Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-16T17:23:07Z No. of bitstreams: 1 2018_JuliaFreitasDaltroVidal.pdf: 3953556 bytes, checksum: c4aece9109c1c4294595a19546bc8714 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-20T20:21:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_JuliaFreitasDaltroVidal.pdf: 3953556 bytes, checksum: c4aece9109c1c4294595a19546bc8714 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-20T20:21:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_JuliaFreitasDaltroVidal.pdf: 3953556 bytes, checksum: c4aece9109c1c4294595a19546bc8714 (MD5) Previous issue date: 2018-07-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / As α2-macroglobulinas (A2M) são proteínas de alto peso molecular que atuam como inibidoras de amplo espectro de proteases. Essa inibição ocorre por meio de um mecanismo que envolve o aprisionamento físico da protease seguido pela formação de uma ligação covalente entre ambas as proteínas. A capacidade de captura das diversas classes de proteases poderia permitir sua utilização na identificação das mesmas em extratos celulares, podendo ser aplicada tanto na descoberta de novas proteases como na detecção de proteases alvo. Esse trabalho tem por objetivo caracterizar biofisicamente a α2-macroglobulina de Salmonella enterica e avaliar sua potencial utilização na identificação de proteases. A proteína foi expressa em E. coli BL21 (DE3) e purificada por cromatografia de afinidade a metal imobilizado (Ni2+), seguido por cromatografia de exclusão molecular. Foram realizados ensaios de dicroísmo circular a fim de verificar seu padrão de estrutura secundária em diferentes pH, bem como sua estabilidade térmica (25-95 ºC). Ensaios de fluorescência foram realizados com o intuito de analisar mudanças estruturais sofridas em uma ampla faixa de pH (3,5-9,0). Experimentos de ultracentrifugação analítica foram realizados a fim de compreender melhor a interação entre a A2M e a tripsina. Tanto a capacidade de ligar-se a proteases, como a habilidade em capturar proteases quando ligada em coluna foram testadas utilizando-se tripsina. Confirmadas tais capacidades, foram realizados testes com os extratos de Escherichia coli, Vigna unguiculata e Pichia pastoris a fim de detectar proteases ali presentes. As proteínas foram submetidas à proteólise e analisadas por espectrometria de massas. Houve mudanças no padrão de estrutura secundária quando a proteína foi submetida a pH ácidos e básicos (4,0 e 9,0) quando comparado ao pH próximo da neutralidade (7,5). Durante sua desnaturação térmica verificou-se que há agregação em temperaturas superiores a ~47ºC em todos os pH testados (4,0, 7,5 e 9,0), demostrando que a proteína não é estável termicamente. Foi observado que a proteína quando ligada à tripsina apresenta um padrão eletroforético e um perfil de eluição em gel filtração que indica a ocorrência de mudança conformacional. Entretanto, não foi obtido o mesmo resultado nos experimentos de ultracentrifugação analítica. A A2M aparenta formar dímeros, principalmente quando na presença da tripsina. Não houve a detecção de proteases nos testes com os extratos celulares testados. Contudo, tais testes devem ser aprimorados para um resultado mais confiável. / α2-macroglobulins (A2M) are high molecular weight proteins that act as broad spectrum peptidase inhibitors. The inhibition occurs by a mechanism that involves the capture of the peptidase followed by the formation of a covalent bond between the two proteins. The capture of all the peptidases classes could allow its utilization in the identification of these proteins in cellular extracts, being possibly applied in the discovery of new peptidases and in the detection of target peptidases. The aim of this work was the biophysical characterization of the α2-macroglobulin from Salmonella enterica and evaluation of its potential use in the identification of proteases. The recombinant A2M protein was expressed in E. coli BL21 (DE3) and purified by immobilized metal ion affinity chromatography followed by size exclusion chromatography. Circular dichroism assays were performed in order to verify the A2M secondary structure in different pH conditions, as well as its thermal stability in a temperature range of 25-95 ºC. Fluorescence spectroscopy assays were performed to analyze structural changes in a wide range of pH (3.5-9.0). The ability of A2M to bind peptidases and its capacity to capture peptidases when immobilized to a column were tested using trypsin. Once these abilities were confirmed, tests were carried out with extracts of Escherichia coli, Vigna unguiculata and Pichia pastoris in order to identify its captured peptidases. Proteins were hydrolyzed and analyzed by mass spectrometry. Analytical ultracentrifugation experiments were performed in order to better understand the interaction between A2M and trypsin. There were changes in the secondary structure when the protein was subjected to acid and basic pH (4.0 and 9.0) when compared to neutral pH (7.5). During its thermal denaturation it was found that there is aggregation at temperatures above ~ 47 ° C in all tested pH conditions (4.0, 7.5 and 9.0), showing that the protein is not thermally stable. It was verified that the protein when bound to trypsin has an electrophoretic migration and a gel filtration elution profile that indicates the occurrence of conformational change. However, the same result was not observed with the analytical ultracentrifugation experiments. A2M seems to form dimers, especially in the presence of trypsin. There was no detection of peptidase in the tests with the cell extracts. However, such tests must be improved for a more reliable result.

