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A angiogênese é um processo fundamental e fisiológico de organismos vertebrados, sendo responsável pela formação de novos vasos sanguíneos a partir dos já existentes. Entretanto, a angiogênese pode ocorrer também em condições patológicas, como causa ou consequência de doenças. Um exemplo disso está nos tumores, que para crescer além de alguns milímetros cúbicos, necessitam de um suprimento adequado de oxigênio e nutrientes, e, portanto, dependem da angiogênese. Por isso, compostos que inibem a angiogênese já estão em uso na clínica, não só para o tratamento de tumores, mas também de outras doenças dependentes da angiogênese, as retinopatias. Neste projeto, daremos continuidade à linha de pesquisa do nosso grupo, que procura identificar e validar peptídeos com potencial translacional (pré-fármacos), por apresentarem atividade anti-angiogênica. Utilizando a metodologia do Phage Display, nosso grupo identificou e caracterizou um hexapeptídeo, que foi selecionado por interagir com os receptores do principal fator iniciador da angiogênese, o VEGF (fator de crescimento endotelial vascular). Os receptores de VEGF (ou VEGFR) são proteínas do tipo receptor tirosina quinase, expressos em células endoteliais e essenciais para a iniciação e progressão da neovascularização. O hexapeptídeo identificado em nosso laboratório liga-se ao VEGFRs e inibe a formação de vasos sanguíneos in vivo em modelos animais de angiogênese. Neste trabalho, procuramos estender os estudos com este hexapeptídeo para identificar o sítio de ligação do mesmo no VEGFR e avançar em modelos que permitam a determinação dos requisitos estruturais de interação peptídeoreceptor. Com estes conhecimentos, poderemos num futuro próximo, caminhar para o desenvolvimento racional de moléculas peptideomiméticas com propriedades anti-angiogênicas. / Angiogenesis is a fundamental and physiological process for vertebrate organisms, being responsible for the formation of new blood vessels, sprouting from the existent ones. However, angiogenesis may occur in pathological conditions, being cause or consequence of diseases. One example is tumor development. To grow beyond a few cubic millimeters, tumors need a suitable supply of oxygen and nutrients, and, therefore, they are dependent of angiogenesis. In fact, anti-angiogenic compounds are already in therapeutic use, targeting not only tumors but other angiogenesis dependent diseases, like retinopathies. In this project, we expand research from our own group to identify and develop anti-angiogenic peptides with translational potential (pre-drugs). Using Phage Display methodology, our group identified and characterized a hexapeptide, that was selected based on its capacity to interact with the receptors for the main initiator factor of angiogenesis, the VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). VEGF receptors (VEGFR) are tyrosine kinase proteins, expressed by endothelial cells and essential for neovascularization initiation and progress. The hexapeptide identified in our lab binds to VEGFRs and inhibit blood vessel formation in vivo when tested in an angiogenesis animal model. In this study, we seek to further understand the interaction of this hexapeptide with its receptor by identifying its binding domain on VEGFR and develop models that will allow the determination of the structural requirements for interaction of this receptor ligand pair. With this knowledge, we can in a near future progress to a rational development of novel peptidemimetic molecules with angiogenic properties similar to this hexapeptide.

A angiogênese é um processo fundamental e fisiológico de organismos vertebrados, sendo responsável pela formação de novos vasos sanguíneos a partir dos já existentes. Entretanto, a angiogênese pode ocorrer também em condições patológicas, como causa ou consequência de doenças. Um exemplo disso está nos tumores, que para crescer além de alguns milímetros cúbicos, necessitam de um suprimento adequado de oxigênio e nutrientes, e, portanto, dependem da angiogênese. Por isso, compostos que inibem a angiogênese já estão em uso na clínica, não só para o tratamento de tumores, mas também de outras doenças dependentes da angiogênese, as retinopatias. Neste projeto, daremos continuidade à linha de pesquisa do nosso grupo, que procura identificar e validar peptídeos com potencial translacional (pré-fármacos), por apresentarem atividade anti-angiogênica. Utilizando a metodologia do Phage Display, nosso grupo identificou e caracterizou um hexapeptídeo, que foi selecionado por interagir com os receptores do principal fator iniciador da angiogênese, o VEGF (fator de crescimento endotelial vascular). Os receptores de VEGF (ou VEGFR) são proteínas do tipo receptor tirosina quinase, expressos em células endoteliais e essenciais para a iniciação e progressão da neovascularização. O hexapeptídeo identificado em nosso laboratório liga-se ao VEGFRs e inibe a formação de vasos sanguíneos in vivo em modelos animais de angiogênese. Neste trabalho, procuramos estender os estudos com este hexapeptídeo para identificar o sítio de ligação do mesmo no VEGFR e avançar em modelos que permitam a determinação dos requisitos estruturais de interação peptídeoreceptor. Com estes conhecimentos, poderemos num futuro próximo, caminhar para o desenvolvimento racional de moléculas peptideomiméticas com propriedades anti-angiogênicas. / Angiogenesis is a fundamental and physiological process for vertebrate organisms, being responsible for the formation of new blood vessels, sprouting from the existent ones. However, angiogenesis may occur in pathological conditions, being cause or consequence of diseases. One example is tumor development. To grow beyond a few cubic millimeters, tumors need a suitable supply of oxygen and nutrients, and, therefore, they are dependent of angiogenesis. In fact, anti-angiogenic compounds are already in therapeutic use, targeting not only tumors but other angiogenesis dependent diseases, like retinopathies. In this project, we expand research from our own group to identify and develop anti-angiogenic peptides with translational potential (pre-drugs). Using Phage Display methodology, our group identified and characterized a hexapeptide, that was selected based on its capacity to interact with the receptors for the main initiator factor of angiogenesis, the VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). VEGF receptors (VEGFR) are tyrosine kinase proteins, expressed by endothelial cells and essential for neovascularization initiation and progress. The hexapeptide identified in our lab binds to VEGFRs and inhibit blood vessel formation in vivo when tested in an angiogenesis animal model. In this study, we seek to further understand the interaction of this hexapeptide with its receptor by identifying its binding domain on VEGFR and develop models that will allow the determination of the structural requirements for interaction of this receptor ligand pair. With this knowledge, we can in a near future progress to a rational development of novel peptidemimetic molecules with angiogenic properties similar to this hexapeptide.

