK1 in der Tumorbiologie anhand eines in vitro Zellkultur-Modells zu untersuchen. Die DKK1-Serumkonzentrationen von EAC-Patienten (n=18) wurden mittels ELISA vor und nach der chirurgischen Tumorresektion bestimmt und mit dem histopathologischen Tumorstadium (TNM-Klassifikation) sowie mit dem Differenzierungsgrad der ösophagealen Karzinomzellen (Grading) korreliert. Die DKK1-Serumkonzentrationen von Barrett-Metaplasie-Patienten (n=18) und gesunden Kontrollpersonen (n=17) wurden ebenfalls bestimmt und in die Analyse mit einbezogen. Die ösphagealen Plattenepithelzelllinien EPC1-hTERT und EPC2- hTERT, die nicht-dysplastische Barrett-Epithelzelllinie CP-A und die HGD-Barrett- Epithelzelllinie CP-B, als auch die beiden ösophagealen Adenokarzinomzelllinien OE33 und OE19 wurden für die Expression und Sekretion von DKK1 mittels RT-PCR, qRT-PCR und Western Blot charakterisiert. Die Funktion von DKK1 wurde in der ösophagealen Adenokarzinomzelllinie OE33 durch Behandlung mit rhDKK1 und rhWnt3a sowie mittels spezifischem siRNA-vermitteltem Knockdown untersucht. Die DKK1-Konzentrationen im Blutserum der gesunden Kontrollpersonen, Barrett- Metaplasie-Patienten und EAC-Patienten zeigten keine signifikanten Unterschiede, obwohl bei den EAC-Patienten deutlich höhere Maximalkonzentrationen von DKK1 detektiert werden konnten als bei den gesunden Kontrollpersonen. Nach der chirurgischen Tumorresektion zeigten die EAC-Patienten eine Tendenz hin zu niedrigeren DKK1-Serumkonzentrationen. Die Ausdehnung des Primärtumors, der Ausmaß des Lymphknotenbefalls und der Differenzierungsgrad der Karzinomzellen hatten jedoch keinen Einfluss auf die DKK1-Serumkonzentrationen. Die ösophageale Adenokarzinomzelllinie OE33 zeigte von allen ösophagealen Zelllinien die stärkste DKK1-Expression. Eine Stimulation mit exogenem rhDKK1 hatte keinen Einfluss auf die Aktivität des Wnt/β-Catenin Zielgens DKK1 und die Zellviabilität, während eine Herunterregulation der endogenen DKK1-Expression mittels siRNA-vermitteltem Knockdown zu einer deutlichen Hemmung der Zellviabilität und Motilität der OE33- Zellen führte. Es zeigte sich eine intrazelluläre Stabilisierung von β-Catenin bei unveränderter Wnt-Zielgenexpression und eine signifikante Dephosphorylierung von der Kinase Akt (*=p<0,05). Außerdem konnte eine Zunahme in der Genexpression von p21 detektiert werden. Die Behandlung der DKK1-Knockdown-OE33-Zellen mit rhWnt3a führte zu keinem veränderten Aktivierungsmuster von GSK3β und hatte zudem keinen Einfluss auf die Wnt-Zielgenexpression und die Zellviabilität. Es konnte gezeigt werden, dass DKK1 in der ösophagealen Adenokarzinomzelllinie OE33 Wnt-unabhängige intrazelluläre Signalwege reguliert, welche die Zellviabilität und Motilität der Karzinomzellen steigern. Über noch unbekannte Mechanismen kommt es dabei zu einer verstärkten Aktivierung der Kinase Akt, welche ihrerseits, vermutlich auch über eine Inaktivierung von p21, eine wichtige Rolle in der Tumorbiologie spielt. Der Verlust der inhibitorischen Funktion von DKK1 im Stadium der Barrett-Metaplasie könnte zudem für die Heraufregulation des Wnt/β-Catenin Signalwegs mitverantwortlich sein und auf diese Weise zusätzlich zur Tumorprogression beitragen. Wnt3a hingegen hat vermutlich auf Grund der konsekutiven Aktivierung des Wnt/β-Catenin Signalwegs in den OE33-Zellen seine Funktion als ein Hauptaktivator verloren. Die weiterführende Untersuchung von DKK1 als ein Mediator der Karzinogenese im ösophagealen Adenokarzinom ist von großer klinischer Relevanz. Ebenfalls sind im Hinblick auf die Funktion von DKK1 als ein potentieller serologischer Biomarker größere klinische Studien notwendig.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................. 3 Einleitung ......................................................................................................................6 1.1. Das ösophageale Adenokarzinom ........................................................................6 1.1.1. Epidemiologie und Prognose .............................................................................6 1.1.2. Die Barrett-Metaplasie als eine präkanzeröse Läsion ........................................9 1.1.3. Früherkennungsstrategien und Therapieoptionen .............................................11 1.2. Wnt/β-Catenin Signalweg......................................................................................13 1.2.1. Bedeutung und Funktionsprinzip .......................................................................13 1.2.2. Das Dickkopfprotein 1 (DKK1).............................................................................14 1.3. Zum Stand der Forschung .....................................................................................15 1.4. Hypothese ..............................................................................................................18 2. Materialien und Methoden ........................................................................................19 2.1. Materialien ............................................................................................................. 