Orientador: Carlos Francisco Sampaio Bonafé / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T11:09:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Norberto_DouglasRicardo_M.pdf: 4245356 bytes, checksum: 8a2d8041749dec81554527bd8729d8ea (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A hemoglobina extracelular de Glossoscolex paulistus (eritrocruorina) foi investigada com respeito ao efeito da temperatura na dissociação induzida por alta pressão hidrostática. O aumento de temperatura e pressão induziu o processo de dissociação, como observado pela significativa diminuição da intensidade de espalhamento de luz. Tais informações foram confirmadas através de HPLC em gel filtração e microscopia eletrônica. Ocorreu uma redução dos valores de energia livre de Gibbs de dissociação indicando um processo predominantemente endotérmico. A variação de entalpia (?H) observada no processo foi de 27,82 MJ/mol de hemoglobina (Hb) e a de entropia (T?S), à temperatura de 293 K, de 23,91 MJ/mol de Hb. Foi encontrada uma redução da mudança de volume de dissociação (?V) de -78,20 para -10,44 mL/mol de subunidade de Hb. Em condições atmosféricas e temperatura de 293 K, a variação da energia interna de dissociação (?U) foi de 27,82 MJ/mol de Hb e da energia livre de Helmholtz, (?A), de 3,92 MJ/mol de Hb. Os resultados da dissociação oligomérica em alta pressão no intervalo de temperatura investigado mostraram a ocorrência de etapas distintas de mudança de estabilidade conformacional. Complementarmente, foi realizado um estudo das interações intersubunidades e da área de exposiçao da proteína ao solvente no processo de dissociação, permitindo a obtenção de importantes dados quantitativos no processo / Abstract: Glossoscolex paulistus extracelluar hemoglobin (erithrocruorin) was studied with respect of thermal effect on the dissociation induced by high hydrostatic pressure. The increase of temperature and pressure led to dissociation process, as observed by the significant decrease in the intensity of light scattering values. Such information was confirmed by HPLC gel filtration and electron microscopy. A predominantly endothermic process was observed with the reduction in the Gibbs free energy of dissociation. The enthalpy change (?H) obtained was of 27,82 MJ/mol of hemoglobin (Hb) and the entropy change (T?S), at a temperature of 273 K, 23,91 MJ/mol of Hb. The estimated volume change of dissociation (?V) decreased from -78,20 to -10,44 mL/mol of subunit of Hb. The change of internal energy of dissociation (?U), at atmospheric conditions and temperature of 293K, was of 27,82 MJ/ mol of Hb and the change of free energy of Helmholtz (?A) was of 3,92 MJ/mol of Hb. The results also indicated that the dissociation of oligomeric Hb at high pressure and at investigated temperature range occurs in distinct steps of conformational stability and allowed to obtain significant quantitative data in the process. In addition, it was studied the subunity interactions and related exposed area of the protein solvent dissociation, attempting to obtain an quantitative description of the process / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

A hemoglobina extracelular de Glossoscolex paulistus tem uma massa molecular de 3,6 MDa, determinada por ultracentrifugação analítica. Esta proteína possui uma estrutura oligomérica composta por 144 cadeias globínicas e 36 cadeias sem o grupo heme, denominadas linkers. A HbGp é caracterizada por apresentar uma alta resistência a auto-oxidação e uma alta estabilidade oligomérica quando submetida a condições de estresse, tais como, variações de temperatura, pH e adição de agentes químicos (ureia, GuHCl e surfactantes). A primeira parte dos resultados desse trabalho descreve a estabilidade oligomérica da oxi-HbGp na presença de ureia, no pH 7,0 monitorada pela sonda de fluorescência fluoresceína isotiocianato (FITC). Este estudo foi desenvolvido através do uso de várias técnicas espectroscópicas tais como: absorção óptica no UV-VIS, emissão de fluorescência estática e resolvida no tempo, anisotropia estática e decaimento de anisotropia. Os tempos de vida de emissão de fluorescência dos triptofanos e da sonda FITC foram obtidos. Os decaimentos dos triptofanos são multi-exponenciais com quatro tempos de vida, onde dois estão na faixa de picosegundos e dois na faixa de nanosegundos. Os decaimentos de emissão dos triptofanos da oxi-HbGp pura e da oxi-HbGp modificada com FITC são bastante similares. Na ausência do desnaturante e na presença de até 2,5 mol/L de ureia os tempos curtos são predominantes. Em 3,5 e 6,0 mol/L de ureia as contribuições dos tempos longos aumentam significativamente. O processo de desenovelamento da oxi-HbGp induzido pela ureia é caracterizado pela dissociação oligomérica da proteína e desnaturação das subunidades dissociadas. Os decaimentos de emissão da sonda para o sistema FITC-HbGp são também multi-exponenciais com três tempos de vida, onde um dos tempos, na faixa de nanosegundos, é semelhante ao da sonda livre em tampão de 3,9 ns. Com o aumento da concentração de ureia, as