O dimetilaminoetanol (DMAE) e o acetil hexapeptídeo-3 (AHP) vêm sendo utilizados em formulações dermocosméticas com finalidade antienvelhecimento. No entanto, há poucos trabalhos na literatura referentes aos efeitos dessas substâncias ativas no tecido cutâneo. Assim, o presente estudo tem por objetivos o desenvolvimento, a avaliação da estabilidade física, da segurança e da eficácia clínica de formulações dermocosméticas contendo DMAE e/ou AHP. Para tal, foram preparadas quatro formulações à base de ceras auto-emulsionantes compostas por álcool batílico e lecitina de soja ou ésteres de polietilenoglicol, estabilizadas por polímeros hidrofílicos (hidroxietilcelulose ou polímero de acrilato). Estas formulações foram acrescidas ou não (veículo) de 10% de uma solução a 0,05% de AHP e/ou de 9% de DMAE acetamidobenzoato e submetidas a testes preliminares de estabilidade. A seguir, foram realizados estudos de estabilidade por determinação do comportamento reológico, bem como uma análise sensorial. A formulação composta de ésteres de polietilenoglicol e polímero de acrilato (F4) apresentou melhor estabilidade e melhor sensorial e, assim, foi utilizada como veículo nos testes clínicos. Nesses testes avaliou-se a compatibilidade cutânea após uma única aplicação do produto na região das costas das voluntárias e a eficácia a curto (efeitos imediatos) e a longo prazo. Para a avaliação dos efeitos imediatos, analisou-se a hidratação, as propriedades viscoelásticas e o micro-relevo da pele da região ventral dos antebraços, após 2 horas da aplicação das formulações: veículo (F4) , veículo + DMAE (F4D), veículo + AHP (F4A) e veículo + DMAE + AHP (F4AD). Para analisar os efeitos a longo prazo, as voluntárias aplicaram as formulações diariamente nos antebraços e na face sendo que, após 2 e 4 semanas de tratamento, foram realizadas medidas dos parâmetros acima mencionados e das propriedades mecânicas da pele por determinação de suas características anisotrópicas. Os resultados obtidos no estudo clínico mostraram que todas as formulações estudadas apresentaram compatibilidade cutânea muito boa além de efeitos imediatos aumentando o conteúdo aquoso do estrato córneo. Por outro lado, observou-se que apenas as formulações que continham as substâncias ativas provocaram uma diminuição significativa da perda transepidérmica de água (TEWL), ou seja, mostraram efeito na melhoria da função barreira da pele. A longo prazo, observou-se que todas as formulações provocaram aumento do conteúdo aquoso do estrato córneo na face, o que não ocorreu para o antebraço. No entanto, somente as formulações que continham AHP reduziram a anisotropia da pele da face, ou seja, com o uso de tais formulações ocorreu uma melhora significativa das propriedades mecânicas da pele. Em síntese, de acordo com os dados obtidos, pode-se concluir que as formulações desenvolvidas apresentaram-se estáveis, seguras e eficazes, uma vez que não sofreram alterações em suas propriedades físico-químicas e não causaram irritação na pele. Além disso, as formulações que continham AHP ou DMAE apresentaram efeitos imediatos na diminuição da TEWL e as formulações acrescidas de AHP reduziram a anisotropia da pele após 4 semanas de aplicação, melhorando significativamente o tônus e a firmeza da pele. Assim, o AHP pode ser considerado uma substância eficaz para aplicação em formulações dermocosméticas com finalidade antienvelhecimento. / Dimethylaminoethanol (DMAE) and acetyl hexapeptide-3 (AHP) have been used in dermocosmetic formulations for anti-aging purposes. However, few scientific papers are concerned about the effects of these active substances on cutaneous tissue. Thus, the aim of the present study is the development, evaluation of physical stability, safety and clinical efficacy of dermocosmetic formulations containing DMAE and/or AHP. Four formulations based on self emulsifying wax containing batyl alcohol and lecithin or polyethyleneglycol ester, stabilized by hydrophilic polymers (hydroxyethylcellulose or acrylate polymer) were prepared as vehicles. They were supplemented or not with acetyl hexapeptide-3 solution (0.05%) and DMAE acetamidobenzoate to final concentrations of 10% and 9%, respectively, and submitted to preliminary stability tests, followed by the determination of rheological behavior, as well as, sensorial analysis. The formulation containing polyethyleneglycol ester and acrylate polymer (F4), chosen as vehicle for the clinical trials, showed the best stability and sensorial. In these trials, skin compatibility was evaluated after a single product application on the backs of volunteers, as well as, the short (immediate effects) and long term efficacy. To evaluate the immediate effects, skin hydration, viscoelastic properties and skin microrelief were tested in the ventral forearm region, 2 hours after application of the formulations: vehicle (F4), vehicle + DMAE (F4D), vehicle + AHP (F4A) and vehicle + DMAE + AHP (F4AD). Long term effects of the same formulations were evaluated in volunteers by daily applications on the forearm and face. After 2 and 4 weeks of treatment, the same parameters were measured in addition to the determination of skin mechanical properties by its anisotropic characteristics. The results obtained in the clinical study showed that all formulations tested had a very good skin compatibility besides an immediate effect of increasing the stratum corneum water content. On the other