19 2.2. Methoden................................................................................................................28 2.2.1. Zellkultur ..............................................................................................................28 2.2.2. Molekularbiologische Arbeiten.............................................................................33 3. Ergebnisse .................................................................................................................43 3.1. Analyse der DKK1-Serumkonzentrationen von EAC-Patienten .............................43 3.2. DKK1-Expression in den ösophagealen Zelllinien ..................................................47 3.3. Funktion von DKK1 in der ösophagealen Adenokarzinomzelllinie OE33 ...............50 4. Diskussion ................................................................................................................ 74 4.1. Interpretation...........................................................................................................74 4.1.1. DKK1 als ein serologischer Biomarker für das EAC............................................ 75 4.1.2. Expression von DKK1 während der neoplastischen Progression........................78 4.1.3. DKK1 als ein Mediator der Karzinogenese im EAC..............................................80 4.1.4. Effekt von DKK1 auf die Aktivität des Wnt/β-Catenin Signalwegs.......................86 4.1.5. Effekt von Wnt3a auf die Aktivität des Wnt/β-Catenin Signalwegs.....................88 4.2. Ausblick...................................................................................................................89 5. Zusammenfassung.................................................................................................... 90 6. Literaturverzeichnis ...................................................................................................92 Anlagen ...................................................................................................................... 103 Abbildungsverzeichnis ............................................................................................... 105 Tabellenverzeichnis .....................................................................................................107 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit ............................................ 108 Lebenslauf................................................................................................................... 109 Danksagung ............................................................................................................... 111

Die heterogene Biologie der diffusen großzelligen B-Zell-Lymphome (DLBCL) und die daraus resultierenden Unterschiede in Therapieansprechen und Prognose stellen ein wesentliches Problem in der aktuellen Therapie von DLBCL dar. Anomalien im kanonischen Wnt-Signalweg und seinen natürlichen Antagonisten wie secreted frizzled-related proteins (SFRPs) sind für verschiedene solide und hämatologische Malignome als wichtige Bestandteile der Tumorgenese und Tumorprogression identifiziert worden. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe lieferten Hinweise für die Bedeutung von Wnt3a und SFRP4 in der Regulation von DLBCL. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, welche Rolle dem Protein SFRP4 in der Wachstumsregulation von diffusen großzelligen B-Zell-Lymphomen zukommt. Die Synthese von SFRP4 wurde in den als Modellzelllinien genutzten humanen DLBCL-Zelllinien nachgewiesen. Unter Verwendung von rekombinantem humanen SFRP4 sowie einer mittels lentiviraler shRNA erzeugten Expressionsreduktion von SFRP4 konnte gezeigt werden, dass SFRP4 zu einer Expansionshemmung sowie zu einer reduzierten Klonogenität bei DLBCL-Zellen führt. Als Ursache für diese Effekte konnte die Inhibition des kanonischen Wnt-Signalwegs durch SFRP4 identifiziert werden. SFRP4 wurde hinsichtlich seiner Bedeutung für die Ausprägung der Side Population (SP), einer Tumorzellsubpopulation mit repopulativem Potenzial, in DLBCL-Zellen untersucht. Dabei wurde sowohl durch exogene Zugabe als auch durch Reduktion von SFRP4 auf Transkriptebene die Bedeutsamkeit von SFRP4 für die SP-Regulation gezeigt. Untersuchungen zur differentiellen SFRP4-Expression sowie SFRP4-Promotormethylierung in Side Population versus non-Side Population wiesen epigenetische Mechanismen in der Regulation des SP-Phänotyps nach. Das DNA-demethylierende Medikament 5-Azacytidine reduzierte in DLBCL-Zelllinien Expansion sowie Klonogenität. Darüber hinaus beeinflusste 5-Azacytidine den kanonischen Wnt-Signalweg und den SFRP4-Gehalt der DLBCL-Zellen. Die Bedeutung von Exosomen als interzelluläre Kommunikatoren, die Wnt-Proteine transportieren, wurde unter besonderer Berücksichtigung von SFRP4 evaluiert. Sowohl SFRP4 als auch Wnt3a waren in der Exosomen- und der Mikrovesikelfraktion von DLBCL-Zellen nachweisbar. Die Exosomen waren in der Lage, den kanonischen Wnt-Signalweg an den Zielzellen zu aktivieren und Einfluss auf die Side Population zu nehmen. Insgesamt wurde für SFRP4 erstmalig eine hemmende Wirkung auf das Wachstum von DLBCL-Zellen demonstriert. Weiterführende Studien können adressieren, inwiefern die aufgezeigten Mechanismen der Wachstumsmodulation von DLBCL-Zellen durch SFRP4 in therapeutischen Anwendungen genutzt werden können.

Die Signalübertragung durch Wnt/beta-Catenin stellt einen der wichtigsten Signalwege während der Embryogenese sowie im adulten Organismus dar. Die homologen Gerüstproteine Conductin und Axin stehen im Mittelpunkt eines zentralen Multiproteinkomplexes, der im Zytoplasma für die Regulation des Wnt/beta-Catenin-Signalwegs verantwortlich ist. In der vorliegenden Arbeit habe ich eine kombinierte genetische Analyse von Conductin und Axin in der Maus durchgeführt. Dazu habe ich mit Hilfe der Technik der homologen Rekombination das Conductin-Gen deletiert und ein Reportergen unter die Kontrolle des endogenen Conductin-Promotors gebracht. Im Weiteren habe ich festgestellt, dass der gemeinsame Verlust von Conductin und einem Axin-Allel (Con-/-;Ax+/-) zu Holoprosenzephalie (HPE) führt, die durch schwere kraniofazialen und Vorderhirndefekten in der Maus charakterisiert ist. Dabei zeigte die detaillierte Analyse eine genetische Interaktion des Wnt-Signalwegs mit dem Shh-Signalweg. Störungen im Shh-Signalweg sind auch beim Menschen für die Ausbildung von HPE verantwortlich gemacht worden. Daneben führt die gleichzeitige Abwesenheit von Conductin und Axin (Con-/-;Ax-/-) zum Verlust der anterior-posterioren Achse in einem frühen Entwicklungsstadium und zum Absterben der Embryonen nach dem Tag 6,5 der Entwicklung. Die vorliegende Arbeit zeigt, wie Unterschiede in der biologischen Bedeutung zweier funktionell redundanter Faktoren mit genetischen Methoden in der Maus aufgeklärt werden können. / The Wnt/beta-Catenin pathway represents one of the most important signaling cascades during development as well as in the adult organism. The homologous scaffolding proteins Conductin and Axin are the backbone of a central multi protein complex that is responsible for the tight regulation of the Wnt/beta-Catenin pathway in the cytoplasm. In the present study I have performed a combined genetic analysis of Conductin and Axin in the mouse. To this end I have deleted the Conductin gene by homologous recombination in embryonic stem cells and inserted a reporter gene under the control of the endogenous Conductin promoter. I could show that the simultaneous loss of Conductin and one Axin allele (Con-/-;Ax+/-) causes Holoprosencephaly (HPE), which is characterized by severe craniofacial and forebrain defects in the mouse. The detailed analysis of the mutant mice reveals a genetic interaction of Wnt and Shh signaling and defective Shh signaling has previously been implicated in the formation of HPE in human patients. Moreover, complete absence of both Conductin and Axin (Con-/-;Ax-/-) leads to loss of the anterior-posterior axis early in development and death of the embryos after E6.5. The present study exemplifies how differences in the biological function of two mechanistically redundant factors can be studied by genetic means in the mouse.

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