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-10-05T20:39:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Leydianne Leite de Siqueira Patriota Queiroz.pdf: 1890707 bytes, checksum: 03464b332cc53d519ebcbeca1662febe (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-11-14T20:11:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Leydianne Leite de Siqueira Patriota Queiroz.pdf: 1890707 bytes, checksum: 03464b332cc53d519ebcbeca1662febe (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-14T20:11:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Leydianne Leite de Siqueira Patriota Queiroz.pdf: 1890707 bytes, checksum: 03464b332cc53d519ebcbeca1662febe (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / CNPq / Microgramma vacciniifolia (Polypodiaceae, Pteridophyta) é uma planta epífita que possui propriedades medicinais, por exemplo, no tratamento de infecções respiratórias. Lectinas de origem vegetal são capazes de exercer ação imunomoduladora sobre células do sistema imune de mamíferos, através da interação com receptores de superfície celular. Esta dissertação descreve a purificação e caracterização de uma lectina a partir das frondes de M. vacciniifolia (MvFL), assim como a avaliação da sua toxicidade e efeito imunomodulador sobre células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) humano. Extrato proteico foi obtido por homogeneização do pó das frondes secas em NaCl 0,15 M (10%, p/v) por 16 h a 25ºC. MvFL foi isolada a partir do extrato através de cromatografia de gel filtração em coluna de Sephadex G-75 seguida de cromatografia de troca iônica utilizando a matriz DEAE-Sephadex A25. A homogeneidade de MvFL foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) em condições nativas para proteínas básicas ou ácidas. MvFL foi caracterizada quanto a especificidade de ligação a carboidratos, massa molecular nativa, ponto isoelétrico (pI), composição em subunidades, presença de glicosilação e similaridades na sua estrutura primária com outras proteínas vegetais. A estabilidade da lectina em diferentes valores de pH (3,0–9,0) e após aquecimento a diferentes temperaturas (30–100°C) foi avaliada por ensaio de hemaglutinação e espectrometria de fluorescência. Adicionalmente, MvFL foi avaliada quanto à atividade inibitória de tripsina. Citotoxicidade foi investigada através da avaliação da indução de apoptose/necrose em PBMCs tratados com MvFL (6,25–50μg/mL). A atividade imunomoduladora de MvFL (12,5 μg/mL) sobre PBMCs foi avaliada através da determinação dos níveis de citocinas, quimiocinas e óxido nítrico (NO). Diferenciação e ativação de células T também foram investigadas. MvFL foi isolada com elevada atividade hemaglutinante específica (10.240) e elevado fator de purificação (3.413). Ela foi revelada como uma glicoproteína de pI 4,51 e massa molecular nativa de 54 kDa, sendo composta por 3 subunidades distintas. Espectrometria de massas de peptídeos derivados da hidrólise de MvFL por tripsina revelou similaridades (cobertura de sequência de 32%) com a estrutura primária de uma proteína vegetal ligadora de RNA de Theobroma cacao. A atividade hemaglutinante da lectina foi inibida apenas por glicoproteínas (fetuína e ovoalbumina). O aquecimento de MvFL não afetou a atividade hemaglutinante nem promoveu desenovelamento da lectina. Tanto a atividade hemaglutinante quanto a conformação da lectina variaram dependendo do pH do meio, sendo MvFL menos ativa em pH alcalino. A lectina apresentou atividade inibidora de tripsina (3360,1 U/mg) e não apresentou toxicidade para PBMCs nas concentrações de 6,25 a 25 μg/mL. A lectina promoveu um aumento na produção de TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-10 e NO, bem como estimulou a diferenciação e ativação de linfócitos T CD8+. MvFL não alterou a produção das quimiocinas testadas. Em conclusão, as frondes de M. vacciniifolia contêm uma proteína termoestável e multifuncional, com atividades lectínicas e inibidora de tripsina, baixa toxicidade para linfócitos, ação imunomoduladora sobre PBMCs, induzindo predominantemente uma resposta Th1, e capaz de promover ativação e diferenciação de linfócitos humanos. / Microgramma vacciniifolia (Polypodiaceae, Pteridophyta) is an epiphytic plant that has medicinal properties, for example, in the treatment of respiratory infections. Lectins of plant origin are able to exert immunomodulatory action on cells from mammalian immune system by interacting with cell surface receptors. This work describes the purification and characterization of a lectin from the M. vacciniifolia fronds (MvFL), as well as the evaluation of its toxicity and immunomodulatory effect on human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Protein extract was obtained by homogenizing the powder of dried fronds in 0.15 M NaCl (10%, w/v) for 16 h at 25°C. MvFL was isolated from the extract by gel filtration chromatography on Sephadex G-75 column followed by ion exchange chromatography using the DEAE-Sephadex A25 matrix. The homogeneity of MvFL was evaluated by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) under native conditions for basic or acidic proteins. MvFL was characterized in terms of carbohydrate specificity, native molecular mass, isoelectric point (pI), subunit composition, presence of glycosylation and similarities in its primary structure with plant proteins. The stability of the lectin at different pH values (3.0-9.0) and after heating at different temperatures (30-100°C) was evaluated by hemagglutination assay and fluorescence spectrometry. Additionally, MvFL was evaluated for trypsin inhibitory activity. Cytotoxicity was investigated by evaluating the induction of apoptosis/necrosis in PBMCs treated with MvFL (6.25–50 μg/mL). Immunomodulatory activity of MvFL (12.5 μg/mL) on PBMCs was assessed by determining the levels of cytokines, chemokines and nitric oxide (NO). Differentiation and activation of T cells were also investigated. MvFL was isolated with high specific hemagglutinating activity (10,240) and purification factor (3,413). It was revealed as a glycoprotein with pI 4.51 and native molecular weight of 54 kDa, being