hand, only formulations containing the active substances produced a significant decrease in transepidermal water loss (TEWL), in other words, these formulations improved the skin barrier function. Long term studies demonstrated that all formulations promoted an enhancement of the stratum corneum water content when applied on the face but not in the forearm. However, only formulations containing AHP reduced skin anisotropy in the face, ie, there was a significant improvement of the skin mechanical properties due to the use of these formulations. In summary, according to the results obtained, it can be concluded that the developed formulations were stable, safe and effective, since they did not present alterations in their physicochemical properties and did not cause skin irritation. Moreover, the formulations containing AHP or DMAE presented immediate effects by reducing the TEWL and the ones supplemented with AHP reduced the skin anisotropy after 4 weeks of application, significantly improving the skin tone and firmness. Thus, it is suggested that AHP may be considered an effective substance to be used in cosmetic formulations with anti-aging purposes.

Made available in DSpace on 2017-07-21T14:13:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Daniele Priscila.pdf: 2574355 bytes, checksum: 6ecd817b9f806a21743e5671cf9f96c5 (MD5) Previous issue date: 2013-02-25 / Cutaneous aging is a complex biological phenomenon that depends on a number of intrinsic, responsible for chronological aging and the extrinsic factors, which is responsible for cutaneous photo aging. Another important factor that must be taken into account is the appearance of wrinkles caused by repeated movements of the facial muscles. Currently there is a huge demand for anti-aging products and one of the strategies that is most commonly employed for this end, is the application of botulinum toxin Type A which is regarded as the principal treatment for the mitigation of wrinkles. Another active substance which functions in the same way as botulinum toxin A, is acetyl hexapeptide-3, which is marketed under the name of Argireline. This anti-aging agent acts in a similar way to botulinum toxin by smoothing out the expressive lines and wrinkles caused by repeated movements. Both the active agents are responsible for the release of acetylcholine at the neuromuscular junction. One of the main differences between these active agents is in their form of application since, whereas botulinum toxin A is administered by injection, acetyl hexapeptide-3 is used in the form of a cream for topical application. Given the fact that the two active agents are hydrophilic neuropeptides of high molecular mass, their ability to penetrate the skin is improbable. Thus, the purpose of this study was to develop, characterize and evaluate systems comprising nanocarriers that are able to allow or improve the permeation of these active agents through the skin. Acetyl hexapeptide-3 was encapsulated in liposomes and botulinum toxin was encapsulated through two systems, liposomes and polymeric nanoparticles. The evaluation of the acetyl-hexapeptide-3 showed an encapsulation efficiency of 95%. The vesicles showed a zeta potential of -31 mV. The results demonstrated that the active agent had a good cutaneous permeation and its encapsulation did not affect the permeation through the skin. The botulinum toxin Type A were successfully encapsulated into nanoparticles by multiple emulsion method and solvent evaporation. The nanoparticles had an average size of approximately 570 nm and a zeta potential of -7,40 mV, which is characteristic of the polyester used. The multilamellar liposomes were obtained through a method that involved hydrating the lipid film and showed an average size of approximately 1370 nm and a zeta potential of -37 mV. It was possible to demonstrate by means of infrared fourier transform spectroscopy, the presence of botulinum toxin Type A in the polymeric nanoparticles and the liposomes. The in vitro assays that were carried out suggested that the liposomes that contained the botulinum toxin Type A had an effect on the neurotransmitters in the assays that were conducted, whereas it was not possible to identify the same effect in the nanoparticles that contained the botulinum toxin.These results showed that the encapsulation of botulinum toxin A can be an alternative for the topical application of botulinum toxin Type A in a non-invasive way and with a good deal of comfort to the patient. With regard to acetyl hexapeptide-3, it can be claimed that this active agent when released shows the same degree of penetration through the skin as the encapsulated active agent. This suggests that the penetration of acetyl hexapeptide-3 does not undergo any alteration when encapsulated in liposomes. Thus, the active agent can be applied topically in this way. / O envelhecimento cutâneo é um fenômeno biológico complexo que depende da combinação de fatores intrínsecos, responsáveis pelo envelhecimento cronológico e extrínsecos, responsáveis pelo fotoenvelhecimento cutâneo. Outro fator importante a ser considerado é o aparecimento de rugas causadas pelos movimentos faciais repetitivos. Atualmente é grande a procura por produtos antienvelhecimento e, uma das estratégias mais empregada para esse fim é a aplicação da toxina botulínica do tipo A, que é considerada a principal atenuante de rugas. Outro ativo empregado com a mesma função da toxina botulínica é o acetil hexapeptídeo-3, comercialmente conhecido como Argireline. Este agente antienvelhecimento age de forma similar à toxina botulínica, reduzindo as linhas e rugas de expressão, ambos atuam na liberação da acetilcolina na junção neuromuscular. Uma das principais diferenças entre esses ativos está em sua forma de aplicação, enquanto a toxina botulínica é aplicada por meio de injeções intramusculares, o acetil hexapeptídeo-3 é empregado na forma de creme para aplicação tópica. Considerando que os dois ativos são neuropeptídios hidrofílicos de elevada massa molar, sua penetração através da pele é improvável. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver, caracterizar e avaliar sistemas constituídos por nanocarreadores capazes de permitir ou melhorar a permeação destes ativos através da pele. O acetil hexapeptídeo-3 foi encapsulado em lipossomas e a toxina botulínica foi encapsulada em dois sistemas, lipossomas e nanopartículas poliméricas. A avaliação do acetil exapeptídeo-3 mostrou uma eficiência de encapsulação de 95%. As vesículas apresentaram um potencial zeta de -31 mV. Os resultados demonstraram que o ativo apresentou boa permeação cutânea e sua encapsulação não afetou a permeação através da pele. A toxina botulínica foi encapsulada com sucesso em nanopartículas poliméricas, pelo método de emulsão múltipla e evaporação do solvente. As nanopartículas apresentaram tamanho médio de aproximadamente 570 nm e potencial zeta de –7,40 mV, característico do poliéster utilizado. Os lipossomas multilamelares obtidos por hidratação do filme lipídico apresentaram diâmetro médio de aproximadamente 1370 nm e potencial zeta de -37mV. Foi possível demonstrar, por meio dos espectros de infravermelho com Transformada de Fourier, a presença da toxina botulínica tipo A nas nanopartículas poliméricas e nos lipossomas. Os ensaios realizados in vitro indicaram que os lipossomas contendo a toxina botulínica tipo A apresentaram efeito sobre os neurotransmissores nos ensaios realizados, entretanto não foi possível identificar o mesmo efeito nas nanopartículas contendo a toxina botulínica. Esses resultados mostraram que a encapsulação da toxina botulínica A pode ser uma alternativa para sua aplicação tópica, de forma não invasiva e com muito conforto ao paciente. Quanto ao acetil hexapeptídeo-3, pôde-se constatar que este ativo na forma livre apresentou a mesma penetração através da pele do que o ativo encapsulado, o que indica que a penetração do acetil hexapeptídeo-3 não sofre alteração quando encapsulado em lipossomas. Desta forma o ativo pode ser aplicado de forma direta.

La chymosine, enzyme utilisée dans l´industrie fromagère pour coaguler le lait, est traditionnellement extraite à partir du quatrième estomac de veaux non sevrés. La préparation ainsi obtenue dénommée présure a été depuis un certain nombre d´années substituée par divers coagulants d´origine microbienne et de plantes car la production de cette enzyme seule n´était plus capable de répondre à la demande mondiale du fait notamment de l´augmentation de la production fromagère. La chymosine est cependant toujours considérée comme étant la meilleure enzyme pour coaguler le lait dans l´industrie fromagère. Ainsi, les techniques d´ingénierie génétique ont été utilisées pour produire de la chymosine bovine recombinante. C´est en utilisant ces techniques que nous proposons d´établir un procédé de production de chymosine bovine recombinante permettant l'innovation technologique et contribuant au maintien et au développement d'entreprises agro-alimentaires brésiliennes et des pays du Marché Economique du « Cone Sul » (MercoSul).<br />Nous avons ainsi cloné les séquences codant la préprochymosine A et la préprochymosine B à l'aide des techniques classiques de biologie moléculaire. Nous avons observé la présence de mutations dans la partie du propeptide de la prochymosine A et dans la partie mature de la prochymosine B. Cette dernière mutation, S79N, se situe dans la partie du tampon (résidus 72 à 86) qui constitue une anse externe mobile recouvrant le sillon du site actif. La conformation de ce tampon est caractéristique de la chymosine et serait en partie responsable pour sa grande spécificité. Nous avons modélisé cette mutation, qui semble entraîner des changements dans le réseau de liaisons hydrogène du tampon. Les séquences obtenues ont ainsi été introduites dans différents vecteurs d´expression puis clonées chez Escherichia coli et Pichia pastoris. L'expression des protéines a été suivie à l'aide d'anticorps spécifiques et au moyen de tests d'activité. Les différentes protéines sont toutes actives et ont été purifiées à l'homogénéité. Nous avons alors étudié leurs propriétés cinétiques à l'aide de différents substrats. Les chymosines B et BS79N ont un optimum de pH qui les différencie de la chymosine A. Le mutant B S79N a des propriétés cinétiques améliorées avec l´hexapeptide synthétique. La mutation S79N n´entraîne toutefois qu´une petite augmentation de la constante d´efficacité concernant les hydrolyses de la caséine Κ et du lait, bien que ses vitesses de réactions catalytiques soient supérieures à celles de la chymosine B. Ces résultats sont expliqués par les modifications dans le réseau de liaisons hydrogène du tampon, et par le fait que le nombre d'interactions entre le substrat et l'enzyme est une fonction de la masse moléculaire et de la nature du substrat.

