TREX2, a 3’-5’ exonuclease, plays a pivotal role in cleaving nucleoside monophosphates at the 3’ terminus of ssDNA. Despite previous insights into its biochemical functions—homodimerisation, DNA binding, and enzymatic activity—the precise biological significance of TREX2 remains elusive. The broad objective of this thesis was to elucidate the physiological function of the 3’-5’ DNA exonuclease TREX2, aiming to deepen our understanding of the cellular mechanisms governed by TREX2. Considering the implications of DNA exonuclease dysregulation in autoimmune disorders, we aimed to explore the potential implications of TREX2 deficiency on immune function. Due to the lack of anti-TREX2 antibodies recognising endogenous TREX2, we worked on overexpression systems. During interphase, GFP-tagged TREX2 predominantly localised to the cytoplasm; however, throughout all stages of mitosis, it accumulated within the nucleus, showing significant colocalisation with chromatin. This suggests a multifaceted role for TREX2 in maintaining chromatin integrity during cell division. Utilising the CRISPR-Cas9 knockout technique, we targeted the TREX2 gene in wildtype HaCaT cells. Our unexpected findings revealed that TREX2 deficiency led to reduced basal type I IFN activity, contrary to the anticipated effect observed with TREX1 deficiency. This suggests that TREX2 plays a crucial role in maintaining the homeostasis of the type I IFN pathway. Moreover, upon stimulation with cGAS- specific agonists, TREX2 knockout HaCaT cells exhibited diminished responsiveness, supporting a positive regulatory function of TREX2 in the cGAS-sensing pathway. Live imaging further demonstrated colocalisation of TREX2 and cGAS with mitotic chromatin, underscoring their collaborative role in cellular dynamics. In conclusion, TREX2 emerges as a crucial player in regulating the type I IFN pathway, influencing immune homeostasis in association with cGAS. These findings pave the way for comprehending the intricate interplay of TREX2 in cellular processes and its implications for immune modulation.

Der RAF-MEK-ERK-Signalweg steuert grundlegende, oftmals entgegengesetzte zelluläre Prozesse wie die Proliferation und Apoptose von Zellen. Die Dauer des vermittelten Signals wurde als entscheidener Faktor für die Steuerung dieser Prozesse identifiziert. Es ist jedoch nicht eindeutig geklärt, wie die verschiedenen früh und spät reagierenden Genexpressionsmodule kurze und lange Signale unterscheiden können und durch welche kinetischen Merkmale ihre Antwortzeit bestimmt wird. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl Proteinphosphorylierungsdaten als auch Genexpressionsdaten aus HEK293-Zellen gewonnen, die ein induzierbares Konstrukt des Proto-Onkogens RAF tragen. Hierbei wurde ein neues Genexpressionsmodul identifiziert, dass sich aus sofort induzierten aber spät antwortenden Genen zusammensetzt. Es unterscheidet sich in der Genexpressionsdynamik und Genfunktion von anderen Modulen, und wurde mit Hilfe mathematischer Modellierung experimenteller Daten identifiziert. Es wurde festgestellt, dass diese Gene aufgrund von langen Halbwertszeiten der vermitteltenden mRNA in der Lage sind spät auf das eingehende Signal zu reagieren und die Dauer des Signals in die Amplitude der Genantwort zu übersetzen. Trotz der langsamen Akkumulation und damit späten Antwortzeit, konnte aufgrund einer GC-reichen Promoterstruktur zunächst vermutet und mit Hilfe eines Markerverfahrens bestätigt werden, dass die Transkription dieser Gene instantan mit Beginn der ERK-Aktivierung startet. Eine vergleichende Analyse zeigte, dass das Prinzip der Signaldauer-Entschlüsselung in PC12-Zellen und MCF7-Zellen, zwei paradigmatischen Zellsystemen für die ERK-Signaldauer, konserviert ist. Insgesamt deuten die Ergebnisse der Untersuchung darauf hin, dass das neu identifizierte Genexpressionsmodul der Entschlüsselung der ERK-Signaldauer dient und das mRNA Halbwertszeiten sowohl hierfür, als auch für die zeitliche Abfolge der Genantwort eine entscheidende Rolle spielen. / The RAF-MEK-ERK signalling pathway controls fundamental, often opposing cellular processes such as proliferation and apoptosis. Signal duration has been identified to play a decisive role in these cell fate decisions. However, it remains unclear how the different early and late responding gene expression modules can discriminate short and long signals and what features govern their timing. Both protein phosphorylation and gene expression time course data was obtained from HEK293 cells carrying an inducible construct of the proto-oncogene RAF. A new gene expression module of immediate-late genes (ILGs) distinct in gene expression dynamics and function was identified by mathematical modelling. It was found that mRNA longevity enables these ILGs to respond late and thus translate ERK signal duration into response amplitude. Despite their late response, their GC-rich promoter structure suggested and metabolic labelling with 4SU confirmed that transcription of ILGs is induced immediately. A comparative analysis showed that the principle of duration decoding is conserved in PC12 cells and MCF7 cells, two paradigm cell systems for ERK signal duration. Altogether, the findings of this study indicate that ILGs decode ERK signal duration and that both decoding capacity and gene expression timing are governed by mRNA half-life.

