Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los virus siempre necesitarán de la maquinaria metabólica de la célula infectada para replicar su material genético, produciendo numerosas copias del virus original. En dicho proceso, algunos virus poseen la capacidad de producir un efecto citopático denominado lisis celular. Dentro de los virus que producen este efecto se encuentran los virus Herpes, descritos en insectos, reptiles, anfibios y moluscos; como también en casi todas las especies de aves y mamíferos que se han investigado. Uno de los virus de interés veterinario es el Herpes Canino Tipo 1 (CaHV1), debido a que su persistencia en un criadero canino provoca pérdidas económicas considerables, que incluso pueden significar el cierre de este tipo de empresas. El CaHV1 provoca una alta cantidad de cuadros clínicos, en especial en cachorros menores de cuatro semanas, en donde se ha descrito una mortalidad cercana al 90% de la camada. Si bien en Chile su detección y caracterización biológica fue descrita hace algunos años, obteniéndose un aislado nativo denominado RP5, lamentablemente aún no existe un método diagnóstico rápido. Bajo este contexto, el objetivo de este estudio fue la detección simultánea de dos fragmentos del gen de la glicoproteína B del CaHV1 en un mismo PCR (variante múltiplex) a partir del aislado RP5. Así, al determinar las temperaturas y tiempos óptimos para las etapas de alineamiento y elongación, se pudo implementar una herramienta de diagnóstico molecular que podría ser utilizada y comparada con otros protocolos de PCR, que actualmente se están desarrollando en otras memorias de Título en la Unidad de Virología de nuestra Facultad

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La diferencia fundamental entre un virus y los microorganismos reside en la forma de generar progenie, pues los virus no siguen la estrategia de formar nuevas partículas mediante fisión binaria. Su proceso de replicación es particular, pues considera la unión a la célula blanco, la exposición del genoma viral, la replicación del genoma, la producción de proteínas virales, el ensamble de la partícula viral y la salida al exterior de la célula. En esta última etapa, algunos virus destruyen la membrana celular produciendo un daño irreparable que lleva a la muerte celular, fenómeno denominado citolisis y que puede ser observado a través del microscopio óptico, lo cual permite un acercamiento al diagnóstico de su presencia. El virus herpes es uno de los que presentan esta capacidad citolítica y ha sido descrito en insectos, reptiles, anfibios y moluscos; también en prácticamente todas las especies de aves y mamíferos que se han investigado. Dentro de la medicina veterinaria se han descrito varios virus herpes de importancia, dentro de los cuales se encuentra el Virus Herpes Canino tipo 1 (CaHV1), debido principalmente al cuadro que ocasiona al infectar cachorros, pudiendo provocar la pérdida de camadas completas y en reproductores, ya que quedan como portadores de por vida. Lo anterior, se traduce finalmente en cuantiosas pérdidas económicas para los planteles, sobretodo si se trata de animales de alto valor genético. Debido a esto, es indispensable poder realizar un diagnóstico temprano. En este estudio, se aportó tanto a la caracterización genómica de un aislado nacional del virus CaHV1 -denominado RP5, detectado y caracterizado biológicamente en el año 2005- como también a la medicina veterinaria de pequeños animales con un método diagnóstico específico, sensible y de rápido resultado. Para ésto, se realizó la detección del gen de la glicoproteína C del CaHV1 mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) utilizando un par de partidores diseñados in silico. Con la utilización de un termociclador de gradiente de temperaturas se estableció la temperatura de alineamiento (55ºC) mediante la observación nítida e inequívoca de un fragmento de DNA de aproximadamente 200 pb. Estos fragmentos fueron secuenciados y se estableció un porcentaje de identidad nucleotídica de 95% respecto del dato oficial del GenBank. Este alto valor de identidad indica que el fragmento amplificado corresponde al fragmento del gen gC y constituye una evidencia mas que confirma que el aislado nacional utilizado como fuente viral, corresponde a CaHV1

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El virus herpes canino tipo 1 (CaHV1) provoca una enfermedad hemorrágica mortal en cachorros menores de cuatro semanas, mientras que en cachorros mayores de cuatro semanas produce algunos signos clínicos de menor gravedad como rinitis, faringitis o conjuntivitis. En adultos, es capaz de producir afecciones oculares y trastornos en la reproducción, y es un patógeno participante de la denominada “tos de las perreras”. El gen que codifica para gB, una glicoproteína presente en la envoltura viral, se encuentra descrito en una gran variedad de virus herpes, debido a que es esencial para el proceso de ingreso del virus a la célula y así definir la ruta de neuroinvasión. Este trabajo se realizó en los laboratorios de Virología y Microbiología del Departamento de Medicina Preventiva Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile y su propósito fue contribuir a la caracterización molecular del aislado viral RP5, y confirmar la presencia de un virus herpes nativo, mediante la detección del gen de la glicoproteína B usando la reacción de la polimerasa en cadena (PCR). Los resultados obtenidos permiten demostrar una alta sensibilidad de la técnica implementada y una especificidad superior a otro protocolo de PCR implementado en otra memoria de título. Así, un porcentaje de identidad nucleotídica de 97% respecto de la secuencia publicada en GenBank permite calificar este protocolo como un serio aspirante a convertirse en un método diagnóstico para CaHV1 en Chile y por otra parte concluye que el aislado RP5 nativo corresponde a CaHV1. Finalmente, con este estudio confirmatorio el aislado RP5 podrá ser nombrado oficialmente como AFLC-61, la cepa chilena de CaHV1 / Financiamiento: Programa AUCAI, Universidad de Chile

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En Chile, el virus herpes canino (CaHV-1) se ha detectado mediante técnicas clásicas de virología como aislamiento en cultivos celulares y posterior citólisis de las células afectadas, mediante inmunofluorescencia, por la presencia de cuerpos de inclusión o mediante estudios de cinética viral, lo cual ha permitido completar el análisis biológico de un aislado nacional denominado RP5. En contraste, en el presente trabajo se realizó la detección molecular del gen UL37 de CaHV-1, gen que codifica para la proteína UL37, presente en el tegumento del virus y que participa del ciclo replicativo viral. Para tal efecto, se utilizaron 6 inóculos virales obtenidos de sobrenadantes de cultivos celulares de la línea MDCK infectados con RP5. Para el PCR se utilizaron los partidores CHV-1: 5’-AAGAGCTCGTGTTAGTGAAAAT 3´ y CHV-2: 5’-TAAACCCGCTGGA TGATAC- 3’ (Erles et al., 2004). La visualización del amplicón se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 %. La electroforesis se llevó a cabo a 90 volts por 90 minutos. Como marcador de tamaño molecular se utilizó un estándar que contiene fragmentos de ADN entre 100 y 1000 pb. Luego de la electroforesis, el gel se incubó en bromuro de etidio (0,5 μg/ml), posteriormente lavado, colocado en un transiluminador de luz ultravioleta y finalmente fotografiado. Todos los sobrenadantes de cultivos celulares utilizados resultaron positivos al PCR descrito, observándose una banda de alrededor de 500 pb, lo cual concuerda con lo descrito en la literatura al utilizar esta metodología. Para tener una aproximación de la sensibilidad de la técnica empleada, se realizaron diluciones al décimo (10-1-10-8) del inóculo viral RP5 (DICT50 = 1,58 x 106/mL) y se determinó la dilución a la cual el PCR descrito no detectó el gen de la proteína UL37. Así, siete de las ocho diluciones resultaron positivas al PCR, observándose una banda de alrededor de 500 pb. Lo anterior indica que este método permitiría detectar hasta 0,00079 DICT50, lo que comparado con las 100DICT50 que se requieren para lograr la infección en células, sugiere una alta sensibilidad asociada al PCR. El producto amplificado fue purificado, secuenciado y se determinó el porcentaje de identidad nucleotidica respecto a un fragmento del gen de la UL37 de virus herpes canino (GenBank accession number AY582738). Así, se determinó que entre la secuencia del GenBank y la secuencia de consenso del amplificado nacional existe un 94% de identidad nucleotídica. Adicionalmente, se comparó la secuencia obtenida con las de otras seis secuencias del gen UL37 presentes en cepas de herpes virus existentes en el Genbank y no se estableció un porcentaje de identidad mayor al obtenido respecto de las secuencias comparadas, lo cual sugiere que la secuencia obtenida en esta memoria de título pertenece al CaHV1. Así, podemos concluir que esta metodología permite la detección de un amplicón de ADN con características compatibles con las descritas para el gen de la proteína UL37 del CaHV-1 mediante una herramienta molecular que cumple con las características del diagnóstico actual: rápido, sensible, específico y de bajo costo. Lo anterior, sin duda, permitirá contribuir para resolver un problema existente en los planteles reproductores caninos, al tener la posibilidad de ofrecer la detección del CaHV1 en pequeños animales como mascotas de compañía, un área de sostenido crecimiento

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / En la actualidad los avances científicos y tecnológicos permiten realizar pruebas diagnósticas cada vez más sensibles y sencillas. Sin embargo el aislamiento viral sigue siendo la prueba más importante y utilizada cuando se inicia un estudio en virología. Para ello es necesario contar en el laboratorio con células que permitan la penetración y posterior multiplicación de las partículas virales. Si bien existe una amplia variedad de líneas celulares, es fundamental conocer cuáles son las líneas celulares específicas para un determinado virus que permitan llevar a cabo los objetivos antes mencionados. En el caso del Virus Herpes Canino tipo 1, denominado actualmente como CaHV1 (Davison et al., 2009), se ha descrito sólo una línea susceptible, por lo que conocer la existencia de otras líneas útiles para su investigación es de gran relevancia, permitiendo un manejo más robusto en el estudio de este virus. El objetivo de este trabajo fue probar la factibilidad de emplear otras líneas celulares que permitieran trabajar en el laboratorio con el CaHV1. Se trabajó con 6 líneas celulares de uso habitual en el laboratorio de cultivos celulares del Instituto de Salud Pública (ISP): MDCK, Hep-2, L20b, MNA, Vero, RD, las cuales fueron sometidas a subcultivos y a un inóculo de origen nacional del CaHV1, buscando efecto citopático de lisis celular. Se observó efecto citopático de lisis celular característico del CaHV1 en la línea de origen canino MDCK, situación confirmatoria de los resultados obtenidos en investigaciones anteriores. Los cambios en las líneas celulares: Hep-2, RD, Vero, MNA observados durante el periodo post-infección, no pudieron ser cualitativamente identificados como característicos de efecto citopático de lisis celular provocada por CaHV1, de tal modo que los resultados experimentales demostrarían que la línea celular MDCK, por el momento, es la única viable para el diagnóstico del CaHV1 en el laboratorio