composed of three distinct subunits. Mass spectrometry of peptides derived from the hydrolysis of MvFL by trypsin revealed similarities (32% sequence coverage) with the primary structure of a RNA-binding protein from Theobroma cacao. The hemagglutinating activity of MvFL was inhibited only by glycoproteins (fetuin and ovalbumin). Heating of MvFL did not affect hemagglutinating activity or promote lectin unfolding. Both the hemagglutinating activity and the conformation of the lectin varied depending on the pH of the medium, with MvFL being less active at alkaline pH. The lectin showed trypsin inhibitory activity (3,360.1 U/mg) and no toxicity to PBMCs at concentrations of 6.25 to 25 μg/mL. The lectin promoted an increase in the production of TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-10 and NO, as well as stimulated the differentiation and activation of T CD8+ lymphocytes. MvFL did not alter the production of the chemokines tested. In conclusion, the fronds of M. vacciniifolia contain a thermostable and multifunctional protein with lectin and trypsin inhibitor activities, low toxicity to lymphocytes, immunomodulatory action on PBMCs, inducing predominantly a Th1 response, as well as able to promote differentiation and activation of human lymphocytes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-05-13T13:13:32Z No. of bitstreams: 1 2016_DiegoEliasHonda.pdf: 2169221 bytes, checksum: 3f749f9435181b7433ed52f969f2025d (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-20T21:34:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DiegoEliasHonda.pdf: 2169221 bytes, checksum: 3f749f9435181b7433ed52f969f2025d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-20T21:34:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_DiegoEliasHonda.pdf: 2169221 bytes, checksum: 3f749f9435181b7433ed52f969f2025d (MD5) / O inibidor de serinoproteases da família Bowman-Birk Black eyed-pea Trypsin/Chymotrypsin Inhibitor (BTCI), encontrado em grãos de feijão de corda Vigna unguiculata, é uma proteína com enorme potencial biotecnológico, sendo destacado seu aspecto farmacológico. Sua estrutura possuí sete ligações dissulfeto que estendem sua ação a condições mais extremas de temperatura e pH. Toda sua aplicabilidade decorre do fato de inibir as enzimas tripsina e quimotripsina. Neste trabalho, buscou-se encontrar metodologia semi-empírica que fosse capaz de extrair informações químicas sobre o processo inibitório que ocorre entre o BTCI e a tripsina, bem como a construção de um sistema que permita um olhar mais detalhado sobre os fenômenos que ocorrem na interface entre o inibidor e a enzima a ser inibida. Neste sentido, as propriedades avaliadas foram os orbitais de fronteira e seus quatro vizinhos imediatos. Não obstante, também foi mensurada a força de cada uma das sete ligações dissulfeto. Observou-se que, para o estudo do BTCI no vácuo, diferentes metodologias semi-empíricas forneceram resultados adversos. Conclusão semelhante foi observada para o caso do BTCI complexado com a tripsina. Todavia, quando se analisou a interface entre essas duas proteínas, os métodos em questão tiveram grande correspondência entre si, indicando que a Cys22 é um dos resíduos mais importantes na interface, provavelmente ajudando a manter a conformação durante o processo de ancoragem. Quanto às ligações dissulfeto, não foi possível afirmar sobre qual delas maior impacta a estrutura do BTCI. Contudo, verificou-se que as ligações entre os resíduos Cys34 e Cys19, e Cys61 e Cys46 foram as de menor contribuição energética. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Bowman-Birk Trypsin/Chymotrypsin inhibitor from Vigna unguiculata seeds (BTCI) is a protein with high biotechnological potential, especially due to its pharmacological aspects. Its structure has seven disulfide bonds which extends BTCI working range to some severe temperature and pH conditions. All BTCI applicability is due to its trypsin and chymotrypsin inhibition. This way, we tried to find some semi-empirical methodology capable to give chemical information about the inhibition process between BTCI and trypsin, as well as to construct a system that allows a closer look about what happens within those proteins interface. To accomplish this objective, we looked to the frontier orbitals and their four immediate neighbors. Likewise, each of its seven disulfide bonds had their energy determined. We conclude that the study of BTCI in vacuum with different methodologies give different results. Similar conclusion was seen for BTCI complexed with trypsin. However, when we analyzed the interface between those two proteins all methods are in agreement, pointing that Cys22 is responsible to maintain the interface conformation during the enzyme-inhibitor docking. About the disulfide bonds, it wasn’t possible to confirm which one has the greatest impact on BTCI structure. Nevertheless, we saw that bonds between Cys34 and Cys19, and Cys61 and Cys46 residues had the lowest energy contribution.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:50:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Inibidores de protease são moléculas que têm a capacidade de controlar proteases por bloqueio da atividade catalítica. As proteases participam de importantes eventos fisiológicos tais como a digestão dos alimentos, coagulação sangüínea, e apoptose. A ação dos inibidores é essencial para garantir a homeostase. Artrópodes como insetos e aracnídeos são ricas fontes desses inibidores. O objetivo desse trabalho foi isolar inibidores de proteases presentes na hemolinfa da aranha Lasiodora sp. Hemolinfa foi coletada através de punção cardíaca na presença de anticoagulante. Após centrifugação (800g) o plasma foi separado e utilizado para a detecção de inibidor de tripsina, trombina, fator Xa e XIIa. Cromatografia de afinidade em tripsina-Sepharose resultou no inibidor purificado, porém sem atividade inibitória. Isolamento do inibidor de tripsina foi realizado por cromatografia em coluna de Sephadex G-100 e a preparação contendo atividade inibitória de tripsina foi denominada: inibidor de tripsina bruto. Cromatografia em Mono