O dimetilaminoetanol (DMAE) e o acetil hexapeptídeo-3 (AHP) vêm sendo utilizados em formulações dermocosméticas com finalidade antienvelhecimento. No entanto, há poucos trabalhos na literatura referentes aos efeitos dessas substâncias ativas no tecido cutâneo. Assim, o presente estudo tem por objetivos o desenvolvimento, a avaliação da estabilidade física, da segurança e da eficácia clínica de formulações dermocosméticas contendo DMAE e/ou AHP. Para tal, foram preparadas quatro formulações à base de ceras auto-emulsionantes compostas por álcool batílico e lecitina de soja ou ésteres de polietilenoglicol, estabilizadas por polímeros hidrofílicos (hidroxietilcelulose ou polímero de acrilato). Estas formulações foram acrescidas ou não (veículo) de 10% de uma solução a 0,05% de AHP e/ou de 9% de DMAE acetamidobenzoato e submetidas a testes preliminares de estabilidade. A seguir, foram realizados estudos de estabilidade por determinação do comportamento reológico, bem como uma análise sensorial. A formulação composta de ésteres de polietilenoglicol e polímero de acrilato (F4) apresentou melhor estabilidade e melhor sensorial e, assim, foi utilizada como veículo nos testes clínicos. Nesses testes avaliou-se a compatibilidade cutânea após uma única aplicação do produto na região das costas das voluntárias e a eficácia a curto (efeitos imediatos) e a longo prazo. Para a avaliação dos efeitos imediatos, analisou-se a hidratação, as propriedades viscoelásticas e o micro-relevo da pele da região ventral dos antebraços, após 2 horas da aplicação das formulações: veículo (F4) , veículo + DMAE (F4D), veículo + AHP (F4A) e veículo + DMAE + AHP (F4AD). Para analisar os efeitos a longo prazo, as voluntárias aplicaram as formulações diariamente nos antebraços e na face sendo que, após 2 e 4 semanas de tratamento, foram realizadas medidas dos parâmetros acima mencionados e das propriedades mecânicas da pele por determinação de suas características anisotrópicas. Os resultados obtidos no estudo clínico mostraram que todas as formulações estudadas apresentaram compatibilidade cutânea muito boa além de efeitos imediatos aumentando o conteúdo aquoso do estrato córneo. Por outro lado, observou-se que apenas as formulações que continham as substâncias ativas provocaram uma diminuição significativa da perda transepidérmica de água (TEWL), ou seja, mostraram efeito na melhoria da função barreira da pele. A longo prazo, observou-se que todas as formulações provocaram aumento do conteúdo aquoso do estrato córneo na face, o que não ocorreu para o antebraço. No entanto, somente as formulações que continham AHP reduziram a anisotropia da pele da face, ou seja, com o uso de tais formulações ocorreu uma melhora significativa das propriedades mecânicas da pele. Em síntese, de acordo com os dados obtidos, pode-se concluir que as formulações desenvolvidas apresentaram-se estáveis, seguras e eficazes, uma vez que não sofreram alterações em suas propriedades físico-químicas e não causaram irritação na pele. Além disso, as formulações que continham AHP ou DMAE apresentaram efeitos imediatos na diminuição da TEWL e as formulações acrescidas de AHP reduziram a anisotropia da pele após 4 semanas de aplicação, melhorando significativamente o tônus e a firmeza da pele. Assim, o AHP pode ser considerado uma substância eficaz para aplicação em formulações dermocosméticas com finalidade antienvelhecimento. / Dimethylaminoethanol (DMAE) and acetyl hexapeptide-3 (AHP) have been used in dermocosmetic formulations for anti-aging purposes. However, few scientific papers are concerned about the effects of these active substances on cutaneous tissue. Thus, the aim of the present study is the development, evaluation of physical stability, safety and clinical efficacy of dermocosmetic formulations containing DMAE and/or AHP. Four formulations based on self emulsifying wax containing batyl alcohol and lecithin or polyethyleneglycol ester, stabilized by hydrophilic polymers (hydroxyethylcellulose or acrylate polymer) were prepared as vehicles. They were supplemented or not with acetyl hexapeptide-3 solution (0.05%) and DMAE acetamidobenzoate to final concentrations of 10% and 9%, respectively, and submitted to preliminary stability tests, followed by the determination of rheological behavior, as well as, sensorial analysis. The formulation containing polyethyleneglycol ester and acrylate polymer (F4), chosen as vehicle for the clinical trials, showed the best stability and sensorial. In these trials, skin compatibility was evaluated after a single product application on the backs of volunteers, as well as, the short (immediate effects) and long term efficacy. To evaluate the immediate effects, skin hydration, viscoelastic properties and skin microrelief were tested in the ventral forearm region, 2 hours after application of the formulations: vehicle (F4), vehicle + DMAE (F4D), vehicle + AHP (F4A) and vehicle + DMAE + AHP (F4AD). Long term effects of the same formulations were evaluated in volunteers by daily applications on the forearm and face. After 2 and 4 weeks of treatment, the same parameters were measured in addition to the determination of skin mechanical properties by its anisotropic characteristics. The results obtained in the clinical study showed that all formulations tested had a very good skin compatibility besides an immediate effect of increasing the stratum corneum water content. On the other hand, only formulations containing the active substances produced a significant decrease in transepidermal water loss (TEWL), in other words, these formulations improved the skin barrier function. Long term studies demonstrated that all formulations promoted an enhancement of the stratum corneum water content when applied on the face but not in the forearm. However, only formulations containing AHP reduced skin anisotropy in the face, ie, there was a significant improvement of the skin mechanical properties due to the use of these formulations. In summary, according to the results obtained, it can be concluded that the developed formulations were stable, safe and effective, since they did not present alterations in their physicochemical properties and did not cause skin irritation. Moreover, the formulations containing AHP or DMAE presented immediate effects by reducing the TEWL and the ones supplemented with AHP reduced the skin anisotropy after 4 weeks of application, significantly improving the skin tone and firmness. Thus, it is suggested that AHP may be considered an effective substance to be used in cosmetic formulations with anti-aging purposes.