Wachstumsfaktor bedingte Aktivierung des PI3K/Akt/mTOR Signalweg wirkt positiv auf Vermehrung und Überleben. Konstitutive Aktivierung des Signalweges in NHL ist jedoch an Tumorprogression und Therapieresistenz beteiligt. Am Zelllinienmodell wurden zwei mögliche Therapiestrategien der PI3K/Akt/mTOR Inhibition erprobt, PI3K Inhibition mit BKM120 und horizontale Kombination von Zytostatika mit PI3K/Akt/mTOR Inhibitoren Erstens, BKM120 hat Antitumoraktivität in NHL und induziert Zelltod. Auf molekularer Ebene führt BKM120 vermittelte Dephosphorylierung von CDK1 an Y15 zur Aktivierung des M-Phase Komplex CDK1/Zyklin B und Eintritt in die Mitose. Parallel erlaubt die Degradation von Zyklin A und Hochregulation von Zyklin B Progression bis zur Metaphase, hemmt jedoch die Transition in die Anaphase. Anhaltender Metaphasearrest bewirkt programmierten Zelltod über den intrinsischen Signalweg der Apoptose durch Hochregulation der BH3-onlys Puma und Hrk, Aktivierung von Bax/Bak und proteolytische Spaltung von Caspase 9. Verlust von Bax/Bak oder Caspase Inhibition schützt vor BKM120 vermitteltem Zelltod. Bax/Bak defiziente Zellen, welche zusätzlich p53 Mutationen aufweisen, werden polyploid. Die Polyploidie ist ATM-MEK1/2 abhängig und kann mit Caffeine oder U0126blockiert werden. Zur Vermeidung von Polyploidie bedingter Tumorprogression, sollte BKM120 nur in Verbindung mit MAPK/ATM Inhibitoren verwendet werden. Zweitens. Horizontale Kombination PI3K/Akt/mTOR Inhibitoren mit cytotoxischen Substanzen schützt vor Apoptose. Der Schutzeffekt tritt auschließlich bei niedrigen Konzentration auf und ist unabhängig von der Art des Inhibitors bzw. Ebene der Inhibition. Das Onkogen und NFkB Target Pim-2 ist möglicherweise am Schutzmechanismus beteiligt. Durch die PI3K/Akt/mTOR vermittelte Pim-2 Regulation ergibt sich eine neue Rückkopplungsschleife. Im Fazit erschwert die Komplexizität des PI3K/Akt/mTOR Signalweges die Etablierung von Therapien. / Growth factor mediated activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway positively regulates proliferation and survival. Constitutive activation in NHL, however, is correlated with tumor progression and therapeutic resistance. Therefore, two possible strategies were tested in a cell line model system, Inhibition of PI3K with BKM120 and PI3K/Akt/mTOR Inhibition in addition to cytostatic drug administration. First, it is demonstrated that the pan PI3K inhibitor BKM120 has antitumor activity in NHL and induces cell death. On molecular level, BKM120 mediated dephosphorylation of CDK1 on Y15 causes activation of the M-phase complex CDK1/Cyclin B and entry into mitosis. In parallel, degradation of Cyclin A and Upregulation of Cyclin B enables progression into metaphase but inhibits transition into anaphase. Prolonged metaphase arrest induces programmed cell death via the intrinsic apoptosis pathway by upregulation of the BH3-onlys Puma and Hrk, activation of Bax/Bak and proteolytic cleavage of caspase-9. Loss of Bax/Bak or caspase inhibition protects from BKM120 induced apoptosis. Bax/Bak deficient cells with additional p53 mutation become polyploid. This polyploidy is ATM-MEK1/2 dependent and can be blocked with Caffeine or U0126. To prevent polyploidy related tumor progression, BKM120 should administered only in combination with ATM or MEK inhibitors. Second, combination of PI3K/Akt/mTOR inhibitors with cytotoxic agents protects from apoptosis. The protective effect is only detectable with low PI3K/Akt/mTOR inhibitor concentrations and independent of inhibitor type or cascade level. The oncogene and NFkB target is possibly involved in apoptosis protection and inhibition of NFkB neutralizes the protective effect. PI3K/Akt/mTOR mediated Pim-2 regulation reveals a new feedback loop within the pathway. In conclusion, the complexity of the PI3K/Akt/mTOR pathway impedes therapeutic targeting.