contribuições dos tempos longos aumentam implicando a remoção da supressão observada para a emissão da sonda no sistema HbGp-FITC. Por outro lado, os decaimentos de anisotropia são caracterizados por dois tempos de correlação rotacional, associados, respectivamente, ao movimento residual da sonda em relação à proteína. Na segunda parte desse trabalho a forma apo-HbGp, ou seja, a oxi-HbGp sem os grupos hemes foi estudada através de um conjunto de técnicas: eletroforese, ultracentrifugação analítica (AUC), espalhamento dinâmico de luz (DLS), absorção óptica no UV-Vis, dicroísmo circular (CD), fluorescência estática e resolvida no tempo, na ausência e na presença da sonda 1-Anilino-8-naftaleno-sulfonato (1,8-ANS). Além disso, a concentração da apo-HbGp foi determinada pelo método do ácido bicinconínico (BCA). A partir dessa concentração o coeficiente de extinção molar foi calculado utilizando a lei de Beer-Lambert. Os dados de AUC mostraram duas espécies em solução, correspondendo ao monômero d e trímero abc, com coeficientes de sedimentação em torno de 2,0 e 3,5 S, respectivamente. Pelos dados de DLS percebe-se que a forma apo-HbGp monitorada por longos períodos de tempo é muito instável quando comparada à oxi-HbGp. No estudo de fluorescência resolvida no tempo da apo-HbGp foi observado à predominância de tempos longos, uma vez que os grupos hemes que promovem a supressão da emissão de fluorescência dos triptofanos foram removidos. Três tempos de vida são observados sendo dois longos na faixa de nano-segundos e um na faixa de sub-nano-segundos. / The extracellular hemogobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) has a molecular mass of 3.6 MDa, determined by analytical ultracentrifugation. This protein has an oligomeric structure composed by 144 globin chains, and 36 additional chains lacking the heme group, named linkers. This class of proteins has a high resistance to oxidation and high oligomeric stability when subjected to stressful conditions such as temperature variation, pH and addition of chemical agents (urea, GuHCl, and surfactants). The first part of the results of this work describes the oxy-HbGp oligomeric stability, in the presence of urea, at pH 7.0, monitored by fluorescein isothiocyanate (FITC) fluorescence probe. This study was developed through the use of several spectroscopic techniques, such as, UV-VIS optical absorption, static and time-resolved fluorescence (time-correlated single photon counting TCSPC), static anisotropy and time-resolved anisotropy decay. Fluorescence lifetimes were monitored for both tryptophans and FITC and the corresponding emission decays were obtained. Tryptophan decays are multi-exponential with four characteristic lifetimes: two in the picosecond and two in the nanosecond time ranges. The tryptophan emission decays for pure HbGp and HbGp-FITC systems are quite similar. In the absence of denaturant, and up to 2.5 mol/L of urea, the shorter lifetimes predominate in the decay. At 3.5 and 6.0 mol/L of urea, the longer lifetimes increase significantly their contribution. Urea-induced unfolding process is characterized by protein oligomeric dissociation and denaturation of dissociated subunits. FITC emission decays for FITC-HbGp system are also multi-exponential with three lifetimes: two in the sub-nanosecond and one in the nanosecond range with a value quite similar to the free probe in buffer of 3.9 ns. Increase of urea concentration leads to increase of the longer lifetime contribution, implying the removal of the quenching of the probe emission observed for the native HbGp-FITC system. On the other hand, anisotropy decays are characterized by two rotational correlation times associated to the bound probe, and are due to some residual motion of the probe relative to the protein. In the second part of this work the apo-HbGp (oxy-HbGp without heme groups) was studied through a set of techniques: Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), Analytical Ultracentrifugation (AUC), Dynamic Light Scattering (DLS), UV-VIS optical absorption, Circular Dichroism (CD), static and time-resolved fluorescence, in the absence and in the presence of 8-anilino-1-naphtalene-sulfonic acid (ANS) probe. Moreover, the apo-HbGp concentration was determined by Bicinchoninic Acid (BCA) method. Based on these protein concentration results, it was possible to determine spectrophotometrically the apo-HbGp molar extinction coefficient employing the Lambert-Beer law. AUC results showed two species in solution, corresponding to the monomeric and trimeric species, with sedimentation coefficients around 2.0 and 3.5 S, respectively. The DLS data showed that the apo-HbGp form is very unstable when monitored for long times as compared to the HbGp oxy-form. In the time-resolved fluorescence study of apo-HbGp the predominance of long lifetimes was observed. This occurs because the heme groups that promote the tryptophan quenching of fluorescence in the native HbGp were removed. Three lifetimes are observed, two long in the nanosecond and one in the sub-nanosecond time ranges.