Q isolou a partir do inibidor de tripsina bruto, o inibidor de tripsina LPTI (do inglês Lasiodora plasma trypsin inhibitor) e uma proteína anticoagulante LPA (do inglês Lasiodora plasma anti-coagulant). Eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de sulfato sódico de dodecila revelou massa molecular de 72 kDa para LPTI e LPA. Avaliação de atividade inibitória sobre proteases e do efeito na coagulação através de determinação do tempo de recalcificação, tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) revelou que LPTI não interfere na coagulação e LPA, sem atividade inibitória de tripsina, interfere no TTPA. De acordo com nosso conhecimento LPTI e LPA correspondem ao primeiro inibidor de tripsina e a primeira proteína anticoagulante isolados da hemolinfa de aranha. LPTI e LPA podem participar no mecanismo de coagulação da hemolinfa através do controle da produção da protease fenoloxidase, que dispara a cascata, e do controle da atividade de proteases da cascata de coagulação

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:04:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8959_1.pdf: 3211666 bytes, checksum: f74a515847685e5e6593e1aa3f8276e7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 1998 / Neste trabalho foram investigadas, em ratos, as repercussões do tratamento com inibidor seletivo de serotonina (ISRS) sobre a ontogênese de reflexos, a maturação somática e sensório-motora e o consumo alimentar no animal adulto. Para isso, ratos Wistar machos foram divididos em grupos recebendo diariamente, do 1o ao 21o dia de vida os seguintes tratamentos s.c. Ingênuo (Ing; n=26), sem tratamento; Salina (Sal; n=24), NaCl a 0,9% (2ml/kg) e; citalopram (Cit) nas doses: 5 mg/kg (Cit5, n=10); 10 mg/kg (Cit10, n=10), ou 20 mg/kg (Cit20, n=26). Foram realizadas diariamente, do 1o ao 21o e, a cada 3 dias, do 24o ao 60o dia pós-natal, as seguintes avaliações murinométricas: peso corporal (PC), comprimento da cauda (CC), eixos do crânio látero-lateral e ântero-posterior (ELLC e EAPC). Registrou-se o dia de aparecimento das seguintes características físicas: abertura do pavilhão auditivo (APA), abertura do conduto auditivo (ACA), irrupção dos incisivos (III) e abertura dos olhos (AO). Foram avaliados diariamente os seguintes reflexos: preensão palmar (PP), aversão ao precipício (AP), geotaxia negativa (GN), resposta ao susto (RS), colocação pelas vibrissas (CV), aceleração (A). Aos 70-80 dias de idade, os animais foram submetidos, durante 7 dias, a estudo de consumo alimentar, através da avaliação de parâmetros, tais como: peso corporal absoluto (PCA), variação do peso absoluto e relativo (VPA; VPR), consumo alimentar absoluto e relativo (CAA; CAR), consumo hídrico absoluto e relativo (CHA; CHR), excreção fecal absoluta e relativa (EFA; EFR), excreção urinária absoluta e relativa (EUR; EUA) e a razão CHA/EUA. Após sacrifício (110-120 dias de idade), foi realizado estudo dos órgãos, obtendo-se os seguintes parâmetros de peso: do encéfalo, úmido absoluto e relativo (PEUA; PEUR), seco absoluto e relativo (PESA; PESR); do cerebelo, úmido absoluto e relativo (PCUA; PCUR), seco absoluto e relativo (PCSA; PCSR); do fígado, úmido absoluto e relativo (PFUA; PFSR), seco absoluto e relativo (PFSA; PFSR). Utilizou-se para a análise estatística, ANOVA seguido do teste de Tukey para dados paramétricos, Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney para dados não paramétricos. Não houve diferença entre Ing e Sal em todos os parâmetros analisados; o grupo salina foi então escolhido como controle. Avaliações murinométricas Comparado ao Sal, durante o aleitamento, houve redução (p<0,01): do PC de Cit10, a partir do 15o dia, e de Cit20, a partir do 6o dia; do CC de Cit20, a partir do 9o dia; do ELLC de Cit10, a partir do 15o dia, e de Cit20, a partir do 9o dia; do EAPC de Cit20, a partir do 15o dia. Durante o período do 24o ao 60o dia pós-natal, quando comparados ao Sal, houve redução (p<0,01): do PC de Cit10, do 48o ao 60o dia, e de Cit20, do 24o ao 60o dia; do CC de Cit20 a partir do 24o dia; do ELLC de Cit10, do 24o ao 44o dia; e de Cit20 do 24o ao 60o; do EAPC de Cit20 do 34o ao 60o dia. Entretanto, o PC de Cit5 foi maior do que o do Sal do 45o ao 60o dia de vida. Maturação de características físicas Comparados ao Sal, houve retardo em: ACA em Cit5 e Cit20 (p<0,05) e; a III atrasou em Cit5 e Cit10 (p<0,05). Desenvolvimento sensório-motor Comparados a Sal houve retardo (p<0,01): de PP, RD, CV e A em todos os grupos tratados com Cit; de RS, no Cit5, Cit10 e Cit20; de AP no Cit20; de GN no Cit5, Cit10 e Cit20. Consumo alimentar Comparados ao grupo Sal houve redução (p<0,01): do PCA no Cit20; CAA no Cit5, Cit10 e Cit20; do CHA no cit10 e no Cit20; da EFA no Cit 10 e Cit20; da EUA em Cit20. Todavia, comparado ao Sal, houve aumento (p<0,01) do CHR e do CHA/EUA no Cit20. Não houve diferenças da VPA; da VPR, do CAR e da EFR de cada um dos grupos comparados ao Sal. Peso dos órgãos Comparados ao Sal, houve redução (p<0,01): do peso encefálico úmido absoluto(PEUA), do peso do encéfalo seco absoluto (PESA) e do peso do cerebelo úmido absoluto (PCUA) em Cit20. Entretanto, o peso do encéfalo seco relativo (PESR) e o peso do encéfalo úmido relativo (PEUR) foram maiores no Cit20 comparado a Sal. Quanto ao fígado, comparados ao grupo Sal demonstraram redução: do peso do fígado úmido absoluto (PFUA), o Cit10 e o Cit20; do peso do fígado seco absoluto (PFSA) o Cit10 e o Cit20. O tratamento crônico com ISRS, durante o aleitamento, retarda a ontogênese de reflexos e altera a maturação somática em ratos. Além disso, é observada também alteração da evolução ponderal até a idade adulta. Nesta fase seqüelas observadas no peso corporal e nos pesos de órgãos parecem também estar associadas à manipulação do sistema serotoninérgico. Entretanto, não se descarta aqui efeitos inespecíficos do ISRS empregado. Na dose adulta foram registradas alterações de alguns parâmetros do consumo alimentar. As alterações encontradas se manifestam de maneira distinta, na dependência da dose empregada. Isto sugere a participação de diferentes tipos de receptores serotoninérgicos. Estudos envolvendo manipulação farmacológica com agonistas ou antagonistas serotoninérgicos específicos ainda são necessários. Contudo, os resultados parecem confirmar o papel importante do sistema da 5-HT no desenvolvimento somático e sensório-motor e no padrão adulto do consumo alimentar