Ein Signalweg während der neuronalen Entwicklung im adulten Gehirn ist der PI3K-PTEN-Akt Signalweg. Akt ist eine Kinase die drei verschiedene Isoformen besitzt, welche durch die Phosphorylierung von S473 und T308 aktiviert werden. KO Modelle der Isoformen haben gezeigt, dass nicht alle Funktionen von anderen Isoformen kompensiert werden können. Die genaue Rolle der einzelnen Isoformen in einem neuronalen Zusammenhang ist nur wenig untersucht. Ziel dieser Arbeit war, eine detaillierte Analyse der einzelnen Akt Isoformen nach der Aktivierung des PI3K-PTEN Signalweges. Dazu wurde im Labor eine neue Methode zur isoelektrischen Fokussierung etabliert., welche Proteine nach ihrer Ladung trennt und somit eine Analyse der Dynamik von Akt Phosphorylierungen in neuronalen Zellen erlaubt. Im Zuge dieser Arbeit konnten wir bisher unerkannte Merkmale der Akt Aktivierung und Phosphorylierung identifizieren. Wir konnten zeigen, dass die S473 und T308 Phosphorylierung in Neuroblastomazellen unabhängig voneinander auftreten kann und, dass verschiedene Akt1 Moleküle unterschiedlich auf die Inhibition von PI3K reagieren. Außerdem konnten wir Verschiebungen in der Aktivierung und in der Expression der unterschiedlichen Isoformen während der postnatalen Gehirnentwicklung der Ratte feststellen. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass die Aktivierung von Akt von dem Signal und dem Alter der Neurone abhängig ist. Noch nicht vollständig differenzierte Neurone reagieren vor allem auf BDNF Stimulation, wohingegen adulte, differenzierte Neurone hauptsächlich auf EGF reagieren und dort explizit Akt2 über EGFR und PI3K-p110α Signale aktiviert wird. Im Gegensatz dazu führt der Verlust von PTEN zu einer Aktivierung von hauptsächlich Akt1. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit einen komplexen Zusammenhang der Phosphorylierung von Akt auf, welcher Signal- und Entwicklungsabhängig ist bei dem unterschiedliche Akt Populationen auf Wachstumsfaktoren und auf PTEN Verlust reagieren. / A major pathway involved in neuronal development is the PI3K-PTEN-Akt pathway. Akt comprises three isoforms, which are activated by phosphorylation of the residues S473 and T308. KO animals for the isoforms have shown differential as well as redundant functions of the three isoforms. However, their individual role in neuronal signaling pathways has not yet been studied in great detail. The aim of this study was to obtain further insight into differential Akt isoform signaling in response to changes in the activity of PI3K and PTEN pathway. A new isoelectric focusing method was established, which allowed us to separate Akt proteins according to their charge, therefore, providing a refined read-out to study dynamics of Akt phosphorylation in a neuronal background. In the course of this project we were able to identify previously undescribed features of Akt phosphorylation and activation. First, we could provide evidence for an uncoupling of the two activating phosphorylation events at S473 and T308 in neuroblastoma cells and differential sensitivities of Akt1 forms towards PI3K inhibition. Secondly, we found a transient shift in Akt isoform activation and abundance during postnatal rat brain development. Thirdly, we were able to show that the activation of different Akt isoforms is dependent of the upstream signal as well as the age of the neuron. Immature neurons were found to be highly responsive to BDNF treatment, whereas mature neurons were most responsive to EGF stimulation leading exclusively to activation of Akt2 in an EGFR- and PI3K/p110α-dependent manner. Stimulation of Akt phosphorylation by the loss of PTEN led to an activation of mainly Akt1 forms, which suggests inherent differences in the Akt pools that are accessible to growth factors dependent PI3Ks as compared to the pools that are controlled by PTEN. In summary, this thesis demonstrates the presence of complex phosphorylation events of Akt in a developmental- and signal-dependent manner in neurons.