A hemoglobina extracelular de Glossoscolex paulistus (HbGp) possui estrutura oligomérica composta por 144 cadeias globínicas e 36 cadeias linkers, que não possuem heme, formando uma bicamada hexagonal. Estudos mostraram que a HbGp possui uma alta estabilidade á variação de pH e presença de agentes desnaturantes, tais como, surfactantes e ureia, a 25°C. Com esses conhecimentos prévios, o presente estudo tem por objetivo avaliar a estabilidade térmica da HbGp 0,5-3,0 mg/mL, nas formas oxi-, meta- e cianometa-, em diferentes valores de pH. O efeito do SDS na estabilidade térmica da oxi-HbGp 0,5 e 3,0 mg/mL, em função do pH, será investigado também. Esses estudos foram realizados usando as técnicas de absorção óptica, dicroísmo circular (CD), espalhamento de luz dinâmico (DLS) e espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS). Os resultados de absorção óptica e CD revelam que o processo de desnaturação da oxi- e cianometa-HbGp, no pH 7,0, envolve a formação das espécies oxidadas aquo-meta-HbGp e hemicromo. O processo de desnaturação é próximo ao modelo de dois estados, com uma temperatura crítica (Tc) de 58-59 °C. No pH ácido, a proteína agrega a partir de 58 °C. A cinética de agregação da oxi-HbGp, no pH 7,0, é dependente da concentração de proteína e da temperatura. Os dados de DLS mostram que a meta- e cianometa-HbGp 0,5 mg/mL, pH 7,0, desnaturam a 48 ± 1 e 56 ± 1 °C, respectivamente. Em pH alcalino, a proteína dissocia parcialmente antes de desnaturar, e o aumento da concentração de proteína faz aumentar o valor de Tc para a cianometa-HbGp. Dados de SAXS mostram que a oxi- e meta-HbGp, pH 7,0, desnaturam a 60 °C, apresentando valores de Rg=143±1 Å e Dmax=450±1 Å, enquanto que a cianometa-HbGp se mantém estável, com valores de Rg=107±1 Å e Dmax=300±1 Å. As análises das curvas p(r) mostram uma porcentagem crescente de dodecâmero e tetrâmero em solução, em relação à fração de protreína íntegra e de subunidades maiores, com o aumento do pH e da temperatura. As análises baseadas no programa OLIGOMER são similares às baseadas na função p(r). A presença do SDS induz a dissociação da oxi-HbGp 0,5 mg/mL pH 7,0. Entretanto, com 3,0 mg/mL de proteína a dissociação é parcial, com a sobreposição dos processos de dissociação, desnaturação e agregação, com o aumento da temperatura. No pH 5,0, o SDS promove a agregação da oxi-HbGp em temperaturas menores. As constantes cinéticas de dissociação da oxi-HbGp 0,5 mg/mL, pH 7,0 aumentam de (0,53±0,07)x10-4 s-1 para (2,1±0,2)x10-4 s-1 na presença de 0,4 e 0,6 mmol/L de SDS a 40 °C, respectivamente. Na temperatura de 42 °C a constante aumenta 2,6 vezes, com 0,6 mmol/L de SDS, comparada a 40 °C. A oxi-HbGp 3,0 mg/ml na presença de 0,6 mmol/L de SDS, dissocia parcialmente em tempos menores com o aumento da temperatura antes de agregar. Portanto, esses estudos mostram que a estabilidade térmica da HbGp é sensível ao aumento de pH e presença de SDS. A ordem de estabilidade térmica em pH alcalino é dado por: cianometa->oxi->meta-HbGp. Alem disso, o processo de desnaturação é governado pelo valor do pH e dependente da concentração de proteína em solução. / The extracellular hemoglobin