O objetivo desta pesquisa foi o desenvolvimento, avaliação da estabilidade e da eficácia de formulações cosméticas contendo acetil hexapeptídeo-3 (AHP) ou acetil tetrapeptídeo-5 (ATP) ou mistura de di e tripeptídeos (DTP). Para tal, foram desenvolvidas 6 formulações à base hidroxietilcelulose (HEC), metilfenil polissiloxano (MFP) e álcool batílico e lecitina de soja (ABL) (F1), ou de HEC, MFP, ésteres de polietilenoglicol com cadeia alquílica com 12 a 20 carbonos (EP) (F2), ou de polímero de acrilatos (PA), MFP e ABL (F3) ou de PA, MFP e EP (F4), ou de HEC e MFP (F5) ou de PA e MFP (F6), contendo ou não (veículo) 10% de AHP, ou 10% de ATP ou 4% de DTP, as quais foram submetidas a um estudo de estabilidade física por determinação da reologia e a uma avaliação sensorial. Para o estudo de eficácia dos peptídeos objeto de estudo as formulações foram aplicadas nos antebraços, na face, na região dos olhos e da boca de 60 voluntárias, sendo realizadas medidas do conteúdo aquoso do estrato córneo, da perda de água transepidérmica (TEWL), do micro-relevo cutâneo e das propriedades mecânicas da pele (anisotropia), antes (basal), após 2 horas da aplicação única (efeitos imediatos) e após 15 e 30 dias de uso contínuo (efeitos a longo prazo) das formulações. Os dados foram analisados estatisticamente pelo teste paramétrico análise de variância. Nos testes de estabilidade física, as formulações de nos 1, 2 e 5 foram consideradas as mais estáveis e as formulações de nº 5 e 6 foram as que apresentaram melhor sensorial, sendo, portanto, selecionada a formulação de nº 5 como veículo para os estudos de eficácia. Na avaliação dos efeitos imediatos na pele, observou-se que as formulações estudadas proporcionaram um aumento significativo no conteúdo aquoso do estrato córneo dos antebraços, enquanto que, somente as formulações acrescidas dos peptídeos provocaram um aumento significativo neste conteúdo na face. Em relação ao micro-relevo cutâneo, as formulações contendo ou não os peptídeos provocaram uma redução do parâmetro Ser (aspereza da pele) e Rt (rugosidade) nos antebraços e a formulação contendo DTP provocou um efeito imediato significativo no parâmetro Sesm (textura da pele). Na avaliação dos efeitos a longo prazo, as formulações ocasionaram uma diminuição significativa na TEWL e as acrescidas dos peptídeos objetos de estudo proporcionaram um aumento significativo no conteúdo aquoso do estrato córneo na região dos olhos, enquanto que nos antebraços e na região da boca todas as formulações acrescidas ou não dos peptídeos ocasionaram um aumento nesse parâmetro. Em relação ao micro-relevo cutâneo, a aplicação das formulações contendo os peptídeos, na região da boca, provocou um aumento significativo nos valores de Sesm. A aplicação das formulações contendo os peptídeos objeto de estudo, nos antebraços ocasionou uma diminuição significativa da anisotropia da pele. A formulação nº 5 contendo os peptídeos objeto de estudo, apresentou efeitos imediatos na hidratação, aspereza, rugosidade e textura da pele e, efeitos a longo prazo, na hidratação, textura e anisotropia da pele, mostrando a importância do emprego destes peptídeos em produtos cosméticos com finalidades hidratantes e antienvelhecimento. / The aim of this study was the development, evaluation of the stability and the efficacy of cosmetic formulations containing acetyl hexapeptide-3 (AHP), or acetyl tetrapeptide-5 (ATP) or mixture of di- and peptides (DTP). For this purpose the 6 following formulations (F) were developed: F1- containing hydroxyethyl cellulose (HEC), methylphenyl polysiloxane (MPPS), batyl alcohol, and lecithin (BAL); F2- HEC, MPPS and C12-C20 PEG-8 alkyl ester (AE); F3- acrylate copolymer (AC), MPPS and BAL; F4- AC, MPPS and AE; F5- HEC and MPPS and F6- AC and MPPS, which were supplemented or not (vehicle) with 10% of AHP or 10% of ATP or 4% of DTP and submitted to the evaluation of physical stability by the determination of the rheologic behavior and also to the sensorial analysis. For clinical efficacy studies, formulations were applied to the volar forearm and to the face skin (eye corner and cheek region), of 60 female volunteers. Skin conditions in terms of skin moisture, transepidermal water loss (TEWL), skin mechanical properties (anisotropy) and skin microrelief, before and after 2 hours (immediate effects) and after 15 and 30-day period of daily application (long term effects). Results obtained were statistically analyzed using the ANOVA parametric test. In the rheological study, the formulations number 1, 2, and 5 were considered more stable than the others. Moreover, the formulations number 5 and 6 showed the best sensorial attributes, and for this reason the formulation number 5 was selected for the efficacy study. The evaluation of immediate effects of formulations showed that the application of the formulations studied in the volar forearm increased the water content of the stratum corneum, while only the formulations containing the peptides provoked an increased in this content, when face skin was analyzed. When the volar forearm skin microrelief was analyzed, the application of all the formulations studied provoked a significant decrease in skin roughness (Ser) and depth of roughness (Rt), furthermore only the formulation supplemented with the DTP showed a significant increase in the skin smoothness (Sesm). In the evaluation of long term effects, all formulations provoked a significant reduction in TEWL values and the formulations containing the peptides studied provoked a significant increase in the water content of the stratum corneum of eye corner; when the volar forearms and the cheek region were analyzed, all the formulations containing or not the peptides studied, provoked an increase in this parameter. When the skin microrelief was analyzed, only the formulation supplemented with AHP or ATP or DTP, provoked a significant increase in the skin smoothness (Sesm), when applied in the cheek region. The application of formulations containing the peptides studied in the volar forearms provoked a significant decrease in the skin anisotropy. The formulation nº 5 (F5) containing the peptides studied, showed immediate effects on skin hydration, roughness and smoothness, and also long-term effects on skin hydration, smoothness and mechanical properties, which demonstrated the importance of the use of these peptides in cosmetic formulations with hydration and anti-aging purposes.

Mass spectrometry is a versatile, sensitive and fast technique with which to probe biophysical properties in biological systems and one of the most important analytical tools in the multidisciplinary field of proteomics. The study of nativestate proteins and their complexes in the gas-phase is well established and direct infusion electrospray ionisation mass spectrometry (DI-ESI-MS) techniques are becoming increasingly popular as a tool for screening and determining quantitative information on protein-protein and protein-ligand interactions. However, complexes retained by ESI-MS are not always representative of those in solution and care must be taken in interpreting purely gas-phase results. This thesis details modification and advancement of solution phase techniques devised by Gross et al. utilising ESI-MS and Fitzgerald et al. applying matrix assisted laser desorption ionisation (MALDI)-MS termed PLIMSTEX (protein-ligand interactions by mass spectrometry, titration and hydrogen-deuterium-exchange)[1] and SUPREX (Stability of unpurified proteins from rates of H/D exchange)[2] to quantify these interactions with regards to high throughput analysis. The first part of this thesis describes the different developmental stages of the devised HPLC-front ends and their optimisation with myoglobin and insulin. The successfully developed HPLC-front end in conjunction with PLIMSTEX and SUPREX and ESI-MS then gets tested with self expressed and purified cyclophilin A(CypA)- cyclosporin A (CsA) system, followed by a test screen with potential CypA binding ligands. Dissociation constants (Kd’s) within one order of magnitude to reported values are determined. In the third part of this thesis the application of the devised ESI-SUPREX methodology has been applied to anterior gradient 2 (AGr2) and the factor H complement control proteins module 19-20 (fH19-20) exhibiting binding potential to a taggedhexapeptide and a synthetic pentasaccharide, respectively, resulting in thermodynamical data for these protein-ligand interactions. For the AGr2 system another dimension of investigation has been added by temperature controlling the devised ESI-SUPREX approach, revealing a phase transition in the protein at higher temperatures. The final part of this thesis describes the application of the ESI-SUPREX methodology to probe folding properties of CypA in the presence of the self expressed and purified E. coli chaperonin groEL. Thereby the denaturing properties of groEL have been emphasised along with the stabilisation of a denatured CypA species.

