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Amplificação gênica alelo específica e multiplex no diagnóstico laboratorial de hemoglobinas anormais /

Bertholo, Luciane Cristina. January 2005 (has links)
Orientador: Haroldo Wilson Moreira / Banca: Ivan de Lucena Angulo / Banca: Ana Maria de Souza / Banca: Luiz Carlos de Mattos / Banca: Amauri Antiquera Leite / Resumo: As hemoglobinopatias constituem um grupo de alterações hereditárias prevalentes em muitas regiões do mundo, atingindo a população brasileira de forma significativa; sendo decorrentes de alterações em genes estruturais, responsáveis pelo aparecimento das hemoglobinas variantes ou em genes reguladores, resultando as talassemias. Sendo assim, foram propósitos do presente trabalho estabelecer metodologia laboratorial embasada em estudo molecular que possibilite o auxílio diagnóstico de hemoglobinas anormais observadas na população brasileira e sem caracterização completa ou pouco informativa; utilizar primers que se acoplem exatamente na posição da mutação do alelo mutante e na respectiva posição do alelo normal, com possibilidade da realização de amplificação gênica alelo específica e com esses conhecimentos, estabelecer protocolos de aplicação laboratorial para uso na rotina. As amostras de estudo foram constituídas por 20 modelos de mutações pertencentes a portadores das mesmas e que inicialmente apresentavam alterações em seu perfil eletroforético, sendo coletadas ou do próprio sujeito da pesquisa ou obtidas de banco de amostras. Os indivíduos eram de ambos os sexos, com diferentes idades e características raciais (caucasóides e não caucasóides) e pertencentes às diversas classes econômicas. Os resultados obtidos permitem concluir que foi possível padronizar um teste diagnóstico, baseado na amplificação gênica alelo específica (PCR-AE) e na amplificação gênica multiplex (PCR-Multiplex). / Abstract: The hemoglobinopathies are a group of hereditary hemoglobin disorders with worldwide distribution, meeting Brazilian population significantly; being decurrent from structural genes alterations, responsible for hemoglobin variants or in regulatory genes, results the thalassemia. The results permit us to conclude that it was possible to standardize a diagnostic test, based on allele-specific amplification (PCR-AE) and multiplex PCR assay. The applicability of these methodologies give us confidence on results interpretation, and it is easy of execution, and with cost around 25% less of methods that uses restriction enzyme analysis, and can offer us a laboratory diagnostic in a short time. The methodologies or association of obtained knowledge gave us the possibility to identify homozygous, heterozygous and interactions, and was possible to establish specific protocols to identify hemoglobinopathies that attacks our population, and can be used on laboratorial routines. / Doutor
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Avaliação da expressão da talassemia Beta no Brasil pela coherança com defeitos de hemocromatose /

Carvalho, Lya Bueno. January 2003 (has links)
Orientador: Claudia Regina Bonini Domingos / Banca: Ricardo Luiz Dantas Machado / Banca: Paula Rahal Liberatore / Resumo: A talassemia beta constitui um grupo heterogêneo de distúrbios genéticos da síntese de hemoglobina sendo uma das doenças monogênicas mais comums, identificada e estudada por várias décadas. É originária da região do Mediterrâneo porém, atualmente apresenta-se amplamente distribuída pelo mundo devido ao fluxo gênico pela migração das populações. No Brasil, os tipos de talassemia mais prevalentes são as talassemias alfa e beta e apresentam número variável de indivíduos portadores devido ao alto grau de miscigenação da população. As formas graves de talassemia beta são facilmente diagnosticadas entretanto, as formas mais suaves muitas vezes são interpretadas e tratadas como anemia ferropriva. O presente estudo teve como objetivo caracterizar as formas talassêmicas do tipo beta e verificar os interferentes na expressão do fenótipo como a possível co-herança com hemocromatose hereditária. Através da associação de análise hematimétrica, metodologias clássicas e análise por HPLC analisamos 332 amostras de sangue com suspeita de talassemia beta. Um total de 70 amostras foram identificadas como portadores de hemoglobinas normais (AA), 145 portadores de talassemia beta heterozigota (BTH) e 117 portadores de talassemia alfa/beta (ABT). A análise estatística por regressão linear entre as metodologias clássicas e HPLC para quantificação de hemoglobina A2 e Fetal para os três grupos foram estatisticamente significativas. A análise molecular por PCR-ASO para identificação dos mutantes para hemocromatose hereditária mostraram 11,76% de mutação C282Y e 70,58% para H63D no grupo de talassemia beta e 25% de mutação C282Y e 75% H63D para o grupo de talassemia alfa/beta. Esses resultados evidenciam a necessidade da associação de metodologias para o correto diagnóstico da talassemia beta, bem como caracterização molecular para hemocromatose...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The beta-thalassemia constitutes a heterogeneous group of genetic disorders of hemoglobin synthesis. It has been one of the most common monogenic diseases identified and studied for many decades. Its origins are from Mediterranean region, although nowadays it is spread for the whole world due to gene flow of migration populations. In Brazil, the most prevalent types of thalassemia are the alpha-thalassemia and beta-thalassemia. They present a variable number of individual carriers due to high degree of miscigenation. The serious forms of beta-thalassemia are easily identified, but the milder forms are many times diagnosed and treated as iron deficiency anemia. The objective of the present study was to characterize the thalassemic forms and verify the interferents in the expression of the phenotype as the possible co-inheritance with hereditary hemochromatosis. It was analysed, utilizing hematimetric analysis, classic methodologies and HPLC analysis, 332 blood samples suspect of beta-thalessemia. The total of 70 samples were identified as carriers of normal hemoglobins (AA), 145 carriers of beta-thalassemia heterozigote (BTH) and 117 carriers of alpha/beta-thalassemia (ABT). The statistic analysis by linear regression between classic methodologies and HPLC for quantification of hemoglobin A2 and Fetal hemoglobin were statistically differents and significants. The molecular analysis by PCR-ASO to identify the mutants with hereditary hemochromatosis showed 11,76% of mutation C282Y and 70,58% to H63D in the beta-thalassemia group and 25% of mutation C282Y and 75% of H63D in the alpha/beta- thalassemia group. These results prove the necessity of association of methodologies in order to achieve the correct diagnosis of beta-thalassemia, as well as the molecular characterization of hemochromatosis, due to the fact of its possible co-inheritance with beta-thalassemia in the vast genotypic diversity found in Brazil. / Mestre
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Processo oxidativo em doadores de sangue portadores de hemoglobina S e mutantes no gene HFE /

Baracioli, Lígia Márcia da Silveira Viana. January 2009 (has links)
Orientador: Claudia Regina Bonini Domingos / Banca: Rodolfo Delfini Cançado / Banca: Ivan de Lucena Angulo / Banca: Maria Tercilia de Azeredo Oliveira / Banca: Eduardo Alves de Almeida / Resumo: As hemoglobinopatias são as mais comuns das doenças genéticas e são classificadas em Talassemias e Variantes de Hemoglobinas. A Hb S é originada por uma mutação de ponto no códon que origina o aminoácido da posição seis da cadeia beta globina, resultando em uma modificação estrutural na molécula que altera sua solubilidade e cristalização. A Hb S apresenta efeito sobre as células sangüíneas, desencadeando processos oxidativos com geração de radicais livres. Efeito semelhante observa-se no acúmulo de ferro, em decorrência da hemocromatose hereditária. Os defeitos de metabolismo do ferro, em especial aqueles oriundos dos polimorfismos no gene HFE, levam ao acúmulo de ferro tecidual, com potencial capacidade oxidante e peroxidação lipídica. Fundamentados no possível efeito tóxico da mutação no gene da globina βS (Hb S) e do acúmulo de ferro tecidual, relatados na literatura, objetivou-se avaliar a influência dos polimorfismos do gene HFE na peroxidação lipídica dos portadores dessa alteração de hemoglobina e sua relação com o aumento da destruição eritrocitária e geração de estresse oxidativo. Foram analisadas 16.000 amostras de doadores de sangue e encontrou-se uma freqüência de Hb AS de 1,69% na região Noroeste do Estado de São Paulo. Destes, 43 apresentaram herança da Hb S e de pelo menos um dos dois polimorfismos no gene HFE testados. A freqüência dos polimorfismos C282Y e H63D, no gene HFE, no grupo de doadores com Hb AS, esta de acordo com os dados da literatura. No grupo de doadores de sangue com Hb AS observamos que, na herança concomitante dos dois polimorfismos, os níveis de MDA, indicativo de peroxidação lipídica, estavam elevados, indicando a influência de ambas afecções genéticas, no aumento dos níveis de peroxidação lipídica. Entretanto, os níveis médios da TEAC, indicativo da capacidade oxidante, apresentaram-se... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The hemoglobinopathies are the most common of the genetic disease and are classified in Thalassemia and Hemoglobin Variants. Hb S is originated by a point mutation in the codon that originates the sixth aminoacid of the β globin chain, resulting in a structural modification in the molecule that modifies the solubility and crystallization. Hb S presents an effect on the blood cells, unchaining the oxidative processes with the free radicals generation. Similar effect is observed in the iron accumulation, in result of the hereditary hemochromatosis. The iron metabolism defects, in special those one from the HFE gene polymorphism, lead to the tissue iron accumulation with potential oxidant capacity and lipid peroxidation. Based on the possible toxic effect of the mutation in the globin βS gene (Hb S) and tissue iron accumulation, mentioned in the literature, we was aimed evaluate the influence of HFE gene polymorphism in the lipid peroxidation in blood donors with hemoglobin S alteration and the relation with the eritrocitary destruction increase and oxidative stress generation. 16,000 samples of blood donor had been analyzed and it was found a Hb frequency of 1,69% from the Northwest São Paulo state region. Among them, 43 had presented concomitance in the Hb S inheritance and one of the two HFE gene polymorphism. The frequency of C282Y and H63D polymorphism, in the HFE gene, in the blood donor group with Hb S, is in according to the literature. We also verified in the blood donor group with Hb AS that, in the concomitant inheritance of the two polymorphism, the MDA levels, indicative of lipid peroxidation, were raised, showing the influence of both genetic affections, in the levels of lipid peroxidation. However, the TEAC average levels, indicative of the oxidant capacity, had been presented normal, indicating that in spite of a lipid peroxidation raise, this is not followed... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

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