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:04:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8848_1.pdf: 285703 bytes, checksum: c142fb2ad0d7c70ffaedb20c6718a038 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / A serotonina (5-Hidroxitriptamina) é uma amina biogênica que exerce inúmeros papéis regulando e modulando a morfogênese da cabeça e pescoço. O objetivo deste trabalho foi estudar a morfologia e as possíveis alterações morfométricas nas glândulas submandibulares em ratos tratados com inibidores seletivos de recapturas da serotonina - ISRS no período de 22 e 75 dias. Ratos Wistar foram separados desde o nascimento até 21° dia em quatro grupos: Grupos experimentais (GE) submetidos diariamente à ingestão de fluoxetina (10&#956;g/g de peso) e Grupos Controles (GC) que ingeriram solução salina (0,9% de NaCl) por via subcutânea. Ambos os grupos foram sacrificados em dois períodos: o 22o (GE-22 e GC-22) e o 75o (GE-75 e CG-75) dias de vida, para que fossem retiradas as glândulas submandibulares e obter cortes histológicos corados em HE. Áreas e diâmetros médio dos ácinos e dos ductos foram avaliados através da análise morfométrica, observando-se que entre os períodos estudados, o peso corporal médio entre os grupos exibiu diferença estatisticamente significante (p<0,05), sendo o GE 75 menor quando comparado ao seu controle; não houve diferença estatisticamente significante entre o peso médio das glândulas esquerda e direita em nenhum dos grupos, exceto quando se comparou isoladamente as glândulas esquerda ou direita entre os grupos estudados, observando-se uma diferença estatística entre os grupos com 75 dias de tratamento. Não foram observadas diferenças significantes entre a área e o perímetro dos ductos ou dos ácinos quando comparadas à lateralidade das glândulas, porém, quando se comparou o GE22 com o GC22, constatou-se que houve uma redução significante (p< 0,05) na área e perímetro dos ductos estriados nos animais tratados com fluoxetina. Analisando os ácinos glandulares aos 22 dias, verificou-se que não houve diferenças estatisticamente significantes, porém, observou-se uma importante redução (p< 0,05) da área e perímetro médios dos ductos estriados e dos ácinos glandulares no GE 75 quando comparado ao GC 75

OLIVEIRA, A. S de. Purificação e caracterização de inibidores de tripsina de sementes de Pithecellobium dumosun e seus efeitos. 222 f. 2007. Tese (Doutorado em Bioquímica)- Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2007. / Submitted by Aline Nascimento (vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T17:10:50Z No. of bitstreams: 1 2007_tes_asdeoliveira.pdf: 3337963 bytes, checksum: d6b49c9e4081b7dc7967d8be3fb8d65b (MD5) / Rejected by Aline Nascimento(vieiraaline@yahoo.com.br), reason: descrição on 2013-05-20T19:18:25Z (GMT) / Submitted by Aline Nascimento (vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T19:18:50Z No. of bitstreams: 1 2007_tes_asdeoliveira.pdf: 3337963 bytes, checksum: d6b49c9e4081b7dc7967d8be3fb8d65b (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Nascimento(vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T19:19:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_tes_asdeoliveira.pdf: 3337963 bytes, checksum: d6b49c9e4081b7dc7967d8be3fb8d65b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-20T19:19:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_tes_asdeoliveira.pdf: 3337963 bytes, checksum: d6b49c9e4081b7dc7967d8be3fb8d65b (MD5) Previous issue date: 2007 / Five Kunitz-type trypsin inhibitors (JB1, JB2, JB3-1, JB3-2 and JB4) were purified from Pithecellobium dumosum seeds, a tree of the sub-family Mimosoideae, by TCA precipitation, affinity chromatography on immobilized trypsin-Sepharose and reverse phase HPLC using Vydac C-18 column. The five inhibitors had Mr between 18 and 20 kDa with a single polypeptide chain as determined by SDS-PAGE with and without reduction. JB1, JB3-1 and JB3-2 had Mr of 19.70, 19.69 and 19.69 kDa, respectively, by MALDI-TOF. JB2 and JB4 had Mr of 18.08 and 20.85, respectively, by SDS-PAGE. The N-terminal sequences of JB1, JB3-1 and JB3-2 showed identity with others Kunitz-type inhibitors. The five inhibitors were stable over a wide range of temperature and pH. The inhibition of trypsin by JB1, JB2 and JB4 was competitive. JB1, JB2, JB3-1 and JB3-2 showed Ki values of 3.56 x 10-8 M, 1.65 x 10-8 M, 4.20 x 10-8 M, 2.88 x 10-8 M, respectively, against bovine trypsin. In comparison with others inhibitors JB4, with Ki of 5.70 x 10-10 M, showed a high affinity toward trypsin. Among the inhibitors purified only JB4 inhibited chymotrypsin activity. The activities of elastase and bromelain were not inhibited for these inhibitors. The inhibition of JB1, JB2, JB3-1 and JB3-2 on papain varied between 32.93 to 48.82% of inhibition and was indicative of its bifunctionality with exception of JB4 that inhibited this activity in 9.9%. The papain inhibition by JB1 and JB2 were noncompetitive type and the Kivalues were 7.6 x 10-7 and 5.1 x 10-7 M, respectively. In vitro assays against digestive proteinases from Lepidoptera, Diptera and Coleoptera pests were carried out. These inhibitors were effective towards trypsin-like digestive enzymes of the insect in different degrees. The digestive enzymes from Zabrotes subfasciatus and Ceratitis capitata were inhibited by JB1 in 68.87 and 65.53% respectively, and Callosobruchus maculatus, Alabama argillaceae and Plodia intepunctella enzymes were inhibited in the range of 29.18 to 44.35%. Digestive enzymes from Z. subfasciatus, C. maculatus and C. capitata were inhibited by JB2 in the range of 70.04 to 74.54%, and the enzymes of A. argillaceae and P. intepunctella were suppressed in 13.58 and 48.67%, respectively. Trypsin-like activities of larval from Z. subfasciatus were suppressed in 67.33 and 56.93% by JB3-1 and