Glossoscolex paulistus of (HbGp) has an oligomeric structure composed by 144 globin chains and 36 non globin chains (named linkers), forming a hexagonal bilayer. HbGp presents a high stability reagarding pH variation and the presence of denaturing agents, such as, for example, urea and surfactant, at 25°C. In this way, the present studies aim to evaluate the thermal stability for oxy-, meta- and cyanomet-HbGp 0.5-3.0 mg/ml, at different pH values. The SDS effect on the thermal stability of oxy-HbGp 0.5 and 3.0 mg / mL is also investigated. Optical absorption, circular dichroism (CD), dynamic light scattering (DLS) and small angle X-ray scattering (SAXS) techniques were emplayed for these studies. The results based on the optical absorption and CD spectroscopies show that the denaturation process for oxy- and cyanomet-HbGp, at pH 7.0, involves the formation of oxidized species, such as aquo-met-HbGp and hemichrome. This denaturation process is very close to a two-state model, with a critical temperature (Tc) of 58-59 °C. However, in the acidic pH, the aggregation of protein occurs at 58 °C. The aggregation process kinetics for oxy-HbGp, pH 7.0, is dependent on the protein concentration and temperature. DLS data show that meta- and cyanomet-HbGp, 0.5 mg/mL, pH 7.0, undergo denaturation at 48 ± 1 and 56 ± 1 ° C, respectively. At alkaline pH, two HbGp forms undergo partial dissociation before denaturation, and at higher protein concentration, an increase of Tc values for cyanomet-HbGp is observed. SAXS results show that the denaturation of oxy-and met-HbGp occur at 60 °C, presenting Rg=143±1 Å and Dmax=450±15 Å, while cyanomet-HbGp remains stable with Rg =107±1 Å and Dmax= 300±10Å, at this temperature. The p(r) curves analysis show the increase of dodecamer and tetramer percentages in solution, with increase of pH and temperature. The results using the OLIGOMER program are similar to the p(r) data analysis. For oxy-HbGp 0.5 mg/mL pH 7.0, in the presence of SDS, oligomeric dissociation before denaturation is observed. However, with 3.0 mg/ml of protein the dissociation process is slower, showing an overlap of the dissociation, denaturation and aggregation processes in the system, with increase of temperature. At pH 5.0, SDS promotes the aggregation of oxy-HbGp at lower temperatures, as compared to the absence of surfactant. The kinetic dissociation constant values for oxy-HbGp 0.5 mg/mL increase from (0.53 ± 0.07) x10-4 s-1 to (2.1 ± 0.2) x10-4 s-1, in the presence of 0.4 and 0.6 mmol/L SDS at 40 ° C, respectively. At 42 °C the dissociation constant value increases 2.6-fold, with 0.6 mmol/L SDS, as compared to 40 °C. For oxy-HbGp 3.0 mg/ml, in the presence of 0.6 mmol/L SDS, the oligomeric dissociation is smallest occurring in shorter times with increasing temperature before aggregation. Therefore, these studies show that the thermal stability of HbGp is sensitive to the pH variation and the presence of SDS. At alkaline pH, the order of thermal stability is the following: cyanomet->oxy->met-HbGp. Furthermore, the denaturation process is governed by the pH value, being dependent on the protein concentration in solution.

A estabilidade térmica em função do pH para três formas da hemoglobina extracelular gigante do anelídeo Glossoscolex paulistus (HbGp), monitorada atraves de DSC, CD e absorção óptica, e estudada no presente trabalho. Estes estudos possibilitaram a determinação de parâmetros importantes do processo de desnaturação e dissociação da proteína oligomerica em pH ácido, neutro e alcalino. A HbGp se mostrou mais estável no pH ácido do que em pH neutro e alcalino. No meio alcalino a HbGp sofre dissociação oligomérica gerando subunidades tais como o dodecâmero, o trímero e o monômero. Além disso, as técnicas de DSC, dicroísmo circular (CD) e absorção óptica permitiram o monitoramento da desnaturação da estrutura protéica global, da estrutura secundária e do centro ativo da HbGp, em função da temperatura. Por DSC foi determinado que o mecanismo do processo de desnaturação térmica da HbGp é irreversível. As variações de entalpia calorimétrica, ΔHcal, e de van Hoff, ΔHvH, nas formas oxi-, meta- e cianometa-HbGp são bem distintas, em todos os pHs estudados, indicando que o processo de desnaturação é bastante complexo, sugerindo que o pico de transição deve ser composto por varias transições. A ordem de estabilidade apresentada pela HbGp em termos dos valores de temperatura de transição (Tm) foi a seguinte: cianometa- > oxi- > meta- no intervalo de pH 5,0 a 8,0. Os valores de ΔHcal no pH 7,0 para a oxi-HbGp, meta-HbGp e cianometa-HbGp foram de 25 ± 4, 20 ± 2 e 56 ± 4 MJ/mol, respectivamente. Os valores de energia de ativação (Ea) obtidos no pH 7,0 para a oxi- e cianometa-HbGp foram de 673 ± 99 e 780 ± 105 KJ/mol, e no pH 8,0 de 897 ± 106 e 850 ± 201 KJ/mol, respectivamente. Esses valores de energia de ativação são condizentes com os reportados na literatura para outras hemoglobinas. Nos estudos realizados por CD a oxi-HbGp forma hemicromo no pH 6,0 e 7,0, em temperaturas superiores a 40 °C, e se dissocia em meio alcalino. A oxi-HbGp apresenta temperatura crítica (Tc) nas regiões das hélices-α e do grupo heme praticamente idêntica nos vários pHs estudados. A cianometa-HbGp possui maior quantidade de estrutura secundária do que a oxi-HbGp, e maiores valores de temperatura crítica (Tc), sendo bem mais estável que a oxi-HbGp, assim como o observado por DSC. Por absorção óptica o comportamento térmico da HbGp é similar ao do CD, sendo observado ainda, além da formação de hemicromo, a presença de espécies pentacoordenadas no pH neutro e alcalino. / The thermal stability as a function of the pH, for three forms of the extracellular giant hemoglobin of the annelid Glossoscolex paulistus (HbGp) was monitored by DSC, CD and optical absorption in the present work. These studies allowed the determination of important parameters characterizing the denaturation and dissociation at acid, neutral and alkaline pH values. HbGp was shown to be more stable in acid pH as compared to neutral and alkaline pH values. In alkaline medium, HbGp presents oligomeric dissociation generating smaller subunits such as the dodecamer, the trimer and the monomer. Besides that, the techniques of the DSC, circular dichroism (CD) and optical absorption spectroscopy allowed to monitor, respectively, the denaturation of the global protein structure, of the secondary structure and of the active center of the hemoglobin, as a function of the temperature. By DSC it was determined that the mechanism of the thermal denaturation of the HbGp is irreversible. The variations of calorimetric and van Hoff enthalpies, in the oxy- and cyanomet-HbGp forms, are quite different, for all studied pH values, indicating that the process of denaturation is complex, characterized by a transition peak composed by several contributions. The order of stability presented by the HbGp in terms of the transition temperature values (Tm) was the following: cyanomet-> oxy- for pH from 5.0 to 8.0. The values of ΔHcal at pH 7.0 for the oxy-HbGp, met-HbGp and cianomet-HbGp were 25 ± 4, 20 ± 2 and 56 ± 4 MJ/mol, respectively. The activation energy values (Ea) obtained at pH 7.0 for the oxy- and cyanomet-HbGp were 673 ± 99 and 780 ± 105 KJ/mol, and at pH 8.0 they were 897 ± 106 and 850 ± 201 KJ/mol, respectively. Those energy values are consistent with data reported in the literature for other hemoglobins. In the studies carried out by CD for oxy-HbGp formation of hemichrome was observed at pH 6.0 and 7.0, at temperatures above 40 °C. In alkaline medium the oligomeric dissociation is observed. Oxy-HbGp presents critical temperatures (Tc), which are practically identical in the spectral regions of the polypeptide and of the heme groups for all studied pH values. The cyanomet-HbGp own larger quantity of secondary structure than oxy-HbGp, and higher values of critical temperatures (Tc), being more stable than oxy-HbGp, in agreemente with DSC data. Optical absorption spectroscopy shows thermal behavior of HbGp similar to that observed by CD. Besides the formation of the hemichrome species upon heating, the presence of penta-coordinate species at neutral and alkaline pH values was observed.

A estabilidade térmica em função do pH para três formas da hemoglobina extracelular gigante do anelídeo Glossoscolex paulistus (HbGp), monitorada atraves de DSC, CD e absorção óptica, e estudada no presente trabalho. Estes estudos possibilitaram a determinação de parâmetros importantes do processo de desnaturação e dissociação da proteína oligomerica em pH ácido, neutro e alcalino. A HbGp se mostrou mais estável no pH ácido do que em pH neutro e alcalino. No meio alcalino a HbGp sofre dissociação oligomérica gerando subunidades tais como o dodecâmero, o trímero e o monômero. Além disso, as técnicas de DSC, dicroísmo circular (CD) e absorção óptica permitiram o monitoramento da desnaturação da estrutura protéica global, da estrutura secundária e do centro ativo da HbGp, em função da temperatura. Por DSC foi determinado que o mecanismo do processo de desnaturação térmica da HbGp é irreversível. As variações de entalpia calorimétrica, ΔHcal, e de van Hoff, ΔHvH, nas formas oxi-, meta- e cianometa-HbGp são bem distintas, em todos os pHs estudados, indicando que o processo de desnaturação é bastante complexo, sugerindo que o pico de transição deve ser composto por varias transições. A ordem de estabilidade apresentada pela HbGp em termos dos valores de temperatura de transição (Tm) foi a seguinte: cianometa- > oxi- > meta- no intervalo de pH 5,0 a 8,0. Os valores de ΔHcal no pH 7,0 para a oxi-HbGp, meta-HbGp e cianometa-HbGp foram de 25 ± 4, 20 ± 2 e 56 ± 4 MJ/mol, respectivamente. Os valores de energia de ativação (Ea) obtidos no pH 7,0 para a oxi- e cianometa-HbGp foram de 673 ± 99 e 780 ± 105 KJ/mol, e no pH 8,0 de 897 ± 106 e 850 ± 201 KJ/mol, respectivamente. Esses valores de energia de ativação são condizentes com os reportados na literatura para outras hemoglobinas. Nos estudos realizados por CD a oxi-HbGp forma hemicromo no pH 6,0 e 7,0, em temperaturas superiores a 40 °C, e se dissocia em meio alcalino. A oxi-HbGp apresenta temperatura crítica (Tc) nas regiões das hélices-α e do grupo heme praticamente idêntica nos vários pHs estudados. A cianometa-HbGp possui maior quantidade de estrutura secundária do que a oxi-HbGp, e maiores valores de temperatura crítica (Tc), sendo bem mais estável que a oxi-HbGp, assim como o observado por DSC. Por absorção óptica o comportamento térmico da HbGp é similar ao do CD, sendo observado ainda, além da formação de hemicromo, a presença de espécies pentacoordenadas no pH neutro e alcalino. / The thermal stability as a function of the pH, for three forms of the extracellular giant hemoglobin of the annelid Glossoscolex paulistus (HbGp) was monitored by DSC, CD and optical absorption in the present work. These studies allowed the determination of important parameters characterizing the denaturation and dissociation at acid, neutral and alkaline pH values. HbGp was shown to be more stable in acid pH as compared to neutral and alkaline pH values. In alkaline medium, HbGp presents oligomeric dissociation generating smaller subunits such as the dodecamer, the trimer and the monomer. Besides that, the techniques of the DSC, circular dichroism (CD) and optical absorption spectroscopy allowed to monitor, respectively, the denaturation of the global protein structure, of the secondary structure and of the active center of the hemoglobin, as a function of the temperature. By DSC it was determined that the mechanism of the thermal denaturation of the HbGp is irreversible. The variations of calorimetric and van Hoff enthalpies, in the oxy- and cyanomet-HbGp forms, are quite different, for all studied pH values, indicating that the process of denaturation is complex, characterized by a transition peak composed by several contributions. The order of stability presented by the HbGp in terms of the transition temperature values (Tm) was the following: cyanomet-> oxy- for pH from 5.0 to 8.0. The values of ΔHcal at pH 7.0 for the oxy-HbGp, met-HbGp and cianomet-HbGp were 25 ± 4, 20 ± 2 and 56 ± 4 MJ/mol, respectively. The activation energy values (Ea) obtained at pH 7.0 for the oxy- and cyanomet-HbGp were 673 ± 99 and 780 ± 105 KJ/mol, and at pH 8.0 they were 897 ± 106 and 850 ± 201 KJ/mol, respectively. Those energy values are consistent with data reported in the literature for other hemoglobins. In the studies carried out by CD for oxy-HbGp formation of hemichrome was observed at pH 6.0 and 7.0, at temperatures above 40 °C. In alkaline medium the oligomeric dissociation is observed. Oxy-HbGp presents critical temperatures (Tc), which are practically identical in the spectral regions of the polypeptide and of the heme groups for all studied pH values. The cyanomet-HbGp own larger quantity of secondary structure than oxy-HbGp, and higher values of critical temperatures (Tc), being more stable than oxy-HbGp, in agreemente with DSC data. Optical absorption spectroscopy shows thermal behavior of HbGp similar to that observed by CD. Besides the formation of the hemichrome species upon heating, the presence of penta-coordinate species at neutral and alkaline pH values was observed.

A hemoglobina extracelular de Glossoscolex paulistus (HbGp) possui estrutura oligomérica composta por 144 cadeias globínicas e 36 cadeias linkers, que não possuem heme, formando uma bicamada hexagonal. Estudos mostraram que a HbGp possui uma alta estabilidade á variação de pH e presença de agentes desnaturantes, tais como, surfactantes e ureia, a 25°C. Com esses conhecimentos prévios, o presente estudo tem por objetivo avaliar a estabilidade térmica da HbGp 0,5-3,0 mg/mL, nas formas oxi-, meta- e cianometa-, em diferentes valores de pH. O efeito do SDS na estabilidade térmica da oxi-HbGp 0,5 e 3,0 mg/mL, em função do pH, será investigado também. Esses estudos foram realizados usando as técnicas de absorção óptica, dicroísmo circular (CD), espalhamento de luz dinâmico (DLS) e espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS). Os resultados de absorção óptica e CD revelam que o processo de desnaturação da oxi- e cianometa-HbGp, no pH 7,0, envolve a formação das espécies oxidadas aquo-meta-HbGp e hemicromo. O processo de desnaturação é próximo ao modelo de dois estados, com uma temperatura crítica (Tc) de 58-59 °C. No pH ácido, a proteína agrega a partir de 58 °C. A cinética de agregação da oxi-HbGp, no pH 7,0, é dependente da concentração de proteína e da temperatura. Os dados de DLS mostram que a meta- e cianometa-HbGp 0,5 mg/mL, pH 7,0, desnaturam a 48 ± 1 e 56 ± 1 °C, respectivamente. Em pH alcalino, a proteína dissocia parcialmente antes de desnaturar, e o aumento da concentração de proteína faz aumentar o valor de Tc para a cianometa-HbGp. Dados de SAXS mostram que a oxi- e meta-HbGp, pH 7,0, desnaturam a 60 °C, apresentando valores de Rg=143±1 Å e Dmax=450±1 Å, enquanto que a cianometa-HbGp se mantém estável, com valores de Rg=107±1 Å e Dmax=300±1 Å. As análises das curvas p(r) mostram uma porcentagem crescente de dodecâmero e tetrâmero em solução, em relação à fração de protreína íntegra e de subunidades maiores, com o aumento do pH e da temperatura. As análises baseadas no programa OLIGOMER são similares às baseadas na função p(r). A presença do SDS induz a dissociação da oxi-HbGp 0,5 mg/mL pH 7,0. Entretanto, com 3,0 mg/mL de proteína a dissociação é parcial, com a sobreposição dos processos de dissociação, desnaturação e agregação, com o aumento da temperatura. No pH 5,0, o SDS promove a agregação da oxi-HbGp em temperaturas menores. As constantes cinéticas de dissociação da oxi-HbGp 0,5 mg/mL, pH 7,0 aumentam de (0,53±0,07)x10-4 s-1 para (2,1±0,2)x10-4 s-1 na presença de 0,4 e 0,6 mmol/L de SDS a 40 °C, respectivamente. Na temperatura de 42 °C a constante aumenta 2,6 vezes, com 0,6 mmol/L de SDS, comparada a 40 °C. A oxi-HbGp 3,0 mg/ml na presença de 0,6 mmol/L de SDS, dissocia parcialmente em tempos menores com o aumento da temperatura antes de agregar. Portanto, esses estudos mostram que a estabilidade térmica da HbGp é sensível ao aumento de pH e presença de SDS. A ordem de estabilidade térmica em pH alcalino é dado por: cianometa->oxi->meta-HbGp. Alem disso, o processo de desnaturação é governado pelo valor do pH e dependente da concentração de proteína em solução. / The extracellular hemoglobin Glossoscolex paulistus of (HbGp) has an oligomeric structure composed by 144 globin chains and 36 non globin chains (named linkers), forming a hexagonal bilayer. HbGp presents a high stability reagarding pH variation and the presence of denaturing agents, such as, for example, urea and surfactant, at 25°C. In this way, the present studies aim to evaluate the thermal stability for oxy-, meta- and cyanomet-HbGp 0.5-3.0 mg/ml, at different pH values. The SDS effect on the thermal stability of oxy-HbGp 0.5 and 3.0 mg / mL is also investigated. Optical absorption, circular dichroism (CD), dynamic light scattering (DLS) and small angle X-ray scattering (SAXS) techniques were emplayed for these studies. The results based on the optical absorption and CD spectroscopies show that the denaturation process for oxy- and cyanomet-HbGp, at pH 7.0, involves the formation of oxidized species, such as aquo-met-HbGp and hemichrome. This denaturation process is very close to a two-state model, with a critical temperature (Tc) of 58-59 °C. However, in the acidic pH, the aggregation of protein occurs at 58 °C. The aggregation process kinetics for oxy-HbGp, pH 7.0, is dependent on the protein concentration and temperature. DLS data show that meta- and cyanomet-HbGp, 0.5 mg/mL, pH 7.0, undergo denaturation at 48 ± 1 and 56 ± 1 ° C, respectively. At alkaline pH, two HbGp forms undergo partial dissociation before denaturation, and at higher protein concentration, an increase of Tc values for cyanomet-HbGp is observed. SAXS results show that the denaturation of oxy-and met-HbGp occur at 60 °C, presenting Rg=143±1 Å and Dmax=450±15 Å, while cyanomet-HbGp remains stable with Rg =107±1 Å and Dmax= 300±10Å, at this temperature. The p(r) curves analysis show the increase of dodecamer and tetramer percentages in solution, with increase of pH and temperature. The results using the OLIGOMER program are similar to the p(r) data analysis. For oxy-HbGp 0.5 mg/mL pH 7.0, in the presence of SDS, oligomeric dissociation before denaturation is observed. However, with 3.0 mg/ml of protein the dissociation process is slower, showing an overlap of the dissociation, denaturation and aggregation processes in the system, with increase of temperature. At pH 5.0, SDS promotes the aggregation of oxy-HbGp at lower temperatures, as compared to the absence of surfactant. The kinetic dissociation constant values for oxy-HbGp 0.5 mg/mL increase from (0.53 ± 0.07) x10-4 s-1 to (2.1 ± 0.2) x10-4 s-1, in the presence of 0.4 and 0.6 mmol/L SDS at 40 ° C, respectively. At 42 °C the dissociation constant value increases 2.6-fold, with 0.6 mmol/L SDS, as compared to 40 °C. For oxy-HbGp 3.0 mg/ml, in the presence of 0.6 mmol/L SDS, the oligomeric dissociation is smallest occurring in shorter times with increasing temperature before aggregation. Therefore, these studies show that the thermal stability of HbGp is sensitive to the pH variation and the presence of SDS. At alkaline pH, the order of thermal stability is the following: cyanomet->oxy->met-HbGp. Furthermore, the denaturation process is governed by the pH value, being dependent on the protein concentration in solution.