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Information spielt in der Natur eine zentrale Rolle. Als intrinsischer Teil des genetischen Codes ist sie das Grundgerüst jeder Struktur und ihrer Entwicklung. Im Speziellen dient sie auch Organismen, ihre Umgebung wahrzunehmen und sich daran anzupassen. Die Grundvoraussetzung dafür ist, dass sie Information ihrer Umgebung sowohl messen als auch interpretieren können, wozu Zellen komplexe Signaltransduktionswege entwickelt haben. In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf Signalprozesse in S.cerevisiae die von osmotischem Stress (High Osmolarity Glycerol (HOG) Signalweg) und der Stimulation mit α-Faktor (Pheromon Signalweg) angesprochen werden. Wir wenden stochastische Modelle an, die das intrinsische Rauschen biologischer Prozesse darstellen können, um verstehen zu können wie Signalwege die ihnen zur Verfügung stehende Information umsetzen. Informationsübertragung wird dabei mit einem Ansatz aus Shannons Informationstheorie gemessen, indem wir sie als einen Kanal in diesem Sinne auffassen. Wir verwenden das Maß der Kanalkapazität, um die Genauigkeit des Phosphorelays einschränken zu können. In diesem Modell, simuliert mit dem Gillespie Algorithmus, können wir durch die Analyse des Signalverhaltens den Parameterraum zusätzlich stark einschränken. Eine weitere Herangehensweise der Signalverarbeitung beschäftigt sich mit dem “Crosstalk” zwischen HOG und Pheromon Signalweg. Wir zeigen, dass die Kontrolle der Signalspezifizität vor allem bei Scaffold-Proteinen liegt, die Komponenten der Signalkaskade binden. Diese konservierten Motive zellulärer Signaltransduktion besitzen eine geeignete Struktur, um Information getreu übertragen zu können. Im letzten Teil der Arbeit untersuchen wir potentielle Gründe für die evolutionäre Selektion von Scaffolds. Wir zeigen, dass ihnen bereits durch die Struktur des Mechanismus möglich ist, Informationsgenauigkeit zu verbessern und einer verteilten Informationsweiterleitung sowohl dadurch als auch durch ihre Robustheit überlegen sind. / Information plays a ubiquitous role in nature. It provides the basis for structure and development, as it is inherent part of the genetic code. It also enables organisms to make sense of their environments and react accordingly. For this, a cellular interpretation of information is needed. Cells have developed sophisticated signaling mechanisms to fulfill this task and integrate many different external cues with their help. Here we focus on signaling that senses osmotic stress (High Osmolarity Glycerol (HOG) pathway) as well as α-factor stimulation (pheromone pathway) in S.cerevisiae. We employ stochastic modeling to simulates the inherent noisy nature of biological processes to assess how systems process the information they receive. This information transmission is evaluated with an information theoretic approach by interpreting signal transduction as a transmission channel in the sense of Shannon. We use channel capacity to both constrain as well as quantify the fidelity in the phosphorelay system of the HOG pathway. In this model, simulated with the Gillespie Algorithm, the analysis of signaling behavior allows us to constrain the possible parameter sets for the system severely. A further approach to signal processing is concerned with the mechanisms that conduct crosstalk between the HOG and the pheromone pathway. We find that the control for signal specificity lies especially with the scaffold proteins that tether signaling components and facilitate signaling by trans-location to the membrane and shielding against miss-activation. As conserved motifs of cellular signal transmission, these scaffold proteins show a particularly well suited structure for accurate information transmission. In the last part of this thesis, we examine the potential reasons for an evolutionary selection of the scaffolding structure. We show that due to its structure, scaffolds are increasing information transmission fidelity and outperform a distributed signal in this regard.