JB3-2, respectively, and the activities of C. maculatus, A. argillaceae, P. intepunctella and C. capitata were inhibited by these inhibitors in the range of 5.17-49.00%. JB4 inhibited around 54.53 to 66.15% the digestive enzymes of C. maculatus, Z. subfasciatus and A. argillaceae and the digestive enzymes from P. intepunctella and C. capitata larvae in 8.97% and 37.47%, respectively. The inhibition of trypsin-like and papain-like proteinases of several insects suggested that these inhibitors may affect the growth and survival of these insect pests when incorporated into artificial diet and their bifunctionality are indicative that these inhibitors could be strong candidates to plant management programs cross transgenia. / Cinco inibidores de tripsina da família Kunitz (JB1, JB2, JB3-1, JB3-2 e JB4) foram purificados de sementes de Pithecellobium dumosum, uma árvore da subfamília Mimosoideae, por precipitação com ácido tricloroácetico (TCA), cromatografia de afinidade sobre tripsina imobilizada em Sepharose e coluna de fase reversa em sistema de CLAE. Os cinco inibidores possuem massa molecular entre 18 e 20 kDa formados por uma cadeia polipeptídica como determinado por SDS-PAGE na presença ou ausência de -mercaptoetanol. JB1, JB3-1 e JB3-2 têm massas moleculares de 19,70, 19,69 e 19,69 kDa, respectivamente, por MALDI-TOF. JB2 e JB4 têm massa molecular de 18,08 e 20,85 kDa, respectivamente. A seqüência N-terminal de JB1, JB3-1 e JB3-2 mostrou identidade com outros inibidores da família Kunitz. Os cinco inibidores foram estáveis às variações de temperatura e pH. A inibição da tripsina por JB1, JB2 e JB4 foi do tipo competitivo. JB1, JB2, JB3-1 e JB3-2 tiveram Kis de 3,56 x 10-8 M, 1,65 x 10-8 M, 4,20 x10-8 M, 2,88 x 10-8 M, respectivamente para a tripsina bovina. Em comparação com os outros inibidores JB4, com Ki de 5,70 x 10-10 M, apresentou maior afinidade para tripsina. Entre os inibidores purificados apenas JB4 inibiu moderadamente a atividade da quimotripsina. A atividade da elastase e bromelaína não foi inibida efetivamente por esses inibidores. A inibição de JB1, JB2, JB3-1 e JB3-2 sobre a papaína variaram entre 32,93 a 48,82% e foi indicativo de sua bifuncionalidade, com exceção de JB4 que inibiu fracamente essa atividade (9,93% de inibição). A inibição da papaína por JB1 e JB2 foi do tipo não competitiva e os valores de Ki foram de 7,6 x 10-7 e 5,1 x 10-7 M, respectivamente. Ensaios in vitro sobre as proteinases digestórias de Lepidoptera, Diptera e Coleoptera foram feitos. Esses inibidores foram efetivos para enzimas digestórias semelhantes à tripsina desses insetos em diferentes graus. As enzimas digestivas de Zabrotes subfasciatus e Ceratitis capitata foram inibidas por JB1 em 68,87 e 65,53%, respectivamente, e as enzimas de Callosobruchus maculatus, Alabama argillaceae e Plodia interpunctella foram inibidas entre 29,18 e 44,35%. Enzimas digestórias de Z. subfasciatus, C. maculatus e C. capitata foram inibidas por JB2 entre 70,04 e 74,54% e as enzimas de larvas de A argillaceae e P. interpunctella foram suprimidas em 13,58 e 48,67%, respectivamente. A atividade semelhante à tripsina de larvas de Z. subfasciatus foi suprimida em 67,33 e 56,93% por JB3-1 e JB3-2, respectivamente, e a atividade de C. maculatus, A argillaceae, P. interpunctella e C. capitata foram suprimidas por esses inibidores entre 5,17 e 49,00%. JB4 inibiu entre 54,53 a 66,15 % as enzimas digestivas de C. maculatus, Z. subfasciatus e A argillaceae e inibiu as enzimas digestivas de larvas de P. intepunctella e C. capitata em 8,97 e 37,47%, respectivamente. A inibição de proteinases semelhantes à tripsina e à papaína presentes no intestino de vários insetos sugere que esses inibidores possam afetar o crescimento e sobrevivência desses insetos pragas quando incorporados em sementes artificiais e esta bifuncionalidade é indicativo de que estes inibidores possam ser fortes candidatos para os programas de melhoramento de plantas via transgenia.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-07T11:26:10Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1381844 bytes, checksum: f37c2685480834a1dd06580f7461ed33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-07T11:26:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1381844 bytes, checksum: f37c2685480834a1dd06580f7461ed33 (MD5) Previous issue date: 2010-10-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis, por ser considerada uma das principais pragas da cultura da soja, tem sido alvo de estudos visando a busca de alternativas para o seu controle. A utilização de inibidores de proteases (IPs) como alternativa para o controle de pragas tem sido amplamente estudada. Sabe-se que uma rota de defesa vegetal, talvez a mais conhecida, é denominada rota octadecanóide (ou via das lipoxigenases), a qual culmina com a produção do ácido jasmônico: um hormônio vegetal que ativa genes que expressam inibidores de proteases, tidos como agentes anti-metabólicos, pois levam os insetos a uma deficiência protéica. Os IPs atuam no intestino médio dos herbívoros, inibindo a ação das proteases sobre as proteínas provindas da alimentação, havendo, portanto, uma redução na disponibilidade de aminoácidos ao inseto, podendo resultar no atraso do crescimento e reprodução desses herbívoros e, consequentemente, na sua morte. Este trabalho teve por objetivos avaliar a capacidade da planta da soja de responder ao ataque de A. gemmatalis através da via das lipoxigenases e as respostas bioquímica, comportamental e fisiológica da lagarta da soja a concentrações crescentes do inibidor sintético de serino-proteases, berenil. Para tal, as lagartas foram alimentadas com plantas de soja da variedade IAC-PL-1, pulverizadas com berenil nas doses 0,0; 0,008; 0,01; 0,20; 0,60; e 1,0% (p/v ) e com plantas de soja das variedades IAC-18, IAC-24 e FOSCARIN-31 contendo 0,0; 0,60; e 1,0% (p/v) de berenil. Nas quatro cultivares testadas, observou-se que após o ataque da lagarta da soja ocorreu um aumento no pool de lipoxigenases nas folhas, o que levou a uma alta produção de inibidores de protease. Nas lagartas que foram alimentadas com plantas da variedade