O objetivo desta pesquisa foi o desenvolvimento, avaliação da estabilidade e da eficácia de formulações cosméticas contendo acetil hexapeptídeo-3 (AHP) ou acetil tetrapeptídeo-5 (ATP) ou mistura de di e tripeptídeos (DTP). Para tal, foram desenvolvidas 6 formulações à base hidroxietilcelulose (HEC), metilfenil polissiloxano (MFP) e álcool batílico e lecitina de soja (ABL) (F1), ou de HEC, MFP, ésteres de polietilenoglicol com cadeia alquílica com 12 a 20 carbonos (EP) (F2), ou de polímero de acrilatos (PA), MFP e ABL (F3) ou de PA, MFP e EP (F4), ou de HEC e MFP (F5) ou de PA e MFP (F6), contendo ou não (veículo) 10% de AHP, ou 10% de ATP ou 4% de DTP, as quais foram submetidas a um estudo de estabilidade física por determinação da reologia e a uma avaliação sensorial. Para o estudo de eficácia dos peptídeos objeto de estudo as formulações foram aplicadas nos antebraços, na face, na região dos olhos e da boca de 60 voluntárias, sendo realizadas medidas do conteúdo aquoso do estrato córneo, da perda de água transepidérmica (TEWL), do micro-relevo cutâneo e das propriedades mecânicas da pele (anisotropia), antes (basal), após 2 horas da aplicação única (efeitos imediatos) e após 15 e 30 dias de uso contínuo (efeitos a longo prazo) das formulações. Os dados foram analisados estatisticamente pelo teste paramétrico análise de variância. Nos testes de estabilidade física, as formulações de nos 1, 2 e 5 foram consideradas as mais estáveis e as formulações de nº 5 e 6 foram as que apresentaram melhor sensorial, sendo, portanto, selecionada a formulação de nº 5 como veículo para os estudos de eficácia. Na avaliação dos efeitos imediatos na pele, observou-se que as formulações estudadas proporcionaram um aumento significativo no conteúdo aquoso do estrato córneo dos antebraços, enquanto que, somente as formulações acrescidas dos peptídeos provocaram um aumento significativo neste conteúdo na face. Em relação ao micro-relevo cutâneo, as formulações contendo ou não os peptídeos provocaram uma redução do parâmetro Ser (aspereza da pele) e Rt (rugosidade) nos antebraços e a formulação contendo DTP provocou um efeito imediato significativo no parâmetro Sesm (textura da pele). Na avaliação dos efeitos a longo prazo, as formulações ocasionaram uma diminuição significativa na TEWL e as acrescidas dos peptídeos objetos de estudo proporcionaram um aumento significativo no conteúdo aquoso do estrato córneo na região dos olhos, enquanto que nos antebraços e na região da boca todas as formulações acrescidas ou não dos peptídeos ocasionaram um aumento nesse parâmetro. Em relação ao micro-relevo cutâneo, a aplicação das formulações contendo os peptídeos, na região da boca, provocou um aumento significativo nos valores de Sesm. A aplicação das formulações contendo os peptídeos objeto de estudo, nos antebraços ocasionou uma diminuição significativa da anisotropia da pele. A formulação nº 5 contendo os peptídeos objeto de estudo, apresentou efeitos imediatos na hidratação, aspereza, rugosidade e textura da pele e, efeitos a longo prazo, na hidratação, textura e anisotropia da pele, mostrando a importância do emprego destes peptídeos em produtos cosméticos com finalidades hidratantes e antienvelhecimento. / The aim of this study was the development, evaluation of the stability and the efficacy of cosmetic formulations containing acetyl hexapeptide-3 (AHP), or acetyl tetrapeptide-5 (ATP) or mixture of di- and peptides (DTP). For this purpose the 6 following formulations (F) were developed: F1- containing hydroxyethyl cellulose (HEC), methylphenyl polysiloxane (MPPS), batyl alcohol, and lecithin (BAL); F2- HEC, MPPS and C12-C20 PEG-8 alkyl ester (AE); F3- acrylate copolymer (AC), MPPS and BAL; F4- AC, MPPS and AE; F5- HEC and MPPS and F6- AC and MPPS, which were supplemented or not (vehicle) with 10% of AHP or 10% of ATP or 4% of DTP and submitted to the evaluation of physical stability by the determination of the rheologic behavior and also to the sensorial analysis. For clinical efficacy studies, formulations were applied to the volar forearm and to the face skin (eye corner and cheek region), of 60 female volunteers. Skin conditions in terms of skin moisture, transepidermal water loss (TEWL), skin mechanical properties (anisotropy) and skin microrelief, before and after 2 hours (immediate effects) and after 15 and 30-day period of daily application (long term effects). Results obtained were statistically analyzed using the ANOVA parametric test. In the rheological study, the formulations number 1, 2, and 5 were considered more stable than the others. Moreover, the formulations number 5 and 6 showed the best sensorial attributes, and for this reason the formulation number 5 was selected for the efficacy study. The evaluation of immediate effects of formulations showed that the application of the formulations studied in the volar forearm increased the water content of the stratum corneum, while only the formulations containing the peptides provoked an increased in this content, when face skin was analyzed. When the volar forearm skin microrelief was analyzed, the application of all the formulations studied provoked a significant decrease in skin roughness (Ser) and depth of roughness (Rt), furthermore only the formulation supplemented with the DTP showed a significant increase in the skin smoothness (Sesm). In the evaluation of long term effects, all formulations provoked a significant reduction in TEWL values and the formulations containing the peptides studied provoked a significant increase in the water content of the stratum corneum of eye corner; when the volar forearms and the cheek region were analyzed, all the formulations containing or not the peptides studied, provoked an increase in this parameter. When the skin microrelief was analyzed, only the formulation supplemented with AHP or ATP or DTP, provoked a significant increase in the skin smoothness (Sesm), when applied in the cheek region. The application of formulations containing the peptides studied in the volar forearms provoked a significant decrease in the skin anisotropy. The formulation nº 5 (F5) containing the peptides studied, showed immediate effects on skin hydration, roughness and smoothness, and also long-term effects on skin hydration, smoothness and mechanical properties, which demonstrated the importance of the use of these peptides in cosmetic formulations with hydration and anti-aging purposes.