Our previous study identified both high p27kip1 and low CKS1B protein levels were independent prognosis markers in hepatocelular carcinomas (HCC), however, CKS1B overexpression implicated clinical aggressiveness of HCC but not p27Kip1 protein turnover. In this study, we demonstrated a cytotoxic compound, goniothalamin (GTN), that stabilized p27kip1 protein and downregulated CKS1B mRNA as well as protein levels in HCC-derived cell lines. The IC50 of TP53-negative Hep-3B and TP53-positive SK-Hep1 after treatment with GTN for 48 h were detected as 25 and 10 £gM, respectively. The GTN induced DNA damages, formation of £^H2AFX foci, and upregulation of £^H2AFX protein levels in dose-dependent manners in both cell lines. In addition, GTN arrested Hep-3B and SK-Hep1 cells in G2/M and G1 phases, respectively. Protein levels of several cell cycle regulators, including p27Kip1 in Hep-3B and, p21Cip1 and CKS1B in SK-Hep1 cells have been noticeable upregulated after treatment with GTN. In Hep-3B cells, GTN induced the configuration of p27Kip1/CCND1, p27Kip1/CDK2; p27Kip1/CCNB1 and p27Kip1/CDK1, however, repressed the p27Kip1/STMN1 complexes. On the other hand, GTN evidently induced the configuration of p21Cip1/CDK2 and p21Cip1/CCNE1, but repressed the p21Cip1/SKP2 and p21Cip1/CKS1B complexes, in SK-Hep1 cells. The CKS1B protein abundance that was induced by GTN was stemmed from the CKS1B transactivity. However, GTN-induced p27Kip protein profusion in Hep-3B cell line was, instead, due to the stabilization of p27Kip1 protein, mainly in the cytosol. Both GTN and the proteasome inhibitor, MG132, induced p27Kip1 ubiquitination and p27Kip1 protein profusion with an additive effect, regardless of CKS1B protein level, suggesting that the p27Kip1 protein might be regulated by GTN through an alternative ubiquitin-complex in Hep-3B cells. In addition to the quantitative reverse transcription -polymerase chain reaction, GTN-induced p21Cip1 protein level in SK-Hep1 cells could be traced back to mRNA level, by evidence of quantitative immunoprecipitation/chromatin immunoprecipitation assay with primer sets specific to two regions of the p21Cip1 proximal promoter. Taken together, GTN is able to induce the cell cycle arrest via stabilization of p27Kip1 protein and downregulation of CSK1B mRNA and subsequent protein levels in TP53-negative Hep-3B and TP53-positive SK-Hep1 cells, respectively. The GTN-repressed CKS1B transcription and thereafter, cell cycle arrest, was irrelevant to the p27Kip1 protein stability in Hep-3B cells.

Hepatocellular carcinoma (HCC) or hepatoma is the fifth most common cancer and the third most common cause of cancer-related deaths worldwide. Early detection of HCC still remains challenge. Patients with late-stage HCCs have very limited therapeutic options and relatively poor prognosis. Therefore, recognition of useful tumor marker for the diagnosis of HCC may aid in the management with this lethal malignancy, and designing effective therapies. In our previous study, through in silico data mining of numerous available cDNA microarray databases, the CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B (CKS1B) transcript was found to be frequently upregulated in HCCs and the gene is strongly associated in clinical aggressiveness. Moreover, gain of chromosome 1q copy is one of the most frequently detected alterations in HCC and 1q21 is the most frequent minimal amplifying region. Mammalian CKS1B gene, a member of the highly conserved cyclin kinase subunit 1 protein family, mapped to 1q21.2-q22, which interacts with cyclin-dependent kinases and frequently up-regulated in human HCC specimens, and this gene also has been reported to play oncogenic roles in other human cancers. Furthermore, this gene was identified as an essential cofactor of S-phase kinase-associated protein 2 (SKP2) in the SKP2-containing SKP1-Cullin1-F-box ubiquitin ligase complex¡Vmediated ubiquitination of the cell cycle inhibitor protein cyclin-dependent kinases 1A (p27kip1) that leads to the proteasomal degradation of p27kip1. In the present study, our results indicate that CKS1B overexpression may contribute to hepatocarcinogenesis by enhancing the cellular tumorigenic potential. In addition, CKS1B was correlated with the HCC-derived cells proliferation, and CKS1B knockdown significantly inhibited the tumorigenic potential of HCC-derived cells. In this study, we examined that CKS1B knockdown and overexpressed in HCC cells significantly changed the expression of genes known to participate in various cellular processes, including, apoptosis, cell cycle, proliferation, viability, invasion, and migration, implying that CKS1B may play considerable and diverse roles in hepatocarcinogenesis.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common malignant tumor in Taiwan with more than one million new cases annually in the world. Growth factors play important roles in liver carcinogenesis. Hepatoma-derived growth factor (HDGF), originally isolated from the cultured media of human hepatoma HuH-7 cells, stimulate the growth of fibroblast cells, endothelial cells, and hepatoma cells. Overexpression of HDGF is related to the transformation of human hepatoma, lung cancer and melanoma. Besides, HDGF also exerts strong influence on the prognosis of patients with hepatoma. In this study, recombinant HDGF was expressed and purified with higher purity than 90%. The recombinant protein was used to raise polyclonal HDGF antibodies in rabbits and to generate three lines of HDGF monoclonal antibodies in mice. After antibodies characterization, an in-house, sandwich HDGF ELISA system was established using the purified polyclonal anti-HDGF IgG as the capture antibodies and the monoclonal anti-HDGF IgG as the detection antibodies. By using recombinant HDGF as standard, this ELISA system accurately evaluate the changes of HDGF release in SK-Hep-1 cells after gene delivery. In addition, we also evaluated the effect of anti-HDGF on the growth of hepatoma cells. Application of either polyclonal or monoclonal HDGF antibodies, but not preimmune antibodies, inhibited the proliferation of SK-Hep-1 hepatoma cells in a dose-dependent manner. In summary, the present study generated HDGF monoclonal antibodies for development of HDGF ELISA and application on suppressing HCC progression. Future studies should be carried out to enhance the sensitivity of HDGF ELISA and to evaluate the therapeutic potential of HDGF antibodies for treatment of HCC.

Für Lebertransplantationen bei Patienten mit hepatozellulärem Karzinom stellt sich angesichts der defizitären Organspendesituation die berechtigte Frage, unter welchen Bedingungen diese Form der Therapie ein gutes Outcome für die Patienten verspricht und somit keine Verschwendung der ohnehin knappen Ressourcen darstellt. Ziel dieser Arbeit war es, ein Kollektiv aus 98 Patienten, die an einem hepatozellulären Karzinom erkrankten und im Zeitraum von 1994 bis einschließlich 2010 am Universitätsklinikum Leipzig eine Lebertransplantation erhielten, retrospektiv zu charakterisieren und den Einfluss mehrerer Faktoren auf das Outcome der Patienten zu untersuchen. Bei den Faktoren handelte es sich um die Wartezeit, den präoperativen Einsatz der TACE, den präoperativen AFP-Serumspiegel, sowie die Tumorzahl und -größe. Der Nachbeobachtungszeitraum lag bei 3 Jahren. Die Charakterisierung des Kollektivs erbrachte folgende Ergebnisse: Das Kollektiv bestand zu rund 80% aus Männern. Das mediane Alter zum Zeitpunkt der Transplantation lag bei 59 Jahren. Die Transplantationszahlen bei HCC-Patienten sind am UKL seit Einführung des MELD-Scores 2006 deutlich angestiegen. Die mediane Wartezeit hat sich seit Einführung des MELD-Scores nicht wesentlich verändert. Sie betrug 7,3 Monate in der Prä-MELD-Ära und 6,9 Monate in der MELD-Ära. Mit über 60% war der Alkoholabusus die häufigste Ursache für die Entstehung des hepatozellulären Karzinoms. An zweiter Stelle stand die Hepatitis-C-Infektion. In der Diagnostik des HCC spielte die Computertomographie die größte Rolle. Die Sensitivität des AFP zur Erfassung des HCC (>400 ng/ml) war mit Werten unter 30% sehr niedrig. Die TACE war die mit Abstand am häufigsten durchgeführte, neoadjuvante Maßnahme. Zum Zeitpunkt der Transplantation befanden sich rund 75% der Patienten in einem Stadium bis maximal T2. Das Auftreten von solitären und multifokalen HCCs war in etwa gleich häufig (46,9% vs. 53,1%). Die Milan-Kriterien waren bei knapp 39% der Patienten im postoperativen Explantat-Befund überschritten. Nach Transplantation traten bei 26 Patienten Abstoßungsreaktionen auf. 8 Patienten mussten aufgrund eines Transplantatversagens retransplantiert werden. Das postoperative Überleben (intention-to-treat) betrug 75,5% (6 Monate), 71,4% (1 Jahr) und 63,3% (3 Jahre). Die entsprechenden Rezidivraten lagen bei 11,2%, 14,3% und 22,4%. Rezidiven traten am häufigsten in der Spenderleber auf, gefolgt von einem Befall der Lymphknoten und Knochen. Ein signifikanter Einfluss auf das Outcome der Patienten konnte für das AFP, die Tumorzahl und die Milan-Kriterien nachgewiesen werden: Präoperative AFP-Spiegel unter 100 ng/ml zeigten eine signifikant niedrigere Rezidivrate. Multifokale Tumoren waren mit einem signifikant schlechteren 3-Jahres-Überleben verknüpft. Bei Erfüllung der Milan-Kriterien (im postoperativen Explantat-Befund) war die Rezidivrate signifikant und die Überlebensrate deutlich besser. Für die Wartezeit konnte seit Einführung des MELD-Scores eine positive Entwicklung festgestellt werden. Das 3-Jahresüberleben hat sich bei Wartezeiten unter 12 Monaten um 22,5% verbessert. Die Rezidivrate ist bei Wartezeiten über 12 Monate um 15,3% gesunken. Für den Einfluss der TACE auf das Outcome der Patienten konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Auch andere Studien belegten bisher lediglich einen Vorteil für das erfolgreiche Downstaging gegenüber Patienten, bei denen die TACE erfolglos blieb. Für die Untersuchung des tatsächlichen Nutzens einer TACE vor Transplantation werden daher Studien mit höherem Evidenzgrad benötigt.

Das triple-negative Mammakarzinom exprimiert weder Östrogen- noch Progesteronrezeptoren und es kommt zu keiner Überexprimierung des HER2-neu Gens. Daher haben bei diesem Subtyp des Mammakarzinoms spezifische Therapien, welche gezielt an diesen Rezeptoren wirken, keinerlei Nutzen. Etwa 60% aller Mammakarzinome exprimieren GnRH-Rezeptoren, welche als Ziel genutzt werden könnten. Der GnRH-Rezeptor kann für eine gezielte Chemotherapie mit zytotoxischen GnRH-Agonisten wie AN-152, bei welchem Doxorubicin an [D-Lys6]GnRH gebunden ist, genutzt werden. In der vorliegenden Arbeit habe ich in vitro als auch in vivo analysiert ob der zytotoxische GnRH-Agonist AN-152 Apoptose in triple-negativen Mammakarzinomzellen, welche GnRH-Rezeptoren exprimieren, induziert. Die GnRH-Rezeptorexpression in Tumorbiopsien triple-negativer Mammakarzinome wurde immunhistochemisch getestet. Die Zellproliferation wurde unter Verwendung des AlamarBlue®-Proliferationsassays analysiert. Die Apoptoseinduktion wurde durch die Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentialverlustes quantifiziert. Die in vivo Experimente wurden mit Nackmäusen nach Xenotransplantation von humanen Brustkrebszellen durchgeführt. Wir konnten zeigen das die Behandlung triple-negativer aber GnRH-positiver MDA¬ MB 231, HCC 1806 und HCC 1937 Mammakarzinomzellen mit AN-152 in vitro zum apoptotischen Zelltod durch Aktivierung der Caspase-3 führt. Diese Antitumoreffekte konnten im Nacktmausmodell bestätigt werden. AN-152 inhibierte das Wachstum triple-negativer Mammakarzinomxenotransplantate in den Nacktmäusen komplett, ohne offensichtliche Nebenwirkungen. Der zytotoxische GnRH-Agonist AN-152 scheint ein passendes Medikament mit niedriger Toxizität für eine effiziente Therapie des triple-negativen Mammakarzinoms zu sein. (Föst C, Duwe F, Hellriegel M, Schweyer S, Emons G, Gründker C (2011). Targeted chemotherapy for triple-negative breast cancers via LHRH receptor. Oncol Rep, 25, 1481-7.)

PURPOSE: HCC is a complicated disease with high mortality rates and limited treatment options. No universal clinical or molecular classification established to inform better treatment options. There has been very limited success in determining a molecular profile that represent valid drivers in HCC patients and thus no targeted agents have obtained marketing approval. However, emerging data suggest the FGF19-pathway as a HCC driver and a potential therapeutic target. This research study aims to investigate whether the HCC prognostic risk factor, serum AFP, is predictive of FGF19 protein expression as assessed by immunohistochemistry in advanced HCC patients. METHODS: A cross-sectional analysis was performed from baseline data collected in a Phase 1 study conducted at various centers across the US, EU, and Asia. Only advanced HCC patients with adequate liver function were eligible for enrollment. Demographic data, detailed history of HCC, and any prior treatments or surgeries were recorded. Baseline laboratory values and prognostic factors including performance status (ECOG), lab values (i.e. bilirubin, albumin), and the number, size and biomarker status of the tumor(s) were collected. Differences between groups were assessed by t test, or Chi-square test, as appropriate. Multivariate logistic stepwise regression analyses were performed including all parameters with highly significant correlations in the multivariate analysis. RESULTS: Only AFP, metastatic disease, and prior surgery met the criteria to be incorporated into the final model. Results indicated that high AFP had a statistically significant (p-value = .01) positive association (Wald chi-square statistic = 6.601) with positive FGF19 IHC status. The odds ratio for being FGF19 IHC+ was 12.216 among the high AFP subjects as compared to low AFP subjects, and also statistically significant but had a very wide 95% confidence interval (1.811, 82.79). CONCLUSIONS: The results indicated that HCC patients with high serum AFP levels have a twelve fold higher chance of having a positive FGF19 IHC status than those with low AFP levels. Further studies are warranted in order to replicate the data in a larger sample size to understand future clinical implications once treatment options become available for FGF19 IHC positive patients.

abstract: Hepatocellular carcinoma (HCC) is a malignant tumor and seventh most common cancer in human. Every year there is a significant rise in the number of patients suffering from HCC. Most clinical research has focused on HCC early detection so that there are high chances of patient's survival. Emerging advancements in functional and structural imaging techniques have provided the ability to detect microscopic changes in tumor micro environment and micro structure. The prime focus of this thesis is to validate the applicability of advanced imaging modality, Magnetic Resonance Elastography (MRE), for HCC diagnosis. The research was carried out on three HCC patient's data and three sets of experiments were conducted. The main focus was on quantitative aspect of MRE in conjunction with Texture Analysis, an advanced imaging processing pipeline and multi-variate analysis machine learning method for accurate HCC diagnosis. We analyzed the techniques to handle unbalanced data and evaluate the efficacy of sampling techniques. Along with this we studied different machine learning algorithms and developed models using them. Performance metrics such as Prediction Accuracy, Sensitivity and Specificity have been used for evaluation for the final developed model. We were able to identify the significant features in the dataset and also the selected classifier was robust in predicting the response class variable with high accuracy. / Dissertation/Thesis / M.S. Industrial Engineering 2013

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a major chronic liver disease and thus a main reason for liver-related morbidities and mortality. NAFLD covers a wide range of diseases starting with steatosis and frequently progressing to non-alcoholic steatohepatitis (NASH), which is an independent predictor for the development of the hepatocellular carcinoma (HCC). Nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT), the key enzyme of the mammalian NAD salvage pathway, recycles nicotinamide to nicotinamide mononucleotide (NMN), which is further converted to nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). NAD is not only an important redox partner but also a crucial co-substrate for NAD-dependent enzymes such as sirtuin 1 (SIRT1). Thus, NAD metabolism might be involved in the progression of NAFLD by regulating many cellular processes, such as apoptosis, de novo lipogenesis, glycolysis and gluconeogenesis, in the liver. Interestingly, tumor cells have a high NAD turnover due to their rapid proliferation and high activity of NAD-dependent enzymes. For these reasons, I hypothesized that the NAD salvage pathway is dysregulated during the progression of non-alcoholic fatty liver disease. Therefore, the first study of the present work deals with the role of the NAD salvage pathway in a diet-induced mouse model of hepatic steatosis. In mice fed a high-fat diet for 11 weeks hepatic NAMPT mRNA, protein abundance and activity as well as NAD levels were increased. Additionally, SIRT1 protein abundance was upregulated indicating a higher SIRT1 activity. This could be confirmed by detecting decreased acetylation or transcription of SIRT1 targets. For example, p53 and nuclear factor κB (NF-κB) were less acetylated demonstrating lower activity of key regulators of apoptosis and inflammation, respectively. In the second study of this thesis NAMPT activity was inhibited by applying its specific inhibitor FK866 in hepatocarcinoma cells to investigate whether or not NAMPT inhibition could be a potential novel therapeutic approach in HCC treatment. Hepatocarcinoma cells were more sensitive to NAMPT inhibition by FK866 than primary human hepatocytes, presenting a high number of apoptotic cells after FK866 treatment. FK866 induced NAD and ATP depletion which was associated with activation of the key regulator of energy metabolism 5’-AMP-activated protein kinase (AMPK) and decreased activity of its downstream target mammalian target of rapamycin (mTOR). This thesis shows that the NAD salvage pathway is involved in hepatic steatosis and HCC. During hepatic steatosis NAD metabolism is upregulated to potentially protect against adverse effects of the massive hepatic lipid accumulation. To repress the progression to NASH it might be useful to maintain the hepatic NAD levels during early disease stages by administration of NAD precursors, such as NMN. However, hepatocarcinoma cells have a higher activity of NAMPT and NAD-dependent enzymes. NAMPT inhibition by FK866 could be a potential therapeutic approach in HCC, especially due to the fact that NAD depletion is selectively induced in hepatocarcinoma cells, but not in primary human hepatocytes.

Die evolutionär konservierten morphogenen Signalwege Wnt/β-Catenin und Hedgehog (Hh) spielen vor allem in der Embryogenese, Zelldifferenzierung und Kanzerogenese eine große Rolle. Es ist bekannt, dass es zwischen Komponenten der beiden Signalkaskaden zu verschiedensten Wechselwirkungen und Hintergrundreaktionen in unterschiedlichsten Organismen und Geweben kommt. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung einzelner mole- kularer, transkriptioneller Prozesse hinter diesen Kreuzreaktionen in primären Hepatozyten und dem Hepatozellulären Karzinom. Dafür sind die beiden Signalwege durch verschiedenste Einflüsse, wie dem Einsatz von siRNAs, transgenen Mausmodellen und rekombinanten Proteinen gegen einzelne Faktoren der Hedgehog, aber auch der Wnt/β-Catenin Kaskade in ihrer Genexpression verändert und die Reaktionen der Signalwegskomponenten mittels der quantitativen Real-Time-PCR untersucht worden. Neben dem Organismus Maus haben einzelne vergleichende Experimente auch auf der humanen Ebene zum Erkenntnisgewinn beigetragen. Durch die Einflussnahme auf den Hedgehog Signalweg in murinen Hepatozyten wird deutlich, dass die Antworten auf die einzelnen Veränderungen in den Signalkaskaden sehr vielschichtig und umfangreich sind. Abhängig vom induzierten bzw. reprimierten Gen, aber auch vom gelenkten Signalweg variieren die Genexpressionen auf unterschiedlichste, und zum Teil gegenläufige Weise. Ferner wird deutlich, dass es zu Unterschieden in der Genantwort bezüglich der verschiedenen Organismen Maus und Mensch, aber auch zu Variationen der Interaktionen in den diversen Gewebe bzw. Zelltypen kommt.

Die Inzidenz chronischer Lebererkrankungen und des hepatozellulären Karzinoms (HCC) mit nutritiv toxischer Genese ist in den vergangenen Jahren in den Industrienationen stetig angestiegen. Daher wird bereits seit längerem über eine Stadien-basierte Therapie bis hin zur Lebertransplantation intensiv diskutiert. In diesem Kontext zeigt die Stadien-spezifische Analyse der MikroRNA-(miRNA)-Profile ein großes Potenzial. In der vorliegenden Studie wurden erstmals die miRNA-Profile in Gewebeproben von Patienten mit einem hepatozellulärem Karzinom (HCC) und Leberzirrhose analysiert. Von 189 lebertransplantierten Patienten zeigten 93 eine nutritiv toxische Genese. Die Aufteilung der Patienten in zwei Studiengruppen erfolgte nach histopathologischer Beurteilung. So konnte bei 59 Patienten eine äthyltoxische Leberzirrhose ohne HCC (Gruppe A) und bei 34 Patienten ein HCC in äthyltoxischer Leberzirrhose (Gruppe B) nachgewiesen werden. In Gruppe B erfolgte die Probenentnahme aus dem HCC-Tumor („T“) und dem umgebenden Leberzirrhosegewebe („sT“). Zur Extraktion der Gesamt-RNA aus den Gewebeproben von 30 Patienten mit nutritiv toxischem Leberschaden, wurde Trizol® genutzt (16 Gruppe A „Ex“, 14 Gruppe B „sT“, 7 Gruppe B „T“). Die miRNA-Analyse dieser Gewebeproben wurde mittels miRCURY LNA Array (6. und 7. Generation) und Agilent G2565BA Microarray Scanner durchgeführt. Die Untersuchung der laboranalytischen Parameter und des präoperativen Lab-MELD ergab keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen beiden Untersuchungsgruppen. Die Patienten der Gruppe A war signifikant jünger als die Patienten der Gruppe B. 40 miRNA zeigten einen signifikanten Unterschied zwischen T- und sT-Gewebe, 29 miRNA zwischen T- und Ex-Gewebe und 56 miRNA zwischen Ex- und sT-Gewebe. Unter Berücksichtigung der bekannten Zielproteine der identifizierten miRNA wird das diagnostische Potenzial der miRNA-Profiländerungen bei der nutritiv toxischen Genese der Leberzirrhose mit und ohne HCC diskutiert.