IAC-PL-1, observou-se interferência de berenil na resposta comportamental desses insetos, que tiveram preferência por plantas que não receberam pulverizações com o inibidor, o mesmo não sendo observado para as mariposas com relação à preferência para oviposição. Com relação ao desenvolvimento pós-embrionário, ocorreu uma redução significativa no ganho de peso. Foi observada também uma significativa redução na sobrevivência e no tempo de vida das larvas alimentadas com as maiores doses do inibidor. Além disso, houve inibição das atividades proteolítica e tríptica do intestino das lagartas nas quatro cultivares de soja. Os resultados obtidos indicam que a utilização de berenil é uma estratégia promissora para o controle da lagarta da soja e possivelmente de outros insetos-praga que tenham a tripsina como principal enzima digestiva. / The caterpillar, Anticarsia gemmatalis, for being considered a pest of soybean, has been the target of studies aimed at finding alternatives to its control. The use of protease inhibitors (PIs) as an alternative for pest control has been widely studied. It is known that a plant defense route, perhaps the best known is called octadecanóide route (or lipoxygenase pathway), which culminates with the production of jasmonic acid: a plant hormone that activates genes expressing protease inhibitor, taken as anti-metabolic agents, since they bring the insects to a protein deficiency. IPs work in the midgut of herbivores, inhibiting the action of proteases on proteins originated from food, therefore there is a reduction in the availability of amino acids to the insect, which can result in delayed growth and reproduction of herbivores and hence in its death. This study aimed to evaluate the ability of the soybean plant to respond to the attack of A. gemmatalis through the lipoxygenase pathway and biochemical responses, behavioral and physiological soybean caterpillar to increasing concentrations of synthetic inhibitor of serine proteases, berenil. To this end, the larvae were fed with soybean variety IAC PL-1, treated with berenil doses 0.0, 0.008, 0.01, 0.20, 0.60, and 1.0% (w/v) and the soybean variety IAC-18, IAC-24 and Foscarin-31 containing 0.0, 0.60, and 1.0% (w/v) of berenil. In the four cultivars tested, it was observed that after the attack of soybean caterpillar was an increase in the pool of lipoxygenase in the leaves leading to a high production of protease inhibitors. In the caterpillars that were fed on plants of the variety IAC PAL-1, there was interference from berenil behavioral response of these insects, which had no preference for plants that received the inhibitor sprays, but these were not observed for moths in relation to oviposition preference. Regarding the post-embryonic development, there was a significant reduction in weight gain. There was also a significant reduction in the survival and life span of larvae fed the highest doses of the inhibitor. Furthermore, there was inhibition of the proteolytic and tryptic activities of the gut of caterpillars in the four cultivars. The results indicate that the use of berenil is a promising strategy for control of soybean caterpillar and possibly other insect pests that have the main digestive enzyme trypsin. / Tese importada do Alexandria

ALMEIDA FILHO, Luiz Carlos Pereira. Sementes de Lonchocarpus sericeus (Poir) Kunth ex Dc como repositório de inibidores de proteases: purificação e seus efeitos sobre o ciclo de vida do mosquito Aedes aegypti. 2017. 93 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Coordenação PGBioquímica (pg@bioquimica.ufc.br) on 2017-09-19T18:55:28Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_lcpalmeidafilho.pdf: 1954670 bytes, checksum: 5d3ac62feabd7a4aa5bff98f664a83af (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-09-20T18:20:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_lcpalmeidafilho.pdf: 1954670 bytes, checksum: 5d3ac62feabd7a4aa5bff98f664a83af (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-20T18:20:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_lcpalmeidafilho.pdf: 1954670 bytes, checksum: 5d3ac62feabd7a4aa5bff98f664a83af (MD5) Previous issue date: 2017 / Arboviroses such as chikungunya, dengue and zika represent a serious issue in public health due to the absence of an approved vaccine or specific antiviral drugs for its prevention and treatment. One of the ways to avoid the occurrence of these diseases is by combating the mosquito vector, Aedes aegypti. This insect belongs to Diptera order, which commonly has digestive enzymes similar to trypsin and chymotrypsin. Protease inhibitors are molecules that can block enzymatic activity leading to an impairment of digestion and nutrition. Together, these factors can lead the insects to death. In this context, we purified a new protease inhibitor from seeds of an underexploited plant, Lonchocarpus sericeus. This inhibitor was subjected to a biochemical characterization, evaluated for the inbitory activity upon the digestive proteases from Aedes aegypti larvae and its insecticidal effect upon egg hatchability and larvae development. The purified inhibitor (LsCTI) showed a single protein band on SDS-PAGE, the molecular mass determined by MALDI-TOF-MS was 8,870.45 Da. LsCTI was able to inhibit more than one serine protease. Kinetics analyzes revealed the type of noncompetitive inhibition and a low Ki for chymotrypsin (8.24 x 10-8 M). The stability of the inhibitory activity was remarkable for the thermal resistance, LsCTI supported heating at 100 ° C for 180 min without losing its activity. The IC50 value of LsCTI was 4.7 x 10-7 M. for Ae. aegypti midgut enzymes. LsCTI did not affect egg hatchability when tested at 0.3 mg.mL-1, but caused a high larval mortality rate (77%) and developmental delay (37%). Thus, LsCTI is a novel protease inhibitor with remarkable biochemical characteristics and a novel potential tool to control the Ae. Aegypti development. / Arboviroses como a chikungunya, dengue e zika representam um problema sério em saúde pública devido à ausência de uma vacina aprovada ou medicamentos antivirais específicos para sua prevenção