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Einleitung: Das Darmmikrobiom, ein hochkomplexes Ökosystem an Mikroorganismen, geht eine lebenslange wechselseitige Beziehung mit seinem Wirt ein und beeinflusst wesentlich dessen Darmreifung post partum. Dazu interagieren Darmbakterien direkt und indirekt mit den intestinalen Stammzellen in den Krypten und regulieren Zellteilung und -differenzierung, wobei die Mechanismen nicht abschließend geklärt sind. Das Darmmikrobiom stellt eine wichtige Quelle für Mikroben-assoziierte molekulare Muster (MAMPs) dar, die von Mustererkennungsrezeptoren wie den Toll-like-Rezeptoren (TLR) auf den intestinalen Epithelzellen erkannt werden können. Somit können TLR auf den intestinalen Epithelzellen eine mögliche Verbindung zwischen Darmmikrobiom und Anpassungsreaktionen der Dünndarmmorphologie darstellen. Ziele der Untersuchung: Folgende Hypothesen sollten untersucht werden: 1. Die Anwesenheit von Darmbakterien beeinflusst die Morphologie der Dünndarmschleimhaut. 2. Diese Wirkung wird über Toll-like-Rezeptoren und den Hedgehog-Signalweg in Epithelzellen vermittelt. 3. Über diese Signalwege werden auch funktionelle Eigenschaften wie die Durchlässigkeit der Darmbarriere verändert. Tiere, Material und Methoden: Zur Untersuchung des Einflusses des Mikrobioms wurden in einem gnotobiotischen Mausmodell keimfreie Tiere mit dem minimalen mikrobiellen Konsortium Altered Schaedler Flora (ASF) besiedelt. Die ASF, welche sich aus acht definierten Bakterienarten zusammensetzt, wurde aus dem Caecum ASF-besiedelter C3H/HeNTac-Mäuse entnommen und männlichen und weiblichen keimfreien C57BL/6J-Mäusen appliziert. Der Nachweis der Bakterienspezies erfolgte aus bakterieller DNA, die aus frischen Kotpellets isoliert wurde. Der Vergleich wurde zwischen Dünndärmen ASF-kolonisierter Mäuse (n = 13), keimfreien Tieren (n = 8), konventionell gehaltenen (n = 7) und einer Gruppe Antibiotika-behandelter Mäuse (n = 8) durchgeführt. Zur Untersuchung des Einflusses der Toll-like-Rezeptoren TLR2 und TLR4 wurden epithelspezifische TLR2-defiziente (TLR2ΔIEC) bzw. TLR4-defiziente Mäuse (TLR4ΔIEC) verwendet und mit ihren jeweiligen Wildtyp-Geschwistertieren (WT) verglichen. Die morphometrische Eigenschaften des Dünndarms wurden anhand von histologischen Schnitten untersucht, die mit Hämatoxylin-Eosin oder Periodic-Acid-Schiff gefärbt waren. Hierbei wurden u.a. Mukosahöhe und Villuslänge gemessen sowie die Anzahl der Epithelzellen und Anzahl der Becherzellen pro Villus gezählt. Weiterhin wurden sowohl in Dünndarmgewebe als auch in isolierten intestinalen Epithelzellen mittels qPCR die mRNAExpression der Liganden des Hedgehog (Hh)-Signalwegs Sonic Hedgehog (Shh) und Indian Hedgehog (Ihh) sowie Hedgehog-Zielgene wie Glioma-associated oncogene transcription factor 1 (Gli-1), Patched-1 (Ptch-1) und Hedgehog Interacting Protein (Hhip) untersucht. In einem Teil der Tiere wurde der Hedgehog-Signalweg durch Applikation des Inhibitors Vismodegib gehemmt. Ein möglicher Einfluss auf die Permeabilität des Dünndarms wurde über die mRNA-Expression diverser Tight Junction-Proteine wie Occludin oder Claudin-4 sowie durch einen Permeabilitätsassay mit FITC-Dextran untersucht. Gruppenvergleiche wurden mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) und Holm-Šídák post-hoc Test bzw. zwischen den TLR2ΔIEC oder TLR4ΔIEC und WT-Mäusen mittels zweiseitigem ungepaarten t-Test durchgeführt. Unterschiede wurden bei P < 0,05 als statistisch signifikant betrachtet. Ergebnisse: Durch den Nachweis aller acht Bakterienarten in den Kotproben der behandelten Mäuse konnte die erfolgreiche Übertragung der ASF auf die Empfängertiere nachgewiesen werden. Hinsichtlich Mukosahöhe, Villuslänge, Anzahl der Epithelzellen und der Becherzellen wiesen keimfreie gegenüber konventionell gehaltenen Mäusen signifikant höhere Werte auf. Die Kolonisierung mit ASF führte zu einer signifikanten Verringerung dieser Merkmale, so dass sie sich denen der konventionell gehaltenen Tiere annäherten. Die mRNA-Expression der Hh-Liganden Shh und Ihh war sowohl im Dünndarm als auch in isolierten intestinalen Epithelzellen ASF-besiedelter Mäuse signifikant erhöht. Die Hh-Zielgene Gli-1, Ptch-1 und Hhip waren auf mRNA-Ebene im Dünndarm ASF-besiedelter Mäuse ebenfalls signifikant höher exprimiert. Mukosahöhe, Epithelzellzahl und Villuslänge waren im Jejunum von TLR2ΔIEC- und TLR4ΔIEC-Mäusen gegenüber ihren WT-Geschwistern signifikant höher. Während bei TLR2ΔIEC-Mäusen außer Shh alle untersuchten Hh-Zielgene vermehrt exprimiert waren, waren bei TLR4ΔIEC-Mäusen die gleichen Gene signifikant weniger exprimiert. Wurde hingegen der Hh-Signalweg in konventionell gehaltenen C57BL/6-Mäusen mit Vismodegib inhibiert, waren der Expression der Hh-Zielgene, des TLR2 und des TLR4 signifikant vermindert. Sowohl die Hemmung des Hh-Signalwegs mit Vismodegib als auch das Fehlen der epithelialen TLR2 oder TLR4 bedingte eine verminderte Expression von Tight Junction-Proteinen, die mit einer erhöhten Darmpermeabilität einherging. Konventionell gehaltene Mäuse hatten sowohl gegenüber keimfreien als auch gegenüber mit ASF besiedelten Tieren eine signifikant niedrigere Expression von Tight Junction-Proteinen, was mit einer signifikant höheren Darmpermeabilität verbunden war. Schlussfolgerungen: Zusammenfassend lassen die Ergebnisse dieser Studie darauf schließen, dass Darmbakterien über intestinale TLR2 und TLR4 den Hh-Signalweg regulieren und darüber die Morphologie der Dünndarmmukosa als auch deren funktionelle Eigenschaften wie die Durchlässigkeit der Darmbarriere beeinflussen. / Introduction: The intestinal microbiome, a highly complex ecosystem of microorganisms, enters into a lifelong reciprocal relationship with its host and significantly influences its intestinal maturation postpartum. To this end, intestinal bacteria interact directly and indirectly with intestinal stem cells in the crypts and regulate cell division and differentiation, although the mechanisms are not conclusively understood. The intestinal microbiome represents an important source of microbeassociated molecular patterns (MAMPs) that can be recognized by pattern recognition receptors such as Toll-like-Receptors (TLRs) on intestinal epithelial cells. Thus, TLRs on intestinal epithelial cells may represent a potential link between gut microbiome and adaptation responses of small intestinal morphology. Aims: The following hypotheses should be investigated: 1. The presence of intestinal bacteria affects the morphology of the small intestinal mucosa. 2. This effect is mediated via Toll-like-Receptors and the Hedgehog signaling pathway in epithelial cells. 3. Functional properties such as the permeability of the intestinal barrier are also altered via these signaling pathways. Animals, materials and methods: To investigate the influence of the microbiome, germ-free animals were colonized with the minimal microbial consortium Altered Schaedler Flora (ASF) in a gnotobiotic mouse model. The ASF, which is composed of eight defined bacterial species, was harvested from the caecum of ASF-colonized C3H/HeNTac mice and applied to male and female germ-free C57BL/6J mice. Bacterial species were detected from bacterial DNA isolated from fresh fecal pellets. Comparison was made between small intestines of ASF-colonized mice (n = 13), germ-free animals (n = 8), conventionally housed (n = 7), and a group of antibiotic-treated mice (n = 8). To investigate the influence of Toll-like-Receptors TLR2 and TLR4, epithelial-specific TLR2-deficient (TLR2ΔIEC) or TLR4-deficient mice (TLR4ΔIEC) were used and compared with their respective wild-type (WT) littermates. Morphometric characteristics of the small intestine were examined using histological sections stained with hematoxylin-eosin or periodic-acid-Schiff. Here, mucosa height and villus length were measured, and the number of epithelial cells and number of goblet cells per villus were counted, among other measurements. Furthermore, mRNA expression of the ligands of the Hedgehog (Hh) signaling pathway Sonic Hedgehog (Shh) and Indian Hedgehog (Ihh) as well as Hedgehog target genes such as Gliomaassociated oncogene transcription factor 1 (Gli-1), Patched-1 (Ptch-1) and Hedgehog Interacting Protein (Hhip) were examined in small intestinal tissue as well as in isolated intestinal epithelial cells by qPCR. In a subset of animals, Hedgehog signaling was inhibited by application of the inhibitor Vismodegib. A possible influence on small intestinal permeability was investigated by mRNA expression of various tight junction proteins such as Occludin or Claudin-4 and by permeability assay with FITC-dextran. Group comparisons were performed with a one-way analysis of variance (ANOVA) and Holm-Šídák post-hoc test or between the TLR2ΔIEC or TLR4ΔIEC and WT mice by two-tailed unpaired t test. Differences were considered statistically significant at P < 0.05. Results: Detection of all eight bacterial species in the fecal samples of treated mice demonstrated successful transfer of ASF to recipient animals. In terms of mucosa height, villus length, number of epithelial cells and goblet cells, germ-free mice had significantly higher values compared to conventionally housed mice. Colonization with ASF significantly decreased these characteristics to approach those of conventionally housed animals. The mRNA expression of the Hh ligands Shh and Ihh was significantly increased in the small intestine as well as in isolated intestinal epithelial cells of ASF colonized mice. The Hh target genes Gli-1, Ptch-1, and Hhip were also significantly higher expressed at the mRNA level in the small intestine of ASF-colonized mice. Mucosa height, epithelial cell number, and villus length were significantly higher in the jejunum of TLR2ΔIEC and TLR4ΔIEC mice compared with their WT littermates. Whereas in TLR2ΔIEC mice, except for Shh, all Hh target genes examined were increased in expression, the same genes were significantly less expressed in TLR4ΔIEC mice. In contrast, when the Hh pathway was inhibited with Vismodegib in conventionally maintained C57BL/6J mice, the expression of Hh target genes, TLR2, and TLR4 were significantly decreased. Both inhibition of the Hh pathway with Vismodegib and absence of epithelial TLR2 or TLR4 caused decreased expression of tight junction proteins, which was associated with increased intestinal permeability. Conventionally housed mice had significantly lower expression of tight junction proteins compared with both germ-free and ASF-populated animals, which was associated with significantly higher intestinal permeability. Conclusions: In summary, the results of this study suggest that intestinal bacteria regulate the Hh signaling pathway via intestinal TLR2 and TLR4 and thereby influence the morphology of the small intestinal mucosa as well as its functional properties such as intestinal barrier permeability.

Als Reaktion auf DNA-Schäden aktivieren Zellen den NF-κB-Signalweg, der die apoptotischen Reaktionen reguliert. Die Signalwege, die die zytoplasmatischen NF-κB-Dimere als Reaktion auf eine breite Palette von Immun- und Entzündungssignalen aktivieren, sind umfassend untersucht worden; die molekularen Mechanismen, die die Kern-DNA mit der zytoplasmatischen Aktivierung von NF-κB verbinden, sind jedoch relativ wenig bekannt. Hier haben wir mithilfe genomweiter siRNA-Screens systematisch Regulatoren und wesentliche Komponenten identifiziert, die für die durch DNA-Schäden ausgelöste Aktivierung des NF-κB-Signalwegs erforderlich sind. Von den identifizierten Komponenten konnten wir nachweisen, dass TSG101 die NF-κB-Aktivierung durch DNA-Schäden reguliert. Wir konnten zeigen, dass TSG101 mit PARP1 interagiert und dessen katalytische Aktivität kontrolliert. Die Ausrichtung auf TSG101 führt dazu, dass PARP1 in DNA-Läsionen gefangen wird und die durch DNA-Schäden ausgelöste NF-κB-Aktivierung vermindert wird. In Abwesenheit von TSG101 fehlen den Zellen PAR-abhängige zelluläre Reaktionen und sie sind für die durch DNA-Schäden ausgelöste Apoptose sensibilisiert. Die signalinduzierte Verarbeitung von p100 ist ein wesentlicher Schritt für die Aktivierung des nicht-kanonischen NF-κB-Wegs. Trotz seiner Bedeutung für die Immunantwort, die Entwicklung und verschiedene bösartige Erkrankungen wurden die Komponenten des Ubiquitin-Proteasom-Systems, die die Verarbeitung von p100 regulieren, nie mit endogenen Systemen analysiert. In dieser Studie haben wir mit Hilfe eines CRISPR-Cas9-basierten Knock-out-Screening-Systems nicht-redundante E3-Ligasen identifiziert, die für die signalinduzierte p100-Verarbeitung erforderlich sind. Außerdem haben wir das TWEAK-induzierte Ubiquitinom mittels Massenspektrometrie charakterisiert. / In response to DNA damage, cells activate the NF-κB pathway that regulates the apoptotic responses. The signaling pathways that activate the cytoplasmic NF-κB dimers in response to a wide range of immune and inflammatory signals have been investigated extensively; however, the molecular mechanisms that link the nuclear DNA with cytoplasmic activation of NF-κB is relatively less known. Here we systematically identified regulators and essential components required for the DNA damage-induced activation of the NF-κB pathway using genome-wide siRNA screens. Amongst the identified components, we validated that TSG101 regulates the NF-κB activation by DNA damage. We showed that TSG101 interacts with PARP1 and controls its catalytic activity. Targeting TSG101 consequently achieves trapping of PARP1 in DNA lesions and diminishes the DNA damage-induced NF-κB activation. In the absence of TSG101, cells lack PAR-dependent cellular responses and are sensitized to DNA damage-induced apoptosis. The signal-induced processing of p100 is an essential step for the activation of the non-canonical NF-κB pathway. Despite of its importance in immune responses, development, and several malignancies, the ubiquitin-proteasome system components regulating p100 processing were never analyzed using endogenous systems. In this study, utilizing a CRISPR Cas9 based knock out screening system we identified non-redundant E3 ligases required for the signal-induced p100 processing. We also characterized the TWEAK-induced ubiquitinome via mass spectrometry.

Der Überträger von Malaria, Anopheles gambiae, fordert jedes Jahr das Leben von etwa einer halben Million Menschen. Dennoch haben Mücken Mechanismen entwickelt, die die Ausbreitung von Krankheitserregern einschränken können. Der NF-κB-ähnliche Signalweg REL2 wurde als Schlüsselmechanismus für die Abtötung von Plasmodium falciparum in Mücken beschrieben, der sie bei experimenteller Aktivierung resistent gegen Plasmodium-Parasiten macht. Der Weg blieb jedoch schlecht charakterisiert. Zur Charakterisierung des REL2-Signalwegs wurden Loss-of-Function-Mutanten des Gens das Transkriptionsfaktor REL2 kodiert verwendet. Hier wurde die Fitness der Mücken mit REL2-Mangel, ihre Anfälligkeit für eine Infektion mit P. falciparum und Veränderungen in ihren mikrobiellen Gemeinschaften untersucht. Es wurde eine entscheidende Rolle des REL2-Signalwegs bei der Kontrolle der Proliferation des Mitteldarmmikrobioms und folglich des Überlebens der Mücken identifiziert. Es konnte kein konsistenter Phänotyp in der Anfälligkeit von REL2-Mutanten gegenüber Plasmodium beobachtet werden. Die Interaktion des Signalwegs und des Parasiten war indirekt, als Folge der REL2- und Mikrobiom-Interaktion. Gewebespezifische Transkriptomsequenzierung wurde verwendet um REL2-Genziele zu identifizieren. Die Ergebnisse zeigten die gewebespezifische Funktion des REL2-Signalwegs, wobei der Mitteldarm der Hauptort seiner Aktivität ist. Die identifizierten REL2-Genziele gehörten zu verschiedenen Domänen der Mückenphysiologie, einschließlich des Stoffwechsels. Mit weiteren Experimenten wurde die Rolle des REL2-Signalwegs bei der Blutmahlzeitverdauung und dem Management von Zucker- und Lipidressourcen beobachtet. Diese Studie ist die erste, die die Hauptgewebe der REL2-Aktivität und die Genziele des Signalwegs in Mücken identifiziert. Seine Hauptfunktion ist die Regulierung der mikrobiellen Gemeinschaften der Mücken im Mitteldarm, aber der Signalweg ist auch an der Feinabstimmung von Stoffwechselprozessen beteiligt. / Malaria vector, Anopheles gambiae, claims lives of around half a million people each year. But mosquitoes have developed an array of mechanisms that can limit pathogen proliferation. NF-κB-like signaling pathway REL2 has been described as a key mechanism for Plasmodium falciparum killing in mosquitoes, rendering them resistant to Plasmodium parasites when experimentally activated. However, the pathway remained poorly characterized. With an aim to characterize the REL2-dependent Plasmodium killing, loss-of-function mutants of the gene encoding the NF-κB-like transcription factor REL2 were used. The fitness of the REL2 deficient mosquitoes, their susceptibility to P. falciparum infection, and changes in their microbial communities were investigated. A critical role of REL2 pathway in controlling the midgut microbiome proliferation, and consequently the mosquito survival, has been identified. Interestingly, no consistent phenotype could be observed in the susceptibility of REL2 mutants to Plasmodium. Rather, the interaction of the pathway and parasite seems to be indirect, as a consequence of the REL2 and microbiome interaction. Furthermore, tissue-specific transcriptome sequencing was used to identify REL2 gene targets. The sequencing results revealed the tissue-specific function of the REL2-pathway, with the midgut being the main site of its activity. Identified REL2 gene targets belonged to various domains of mosquito physiology, including metabolism. With further experiments, the role of the REL2 pathway in blood meal digestion and management of sugar and lipid resources has been observed. Taken together, this study is the first to identify the main tissues of the REL2 activity and also gene targets of the pathway in mosquitoes. Its main function was found to be the regulation of mosquito microbial communities in the midgut, but the pathway also seems involved in fine-tuning of metabolic processes.