e tratamento. Uma das maneiras de evitar a ocorrência dessas doenças é através do combate ao mosquito vetorial, Aedes aegypti. Este inseto pertence à ordem Diptera que comumente possui enzimas digestivas similares à tripsina e quimotripsina. Os inibidores de protease são moléculas que podem promover o bloqueio da atividade enzimática prejudicando a digestão e a nutrição. Juntos, esses fatores podem levar à morte de insetos. Neste contexto, purificamos um inibidor de protease de sementes de uma planta sub-explorada, Lonchocarpus sericeus. Este inibidor foi submetido a caracterização bioquímica e avaliado quanto a atividade inibitória sobre as proteases digestivas do intestino médio das larvas Ae. aegypti e seu efeito inseticida sobre a eclodibilidade de ovos, desenvolvimento desse mosquito. O inibidor purificado (LsCTI) mostrou uma única banda de proteína em SDS-PAGE, a massa molecular determinada por MALDI-TOF-MS foi de 8.870,45 Da. LsCTI foi capaz de inibir mais de uma protease serínica. As análises cinéticas revelaram o tipo de inibição não competitivo e o Ki baixo para a quimotripsina (8,24 x 10-8 M). A resistência térmica do inibidor foi notável, suportando aquecimento a 100 °C durante 180 min, sem perda de atividade. O valor da CI50 de LsCTI para as enzimas do intestino médio das larvas de Ae. aegypti foi 4,7 x 10-7 M. O LsCTI não afetou a eclodibilidade dos ovos quando testado a 0,3 mg.mL-1, mas causou alta taxa de mortalidade larval (77%) e atraso no desenvolvimento (37%). Assim o LsCTI é um novo inibidor de protease com características bioquímicas notáveis e uma nova ferramenta potencial para controlar o desenvolvimento do mosquito Ae. aegypti.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cancer de prostata e o segundo tipo de cancer mais frequente. Calicreinas teciduais e integrinas estao diretamente relacionadas com essa doenca, interferindo na adesao celular, diferenciacao e proliferacao. Neste trabalho utilizamos as linhagens estabelecidas DU145 e PC3 de cancer de prostata para o estudo do efeito do inibidor de calicreina recombinante, rBbKIm, o qual contem em sua sequencia primaria o motivo RGD, proveniente do inibidor BrTI isolado de Bauhnina rufa. O meio condicionado da cultura de DU145 e PC3 tratadas com rBbKIm por 48 horas inibiu cerca de 95% a atividade hidrolitica de HD-Pro-Phe-Arg- ƒÏNa por serino proteases da familia das calicreinas. rBbKIm inibiu a viabilidade celular da DU145 (56%, 100 ƒÊM, 48 horas) e da PC3 (28%, 100 ƒÊM, 48 horas) e interferiu somente em 5% da viabilidade da linhagem de fibroblastos de liquido amniotico (100 ƒÊM, 48 horas). rBbKIm nao inibiu a adesao das linhagens DU145 e PC3 sobre a fibronectina, laminina, colageno I e IV. Embora rBbKIm nao tenha interferido na migracao de DU145 o inibidor reduziu em 38% o processo migratorio da linhagem PC3 (100 ƒÊM) apos 23 horas de tratamento. Em relacao ao efeito do inibidor sobre a morte celular DU145 e PC3 tratadas com de rBbKIm (50 e 100 ƒÊM, 24 e 48 h) induziu a morte celular por apoptose. Alteracoes no ciclo celular foram observadas na linhagem PC3 com parada do ciclo nas fases G0/G1 e G2/M. Nao houve alteracao no ciclo celular na linhagem DU145. Ambas as celulas externalizaram o citocromo c para o citoplasma quando tratadas com rBbKIm (50 e 100 ƒÊM) por 24 horas. No caso da PC3 observou-se a ativacao de caspase-9 com 50 ƒÊM de rBbKIm apos 48 horas, nao havendo ativacao de caspase-3 enquanto que com a DU145 ocorreu ativacao da caspase-3 e nao houve ativacao da caspase-9. Os peptideos contendo a sequencia RGD e RGE nao inibiram a viabilidade celular de DU145 e PC3. Analises sobre o efeito de rBbKIm na viabilidade e migracao da linhagem endotelial humana (HUVEC), mostrou que rBbKIm (50 ƒÊM) inibiu 28% da viabilidade celular e 30% da motilidade celular da HUVEC. rBbKIm tambem apresentou atividade inibitoria na formacao de estruturas angiogenicas sobre Matrigel in vitro. Em resumo, o presente trabalho demonstrou a ação diferencial do inibidor de protease rBbKIm em linhagens de câncer de próstata independentes de andrógenos, PC3 e DU145, e em células normais de fibroblastos de líquido amniótico e em células endoteliais humanas, HUVEC. / Prostate cancer is the second more frequent type of cancer. In this work, using DU145 and PC3 prostate cancer cellular lines, we studied the effect of recombinant kallikrein inhibitor modified form (rBbKm), in which the sequence containing the signal motif sequence RGD of the inhibitor BrTI from Bauhnina rufa was inserted. When DU145 and PC3 were incubated with rBbKIm for 48h, and the conditioned medium the culture was incubated with the HD-Pro-Phe-Arg-ñNa, an kallikrein substrate, inhibited 95% of the degradation of this in both cells. rBbKIm inhibited cell viabillity of DU145 (56%, 100 ìM, 48 h) and PC3 (28%, 100 ìM, 48 h), but affect only 5% of the viabillity of fibroblast normal cell line (100 ìM, 48h). In cell adhesion, rBbKIm did not inhibit DU145 and PC3 cell line adhesion on fibronectin, laminin, collagen I and IV coat. In cell migration, rBbKIm did not inhibit DU145, but inhibited 38% of the PC3 (100 ìM) after 23 h. To evaluate the cytotoxicity, DU145 and PC3 were incubated with rBbKIm (50 and 100 ìM, 24 and 48h) inducing cell death by apoptosis. The presence of rBbKIm arrest PC3 cell cycle at the G0/G1 and G2/M phase, but did not affect DU145. Both cells released cytocrome c to the cytosol when treated with rBbKIm (50 and 100 ìM) for 24h. Moreover, DU145 when was treated with rBbKIm for 48h activated the caspase-3. However PC3 did not activated caspase-3, but activated caspase-9. The peptides containing the RGD and RGE sequence did not inhbit the cell viabillity of DU145 and PC3. Analyzing the effect of rBbKIm on HUVEC viabillity and migration, rBbKIm (50ìM) inhibited 28% and 30%, respectively. This protein inhibited 49% of the HUVEC angiogenesis in vitro on Matrigel. In summary, we have demonstrated the differential action of the protease inhibitor rBbKIm on androgen-independent prostate cancer PC3 and DU145, normal fibroblast and endothelial HUVEC cells. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações