Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016. / Texto liberado parcialmente pelo autor. Conteúdo restrito: Materiais e métodos, Resultados e Discussão e Conclusão. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-12-19T14:08:42Z No. of bitstreams: 1 2016_IveloneMariadeCarvalhoBarros_Parcial.pdf: 953689 bytes, checksum: f204c06d417a89fd6d9e8a53859ca3ce (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-26T19:19:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_IveloneMariadeCarvalhoBarros_Parcial.pdf: 953689 bytes, checksum: f204c06d417a89fd6d9e8a53859ca3ce (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-26T19:19:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_IveloneMariadeCarvalhoBarros_Parcial.pdf: 953689 bytes, checksum: f204c06d417a89fd6d9e8a53859ca3ce (MD5) / O Cerrado se constitui em importante centro de biodiversidade abrigando espécies úteis para a medicina popular., entre elas o Erythroxylum suberosum, arbusto da família Erythroxylacea amplamente distribuído no território nacional. Seus frutos servem de alimento para aves, seu tronco é suberoso, sua madeira é utilizada na carpintaria e suas cascas são utilizadas no curtimento de couro. É conhecido como fruta-de-pomba-do-campo, mercureiro, sombra de touro e cabelo de nego, utilizado na medicina popular contra má digestão, reumatismo e inflamação. O presente estudo teve como objetivo realizar estudo químico, de espécie do gênero Erythroxylum, biomonitorado por inibição da hialuronidase. No ensaio de inibição enzimática foi utilizado método turbidimétrico, com adaptações. Os compostos foram isolados por CC de Sílica gel ou Sephadex e identificados por CCD, CLAE-DAD, e RMN de 1H e 13C. O extrato etanólico de E. suberosum apresentou forte potencial de inibição com IC50 = 0,045 mg/mL, significantemente menor que o controle Cromoglicato dissódico (IC50 = 4,8 mg/mL). Do extrato etanólico foram identificados rutina, quercetina e derivados, catequina, epicatequina e derivados do ácido clorogênico e isolada mistura de hiperosídeo e isoquercitrina. Do extrato aquoso foi identificada mistura de frutose e trealose, catequina e epicatequina e isolada rutina. Do extrato hexânicos foram isolados ésteres alifáticos de cadeia longa. A atividade dos extratos e frações frente à enzima foi justificada, em parte, pela presença da quercetina (IC50 = 0,36 mg/mL). A atividade antioxidante observada para os extratos aquoso, etanólico e frações foi relacionada à composição micromolecular dos mesmos. Os extratos brutos de E. suberosum não foram citotóxicos frente às larvas de A. salina com DL50 > 1mg/mL. Esses resultados revelam o potencial de E. suberosum no elenco de espécies brasileiras farmacologicamente úteis. A descoberta de novos inibidores da hialuronidase representam um avanço na terapêutica já que o complexo hialuronano-hialuronidase está envolvido em vários processos fisiopatológicos. Esse foi o primeiro relato, pelo que se sabe, de inibição da hialuronidase pelos extratos e flavonoides isolados das folhas de E. suberosum. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cerrado consists in an important center of biodiversity hosting species uesful for folk medicine, among which is Erythroxylum suberosum, a bush from Erythroxylacea family, widely spread thoughout national territory. Its fruits serve as food to birds, its trunk is suberous, its wood is used in carpentry, and its barks are used in leather tanning. It is well known as fruta-de-pomba-do-campo, mercureiro, sombra de touro and cabelo de nego, used in folk medicine against indigestion, rheumatism and inflammation. The current study aimed to carry out chemical study of species of Erythroxulum genus bioguided by inhibition of hyaluronidase enzyme. In the enzyme inhibition assay was used turbidimetric method, with adaptations. The compounds were isolated by Sílica gel or Sephadex® CC and identified by TLC, HPLCDAD and NMR of 1H and 13C.The ethanolic extract of E. suberosum presented high potential for inhibition with IC50 = 0,045 mg/mL, significantly less than the dissodium cromoglycate control (IC50 = 4,8 mg/mL). Were identified rutin, quercetina and derivates, catechin, epicathechin and derivates of chlorogenic acid and isolated mixture of hyperoside and isoquercitrina from the ethanolic extract. From aqueous extract Rutin was isolated and a mixture of fructose and trehalose sugars, catechin and epicatechin was identified. Of the hexane extract were isolated aliphatic esters of long chain. The activity of the extracts and fractions front of the enzyme hyaluronidase was justified, in part, due to the presence of quercetina (IC50 = 0,36 mg/mL). The antioxidante activity observed for the aqueous and ethanolic extracts and fractions was associated to chemical composition of the same. The crude extracts from the E. suberosum were not citotoxic to brin shrimp (A. salina) with DL50 > 1mg/mL. These results show the potential of E. suberosum in the listo f pharmacologically useful brazilian species. The Discovery of new hyaluronidase inhibitors represent na advance in the Therapeutic due to the hyaluronan-hyaluronidasse complex is involved in seveeral pathophysiological processes. This was the first report, by what is know, inhibition of hyaluronidase enzyme by extracts and flavonoids isolated from the leaves of E. suberosum.

O Ácido Hialurônico, HA, é um dos principais componentes da matriz extracelular dos vertebrados. É um glicosaminoglicano hidrolisado pelas enzimas da família da Hialuronidase, envolvidas na regulação de importantes processos biológicos, como a permeabilidade vascular e a angiogênese. Conforme o interesse pelo desenvolvimento de uma rota de síntese para esta enzima, objetivamos a obtenção de um plasmídeo, contendo a sequência que codifica a variante 8 do gene Hyal-1. Para isto, planejou-se a inserção de dois sítios de restrição para a sub-clonagem, sítio dirigida, BamH-1 na região 5\' e Not-1 na 3\' na sequência do códon da Hyal-1. O inserto foi sub-clonado no plasmídeo, pET28-a, e transfectado para expressão em Escherichia coli Bl-21. A expressão foi induzida por IPTG no melhor tempo, de 4 horas, e a confirmação da expressão protéica foi realizada por Western blotting. Observou-se uma proteína de 45 kDa, confirmando a presença da Hyal-1. Realizou-se a expressão em 4 litros de cultura para obtenção de uma quantia suficiente para purificação em coluna de níquel-agarose. O rendimento neste experimento foi de 25µg por litro. A rota sintética sugerida neste estudo mostrou-se eficiente para obtenção da proteína Hyal-1 recombinante, justificando futuros investimentos na otimização deste processo / Hyaluronic Acid, HA is a major component of the extracellular matrix of vertebrates. It is a glycosaminoglycan hydrolyzed by enzymes of the hyaluronidase family, involved in the regulation of important biological processes such as angiogenesis and vascular permeability. As interest in the development of a synthesis route for this enzyme, we aim to obtain a plasmid containing the coding sequence of the gene variant 8 Hyal-1. To obtain the plasmid insert was planned and two restriction sites for sub-cloning site directed at the 5\' Bam H-1 and 3\' Not-1 in codon sequence of Hyal-1. The insert was sub-cloned into plasmid pET28-a, and transfected for expression in Escherichia coli Bl-21. The expression was induced by IPTG in the best time of 4 hours and confirmation of protein expression was performed by Western blotting. There was a 45 kDa protein, thus confirming the presence of Hyal-1. Purification was performed on nickel-agarose column to obtain a larger amount of the protein, approximately 25µg/L. The route suggested in this study was efficient attainment of Hyal-1 recombinant protein.

A hialuronidase (HAase) é um complexo enzimático que age sobre o tecido conjuntivo frouxo. Existem vários estudos sobre a aplicação da HAase na região perineal, com a finalidade de reduzir a ocorrência de episiotomia e lacerações espontâneas. Apesar dos resultados positivos, as limitações metodológicas destes estudos justificam a controvérsia sobre os benefícios de sua utilização no parto normal. O objetivo do presente estudo foi comparar a frequência de trauma perineal e o grau de laceração perineal espontânea no parto normal, com e sem uso da HAase injetável no períneo. Trata-se de um ensaio clínico aleatório, placebo-controlado e duplo-cego, realizado em 2008, no Centro de Parto Normal do Amparo Maternal, na cidade de São Paulo. A amostra foi de 156 parturientes, alocadas aleatoriamente nos grupos experimental (n=76) e controle (n = 80). Foram incluídas apenas mulheres com feto único e gestação a termo, sem partos vaginais anteriores, que tiveram parto normal na posição semissentada, sem anestesia por bloqueio intra ou extradural. No segundo período do parto, as mulheres do grupo experimental receberam injeção de HAase na região perineal posterior e as do grupo controle, injeção de placebo. Os frascos com a solução foram previamente mascarados e identificados por código numérico. A avaliação do desfecho perineal também foi realizada de forma mascarada por uma enfermeira-juíza. Para a análise inferencial dos dados o teste exato de Fisher foi realizado de forma monocaudal, sendo considerados estatisticamente significantes os valores de p < 0,025. Os resultados mostraram que a integridade perineal (ausência de laceração de qualquer grau na região posterior do períneo ou episiotomia) ocorreu em 34,2% das mulheres do grupo experimental e em 32,5% do grupo controle, sem diferença estatisticamente significante entre os grupos (p = 0,477). O trauma perineal grave (lacerações de 2º e 3º graus e episiotomia) ocorreu em 28,9% das mulheres do grupo experimental e em 38,8% do grupo controle, sem diferença estatisticamente significante (p = 0,131). A profundidade da laceração de 2º grau nos grupos experimental e controle, avaliada com a Peri-Rule®, foi de 1,9 e 2,3 cm, respectivamente. A episiotomia foi realizada em 11 parturientes e quatro mulheres do grupo controle tiveram laceração de 3º grau. Entre as mulheres de ambos os grupos, o trauma mais frequente na região perineal posterior foi a laceração de primeiro grau (56% e 42,6% nos grupos experimental e controle, respectivamente). As únicas alterações perineais observadas, entre 24 a 48 horas após o parto, foram edema ou equimose, presentes em 14,7% e 32,5% das mulheres dos grupos experimental e controle, respectivamente. A média do perímetro cefálico dos recém-nascidos foi maior entre as mulheres com episiotomia e laceração de 3º grau, com valores do IC de 95% não coincidente para os casos de integridade perineal e laceração de 1º e 2º graus, sugerindo que a medida do perímetro cefálico dos recém-nascidos de mães submetidas a episiotomia era maior que dos demais bebês. A quase totalidade dos recém-nascidos apresentou Apgar maior ou igual a sete nos primeiro e quinto minutos de vida (94,2% e 99,4%, respectivamente), indicando a boa vitalidade ao nascer. Todos os bebês permaneceram internados com a mãe no Alojamento Conjunto. Concluiu-se que a utilização da HAase injetável não aumentou a proporção de períneo íntegro nem reduziu a proporção de trauma perineal grave na amostra estudada / Hyaluronidase (Haas) is a complex enzyme that acts on the connective tissue. There are several studies on the implementation of Haas in the perineal area in order to reduce the incidence of episiotomy and spontaneous lacerations Despite positive results, methodological limitations of these studies justify the controversy about the benefits of its use in spontaneous delivery. The aim of this study was to compare the frequency of trauma and the degree of perineal lacerations in vaginal deliveries, with and without the use of injectable Haase in the posterior region of the perineum. This is a randomized clinical trial, placebo-controlled, double-blind study, conducted in 2008 in the Amparo Maternal Birth Center located in São Paulo city. The sample of 156 pregnant women were randomly allocated to experimental groups (n = 76) and control (n = 80). We included only women with singleton pregnancies, pregnancy to term without previous vaginal deliveries and who had spontaneous delivery in semi-sitting position without anesthesia by intra or extra-dural. In the second stage of labor, women in the experimental group received injections of Haas in the posterior perineal area and those of the control group received injections of placebo. The vials of solution were previously masked and identified by code number. The assessment of perineal outcome was also performed under masked by a nurse-judge. For the inferential analysis of data, we performed the Fisher exact test, so tailed and were considered statistically significant p values <0.025. The results showed that the perineal integrity (absence of any laceration in the posterior region of the perineum or episiotomy) occurred in 34.2% of women in the experimental group and 32.5% in the control group, no statistically significant difference between groups (p = 0.477). The severe perineal trauma (second and third degree lacerations and episiotomy) occurred in 28.9% of women in the experimental group and 38.8% in the control group, no statistically significant difference (p = 0.131). The depth of the perineal laceration of 2nd degree in experimental and control groups measured by the Peri-Rule ®, was 1.9 and 2.3 cm, respectively. Episiotomy was performed in 11 pregnant women and four women in the control group had 3rd degree lacerations. Among women in both groups, the most common trauma in the posterior region of the perineum was the first degree (56% and 42.6% in the experimental and control groups, respectively). The only perineal changes observed between 24 to 48 hours after delivery, were swelling or bruising, present in 14.7% and 32.5% of women in the experimental and control groups, respectively. The average head circumference of newborns was higher among women with episiotomy and 3rd degree tears, with CI of 95% not matched to the cases of integrity and perineal laceration at 1st and 2nd degrees, suggesting that the extent head circumference of newborns whose mothers undergo episiotomies was larger than the other babies. Almost all of the newborns had Apgar scores greater than or equal seven in the first and fifth minutes of life (94.2% and 99.4%, respectively), indicating good vitality at birth. All babies roomed-in with the mother during hospital stay. It was concluded that the use of injectable Haase did not increase the proportion of intact perineum and did not reduce the proportion of severe perineal trauma in our sample

As hialuronidases de peçonhas animais são capazes de clivar o hialuronan presente na matriz extracelular, facilitando a difusão das toxinas no tecido da vítima. Essas enzimas têm sido negligenciadas, devido à instabilidade enzimática e à baixa concentração na peçonha. Assim, a expressão heteróloga das hialuronidases permite a sua obtenção em quantidades que viabilizam seu estudo estrutural e funcional. Associado a isso, o transcriptoma propicia a identificação de novas toxinas e componentes de baixa proporção na peçonha. Portanto, o presente trabalho realizou o transcriptoma da glândula de peçonha do escorpião Tityus serrulatus e a clonagem e expressão heteróloga da hialuronidase. No transcriptoma foram obtidos 558 ESTs, dos quais 61,8% correspondem às toxinas, dentre elas neurotoxinas com ação em canais iônicos, metaloproteinas, hipotensinas, peptídeos antimicrobianos, dentre outros. Foram também identificadas novas toxinas como o neuropeptídeo e Ts16.1, descritos pela primeira vez para o gênero Tityus. Dentre os transcritos obtidos, foi identificado apenas um clone correspondente ao C-terminal incompleto de uma hialuronidase de T. serrulatus. Consequentemente, foi produzido o gene sintético contendo a sequência da TsHyal-1, obtida em bancos de dados, no vetor de expressão pPICZ?A para expressão heteróloga em P. pastoris. A rTsHyal-1 foi expressa em escala laboratorial em meio não suplementado (BMM) em pH 7,0 durante 96 h da indução com alimentação diária de metanol a 0,75%. A rTsHyal-1 foi produzida na sua forma solúvel e ativa (838,31 UTR/mg) e resultou em um rendimento proteico de 250 mg/L de material expresso. O secretoma do meio de expressão mostrou que além da rTsHyal-1, a P. pastoris também secreta proteínas nativas associadas à ligação do ATP, metabolismo de carboidrato e resposta ao estresse oxidativo. A rTsHyal-1 foi parcialmente purificada em troca catiônica fraca e apresentou atividade específica de 1.097,45 UTR/mg. A rTsHyal-1 apresenta massa molecular de 49,5 kDa e o tratamento com PNGase F seguido da análise por espectrometria de massas (MALDI-TOF) indicou que uma possível N-glicosilação de 4,5 kDa. Adicionalmente, o sequenciamento dos digestos trípticos da enzima realizado no MALDI-TOF e pelo Q-Exactive resultaram em 46,8% de cobertura da sequencia da proteína. A rTsHyal-1 apresenta especificidade pelo substrato hialuronan, seguido da condroitina C, A e B e apresentou atividade ótima em pH 6,0 e a 40°C. Adicionalmente, o ensaio do MTT indicou que a enzima recombinante não apresenta citotoxicidade in vitro. Os resultados obtidos determinaram as melhores condições para a expressão heteróloga da rTsHyal-1, que corresponde à primeira hialuronidase recombinante de escorpião expressa em P. pastoris com atividade enzimática preservada / The venom hyaluronidases of animals are able to cleave hyaluronan present in the extracellular matrix, acting as a spreading factor for the toxins into the tissues of the victim. These enzymes have been neglected due to their instability and low concentration in the venom. Thus, heterologous expression of hyaluronidases permits the obtainment of sufficient amount for structural and functional studies. Moreover, the transcriptome allows the identification of new toxins or components with low proportion in the venom. In this way, this study aimed the construction of the transcriptome of Tityus serrulatus venom gland and cloning/heterologous expression of hyaluronidase. In the transcriptome, 558 ESTs were identified and 61.8% corresponded to toxins, such as neurotoxins with action on ion channels, metalloproteins, hypotensins, antimicrobial peptides, among others. In addition, new toxins were identified, comprising one neuropeptide and Ts16.1, described for the first time to the genus Tityus. Among the obtained transcripts, one identified clone corresponded to an incomplete C-terminal of a hyaluronidase. Consequently, a synthetic gene was synthesized containing the sequence of TsHyal-1 (obtained from databases) in the pPICZ?A vector for heterologous expression in P. pastoris. The rTsHyal-1 was expressed at laboratorial scale in unsupplemented medium (BMM) at pH 7.0 for 96 h, after induction time, with daily feeding of 0.75% methanol. The rTsHyal-1 was produced in soluble and active form (838.31 UTR/mg) and resulted in a protein yield of 0,266 mg/mL in final expressed material. Besides, the secretome of the medium showed that P. pastoris also secretes native proteins bound with ATP, proteins related to carbohydrate metabolism and oxidative stress response. The rTsHyal-1 was partially purified in a weak cation exchange and presented specific activity of 1097.45 UTR/mg. The rTsHyal-1 has molecular mass of 49.5 kDa and the treatment with PNGase F and analysis by mass spectrometry (MALDI-TOF) indicated a potential N-glycosylation of 4.5 kDa. Additionally, the sequencing of tryptic digests performed in the MALDI-TOF and Q-Exactive resulted in 46.8% of protein sequence coverage. The rTsHyal-1 presents substrate specificity for hyaluronan followed by chondroitin C, A and B and showed an optimum activity at pH 6.0 and 40°C. Furthermore, the MTT assay indicated that the recombinant enzyme does not display in vitro cytotoxicity. These results validate the biotechnological process of the heterologous expression of rTsHyal-1. This is the first recombinant hyaluronidase from scorpions expressed in P. pastoris system with enzymatic activity preserved.

A hialuronidase (HAase) é um complexo enzimático que age sobre o tecido conjuntivo frouxo. Existem vários estudos sobre a aplicação da HAase na região perineal, com a finalidade de reduzir a ocorrência de episiotomia e lacerações espontâneas. Apesar dos resultados positivos, as limitações metodológicas destes estudos justificam a controvérsia sobre os benefícios de sua utilização no parto normal. O objetivo do presente estudo foi comparar a frequência de trauma perineal e o grau de laceração perineal espontânea no parto normal, com e sem uso da HAase injetável no períneo. Trata-se de um ensaio clínico aleatório, placebo-controlado e duplo-cego, realizado em 2008, no Centro de Parto Normal do Amparo Maternal, na cidade de São Paulo. A amostra foi de 156 parturientes, alocadas aleatoriamente nos grupos experimental (n=76) e controle (n = 80). Foram incluídas apenas mulheres com feto único e gestação a termo, sem partos vaginais anteriores, que tiveram parto normal na posição semissentada, sem anestesia por bloqueio intra ou extradural. No segundo período do parto, as mulheres do grupo experimental receberam injeção de HAase na região perineal posterior e as do grupo controle, injeção de placebo. Os frascos com a solução foram previamente mascarados e identificados por código numérico. A avaliação do desfecho perineal também foi realizada de forma mascarada por uma enfermeira-juíza. Para a análise inferencial dos dados o teste exato de Fisher foi realizado de forma monocaudal, sendo considerados estatisticamente significantes os valores de p < 0,025. Os resultados mostraram que a integridade perineal (ausência de laceração de qualquer grau na região posterior do períneo ou episiotomia) ocorreu em 34,2% das mulheres do grupo experimental e em 32,5% do grupo controle, sem diferença estatisticamente significante entre os grupos (p = 0,477). O trauma perineal grave (lacerações de 2º e 3º graus e episiotomia) ocorreu em 28,9% das mulheres do grupo experimental e em 38,8% do grupo controle, sem diferença estatisticamente significante (p = 0,131). A profundidade da laceração de 2º grau nos grupos experimental e controle, avaliada com a Peri-Rule®, foi de 1,9 e 2,3 cm, respectivamente. A episiotomia foi realizada em 11 parturientes e quatro mulheres do grupo controle tiveram laceração de 3º grau. Entre as mulheres de ambos os grupos, o trauma mais frequente na região perineal posterior foi a laceração de primeiro grau (56% e 42,6% nos grupos experimental e controle, respectivamente). As únicas alterações perineais observadas, entre 24 a 48 horas após o parto, foram edema ou equimose, presentes em 14,7% e 32,5% das mulheres dos grupos experimental e controle, respectivamente. A média do perímetro cefálico dos recém-nascidos foi maior entre as mulheres com episiotomia e laceração de 3º grau, com valores do IC de 95% não coincidente para os casos de integridade perineal e laceração de 1º e 2º graus, sugerindo que a medida do perímetro cefálico dos recém-nascidos de mães submetidas a episiotomia era maior que dos demais bebês. A quase totalidade dos recém-nascidos apresentou Apgar maior ou igual a sete nos primeiro e quinto minutos de vida (94,2% e 99,4%, respectivamente), indicando a boa vitalidade ao nascer. Todos os bebês permaneceram internados com a mãe no Alojamento Conjunto. Concluiu-se que a utilização da HAase injetável não aumentou a proporção de períneo íntegro nem reduziu a proporção de trauma perineal grave na amostra estudada / Hyaluronidase (Haas) is a complex enzyme that acts on the connective tissue. There are several studies on the implementation of Haas in the perineal area in order to reduce the incidence of episiotomy and spontaneous lacerations Despite positive results, methodological limitations of these studies justify the controversy about the benefits of its use in spontaneous delivery. The aim of this study was to compare the frequency of trauma and the degree of perineal lacerations in vaginal deliveries, with and without the use of injectable Haase in the posterior region of the perineum. This is a randomized clinical trial, placebo-controlled, double-blind study, conducted in 2008 in the Amparo Maternal Birth Center located in São Paulo city. The sample of 156 pregnant women were randomly allocated to experimental groups (n = 76) and control (n = 80). We included only women with singleton pregnancies, pregnancy to term without previous vaginal deliveries and who had spontaneous delivery in semi-sitting position without anesthesia by intra or extra-dural. In the second stage of labor, women in the experimental group received injections of Haas in the posterior perineal area and those of the control group received injections of placebo. The vials of solution were previously masked and identified by code number. The assessment of perineal outcome was also performed under masked by a nurse-judge. For the inferential analysis of data, we performed the Fisher exact test, so tailed and were considered statistically significant p values <0.025. The results showed that the perineal integrity (absence of any laceration in the posterior region of the perineum or episiotomy) occurred in 34.2% of women in the experimental group and 32.5% in the control group, no statistically significant difference between groups (p = 0.477). The severe perineal trauma (second and third degree lacerations and episiotomy) occurred in 28.9% of women in the experimental group and 38.8% in the control group, no statistically significant difference (p = 0.131). The depth of the perineal laceration of 2nd degree in experimental and control groups measured by the Peri-Rule ®, was 1.9 and 2.3 cm, respectively. Episiotomy was performed in 11 pregnant women and four women in the control group had 3rd degree lacerations. Among women in both groups, the most common trauma in the posterior region of the perineum was the first degree (56% and 42.6% in the experimental and control groups, respectively). The only perineal changes observed between 24 to 48 hours after delivery, were swelling or bruising, present in 14.7% and 32.5% of women in the experimental and control groups, respectively. The average head circumference of newborns was higher among women with episiotomy and 3rd degree tears, with CI of 95% not matched to the cases of integrity and perineal laceration at 1st and 2nd degrees, suggesting that the extent head circumference of newborns whose mothers undergo episiotomies was larger than the other babies. Almost all of the newborns had Apgar scores greater than or equal seven in the first and fifth minutes of life (94.2% and 99.4%, respectively), indicating good vitality at birth. All babies roomed-in with the mother during hospital stay. It was concluded that the use of injectable Haase did not increase the proportion of intact perineum and did not reduce the proportion of severe perineal trauma in our sample

As hialuronidases de peçonhas animais são capazes de clivar o hialuronan presente na matriz extracelular, facilitando a difusão das toxinas no tecido da vítima. Essas enzimas têm sido negligenciadas, devido à instabilidade enzimática e à baixa concentração na peçonha. Assim, a expressão heteróloga das hialuronidases permite a sua obtenção em quantidades que viabilizam seu estudo estrutural e funcional. Associado a isso, o transcriptoma propicia a identificação de novas toxinas e componentes de baixa proporção na peçonha. Portanto, o presente trabalho realizou o transcriptoma da glândula de peçonha do escorpião Tityus serrulatus e a clonagem e expressão heteróloga da hialuronidase. No transcriptoma foram obtidos 558 ESTs, dos quais 61,8% correspondem às toxinas, dentre elas neurotoxinas com ação em canais iônicos, metaloproteinas, hipotensinas, peptídeos antimicrobianos, dentre outros. Foram também identificadas novas toxinas como o neuropeptídeo e Ts16.1, descritos pela primeira vez para o gênero Tityus. Dentre os transcritos obtidos, foi identificado apenas um clone correspondente ao C-terminal incompleto de uma hialuronidase de T. serrulatus. Consequentemente, foi produzido o gene sintético contendo a sequência da TsHyal-1, obtida em bancos de dados, no vetor de expressão pPICZ?A para expressão heteróloga em P. pastoris. A rTsHyal-1 foi expressa em escala laboratorial em meio não suplementado (BMM) em pH 7,0 durante 96 h da indução com alimentação diária de metanol a 0,75%. A rTsHyal-1 foi produzida na sua forma solúvel e ativa (838,31 UTR/mg) e resultou em um rendimento proteico de 250 mg/L de material expresso. O secretoma do meio de expressão mostrou que além da rTsHyal-1, a P. pastoris também secreta proteínas nativas associadas à ligação do ATP, metabolismo de carboidrato e resposta ao estresse oxidativo. A rTsHyal-1 foi parcialmente purificada em troca catiônica fraca e apresentou atividade específica de 1.097,45 UTR/mg. A rTsHyal-1 apresenta massa molecular de 49,5 kDa e o tratamento com PNGase F seguido da análise por espectrometria de massas (MALDI-TOF) indicou que uma possível N-glicosilação de 4,5 kDa. Adicionalmente, o sequenciamento dos digestos trípticos da enzima realizado no MALDI-TOF e pelo Q-Exactive resultaram em 46,8% de cobertura da sequencia da proteína. A rTsHyal-1 apresenta especificidade pelo substrato hialuronan, seguido da condroitina C, A e B e apresentou atividade ótima em pH 6,0 e a 40°C. Adicionalmente, o ensaio do MTT indicou que a enzima recombinante não apresenta citotoxicidade in vitro. Os resultados obtidos determinaram as melhores condições para a expressão heteróloga da rTsHyal-1, que corresponde à primeira hialuronidase recombinante de escorpião expressa em P. pastoris com atividade enzimática preservada / The venom hyaluronidases of animals are able to cleave hyaluronan present in the extracellular matrix, acting as a spreading factor for the toxins into the tissues of the victim. These enzymes have been neglected due to their instability and low concentration in the venom. Thus, heterologous expression of hyaluronidases permits the obtainment of sufficient amount for structural and functional studies. Moreover, the transcriptome allows the identification of new toxins or components with low proportion in the venom. In this way, this study aimed the construction of the transcriptome of Tityus serrulatus venom gland and cloning/heterologous expression of hyaluronidase. In the transcriptome, 558 ESTs were identified and 61.8% corresponded to toxins, such as neurotoxins with action on ion channels, metalloproteins, hypotensins, antimicrobial peptides, among others. In addition, new toxins were identified, comprising one neuropeptide and Ts16.1, described for the first time to the genus Tityus. Among the obtained transcripts, one identified clone corresponded to an incomplete C-terminal of a hyaluronidase. Consequently, a synthetic gene was synthesized containing the sequence of TsHyal-1 (obtained from databases) in the pPICZ?A vector for heterologous expression in P. pastoris. The rTsHyal-1 was expressed at laboratorial scale in unsupplemented medium (BMM) at pH 7.0 for 96 h, after induction time, with daily feeding of 0.75% methanol. The rTsHyal-1 was produced in soluble and active form (838.31 UTR/mg) and resulted in a protein yield of 0,266 mg/mL in final expressed material. Besides, the secretome of the medium showed that P. pastoris also secretes native proteins bound with ATP, proteins related to carbohydrate metabolism and oxidative stress response. The rTsHyal-1 was partially purified in a weak cation exchange and presented specific activity of 1097.45 UTR/mg. The rTsHyal-1 has molecular mass of 49.5 kDa and the treatment with PNGase F and analysis by mass spectrometry (MALDI-TOF) indicated a potential N-glycosylation of 4.5 kDa. Additionally, the sequencing of tryptic digests performed in the MALDI-TOF and Q-Exactive resulted in 46.8% of protein sequence coverage. The rTsHyal-1 presents substrate specificity for hyaluronan followed by chondroitin C, A and B and showed an optimum activity at pH 6.0 and 40°C. Furthermore, the MTT assay indicated that the recombinant enzyme does not display in vitro cytotoxicity. These results validate the biotechnological process of the heterologous expression of rTsHyal-1. This is the first recombinant hyaluronidase from scorpions expressed in P. pastoris system with enzymatic activity preserved.

O Ácido Hialurônico, HA, é um dos principais componentes da matriz extracelular dos vertebrados. É um glicosaminoglicano hidrolisado pelas enzimas da família da Hialuronidase, envolvidas na regulação de importantes processos biológicos, como a permeabilidade vascular e a angiogênese. Conforme o interesse pelo desenvolvimento de uma rota de síntese para esta enzima, objetivamos a obtenção de um plasmídeo, contendo a sequência que codifica a variante 8 do gene Hyal-1. Para isto, planejou-se a inserção de dois sítios de restrição para a sub-clonagem, sítio dirigida, BamH-1 na região 5\' e Not-1 na 3\' na sequência do códon da Hyal-1. O inserto foi sub-clonado no plasmídeo, pET28-a, e transfectado para expressão em Escherichia coli Bl-21. A expressão foi induzida por IPTG no melhor tempo, de 4 horas, e a confirmação da expressão protéica foi realizada por Western blotting. Observou-se uma proteína de 45 kDa, confirmando a presença da Hyal-1. Realizou-se a expressão em 4 litros de cultura para obtenção de uma quantia suficiente para purificação em coluna de níquel-agarose. O rendimento neste experimento foi de 25&#181;g por litro. A rota sintética sugerida neste estudo mostrou-se eficiente para obtenção da proteína Hyal-1 recombinante, justificando futuros investimentos na otimização deste processo / Hyaluronic Acid, HA is a major component of the extracellular matrix of vertebrates. It is a glycosaminoglycan hydrolyzed by enzymes of the hyaluronidase family, involved in the regulation of important biological processes such as angiogenesis and vascular permeability. As interest in the development of a synthesis route for this enzyme, we aim to obtain a plasmid containing the coding sequence of the gene variant 8 Hyal-1. To obtain the plasmid insert was planned and two restriction sites for sub-cloning site directed at the 5\' Bam H-1 and 3\' Not-1 in codon sequence of Hyal-1. The insert was sub-cloned into plasmid pET28-a, and transfected for expression in Escherichia coli Bl-21. The expression was induced by IPTG in the best time of 4 hours and confirmation of protein expression was performed by Western blotting. There was a 45 kDa protein, thus confirming the presence of Hyal-1. Purification was performed on nickel-agarose column to obtain a larger amount of the protein, approximately 25&#181;g/L. The route suggested in this study was efficient attainment of Hyal-1 recombinant protein.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-08-03T12:34:03Z No. of bitstreams: 1 Roberio Silveira de Siqueira Filho.pdf: 1370952 bytes, checksum: a6124380b8ab4327bbe68bf362dbde38 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-03T12:34:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Roberio Silveira de Siqueira Filho.pdf: 1370952 bytes, checksum: a6124380b8ab4327bbe68bf362dbde38 (MD5) Previous issue date: 2015-12-21 / Among the regional anesthesia techniques, peribulbar block is becoming increasingly used for providing akinesia, with less risk of complications. Clonidine is a α₂ adrenoceptor agonist, commonly used as an adjuvant in retrobulbar, peribulbar and subtenon block in medicine, extending akinesia and analgesia. Hyaluronidase is an enzyme widely used as an adjuvant in orbital, which purpose is to facilitate the spreading of local anesthetic in the eye space. The objective of this study was to evaluate if the addition of clonidine and hyaluronidase associated with lidocaine 2% in peribulbar anesthesia, promotes sufficient block for accomplishment of cataract surgery. In the prospective study included 14 patients of both sexes, who were administered 1 ml of lidocaine 2% more hyaluronidase 25 UTR/ml, associated with 1,5 μg /kg of clonidine diluted in 0,5 ml of solution sodium chloride 0,9%. They were assessed before, during and after anesthesia: pupillary diameter, bulbar centralization period (PCB), motor block duration (PDM), mean arterial pressure, heart rate, respiratory rate, peripheral arterial oxygen saturation and dosage of glucose. It was observed that the PCB was 51 ± 12 seconds with PDM 108 ± 24 minutes with duration of surgery of 58,7 ± 16,4 minutes. In relation to the pupil diameter, statistically significant differences was observed when compared this parameter at the time before blocking with time after the block. It is concluded that clonidine (1,5 μg/kg) more hyaluronidase (25 UTR/ml), added with lidocaine 2% in peribulbar anesthesia in cataract surgery, promoted efficiently eyeball centralization on a short time, and cause increased pupil diameter and length of bulbar akinesia sufientes for performing cataract surgery, with IOP values within normal limits and with few adverse events. / Dentre as técnicas de anestesia regional, o bloqueio peribulbar vem se tornando cada vez mais utilizado por proporcionar acinesia, com menor risco de complicações. A clonidina é um agonista do receptor α₂ adrenérgico, frequentemente usado como adjuvante em bloqueios retrobulbar, peribulbar e subtenoniano na medicina, por prolongar a acinesia e analgesia. A hialuronidase é uma enzima bastante utilizada como adjuvante em bloqueios orbitais, cuja finalidade é facilitar a difusão do anestésico local no espaço ocular. Objetivou-se no presente estudo avaliar se o uso da clonidina e hialuronidase associada à lidocaína 2% na anestesia peribulbar em cães, promovem bloqueio e anestesia do bulbo ocular suficientes para a realização de cirurgia de catarata. No estudo prospectivo, foram incluídos 14 pacientes provenientes da casuística do Laboratório de Oftalmologia Experimental (LOE) do Hospital Veterinário da Universidade Federal Rural de Pernambuco (HOVET/UFRPE), de ambos os sexos, aos quais foram administrados, 1 mL de lidocaína 2% mais hialuronidase 25 UTR/ML, associada a 1,5 μg/kg de clonidina diluída em 0,5 mL de solução de cloreto de sódio a 0,9%. Foram avaliados na pré, trans e pós-anestesia: diâmetro pupilar, período de centralização bulbar (PCB), período de duração do bloqueio motor (PDM), pressão arterial média, frequência cardíaca, frequência respiratória, saturação arterial periférica de oxigênio e dosagem de glicose. Observou-se que o PCB foi de 51 ± 12 segundos, com PDM de 108± 24 minutos e tempo de cirurgia de 58,7± 16,4 minutos. Em relação ao diâmetro pupilar, ocorreu diferença estatística significativa, quando comparado este parâmetro no momento antes do bloqueio com o momento após o bloqueio. Conclui-se que a clonidina mais hialuronidase, adicionada à lidocaína 2% na anestesia peribulbar em cirurgia de catarata, promoveu de forma eficiente a centralização do globo ocular em um curto espaço de tempo, além de ocasionar aumento do diâmetro pupilar e tempo de acinesia bulbar sufientes para a realização de cirurgia de catarata, com valores de pressão intraocular (PIO) dentro da normalidade e com poucos eventos adversos.

Hialuronidases são responsáveis pela hidrólise de hialuronan, o principal componente da matriz intersticial. Estas enzimas são ubíquas nas peçonhas de serpentes, contudo suas concentrações e características podem variar entre as espécies. Embora estudos indiquem a presença de atividade hialuronidásica na peçonha de Crotalus durissus terrificus e a hialuronidase apresente importante papel no envenenamento local e sistêmico, a enzima ainda não havia sido estudada. Os objetivos deste trabalho focaram o isolamento e a caracterização funcional e estrutural da hialuronidase (CdtHya1) presente na peçonha de serpente Crotalus durissus terrificus. CdtHya1 foi purificada por cromatografia de troca iônica seguida de filtração molecular e interação hidrofóbica (recuperação proteica = 0,23%), consistindo no primeiro estudo de isolamento e caracterização de uma hialuronidase crotálica. Os 44 primeiros aminoácidos do seu N-terminal foram determinados por degradação de Edman e mostraram compartilhar um elevado grau de identidade sequencial com outras hialuronidases depositadas em bancos de dados. CdtHya1 é uma glicoproteína e apresentou atividade máxima a 37°C, pH 5,5 e na presença de NaCl 0,2 mol/L. Seu monômero de 64,5 kDa foi estimado por SDS-PAGE sob condições redutoras. A atividade específica da peçonha solúvel foi 145 unidades turbidimétricas reduzidas por miligrama (UTR/mg), contra 5.066 UTR/mg para CdtHya1. A enzima apresentou Kcat de 3.781,0 min-1 sobre hialuronan e em torno de 400 min-1 sobre os sulfatos de condroitina A, B e C, indicando maior atividade sobre hialuronan. Cátions divalentes (Ca2+ e Mg2+) e NaCl 1 mol/L reduzem significativamente a atividade enzimática. A enzima pura (32 UTR/40 ?L) diminuiu o edema provocado pela injeção subplantar de tampão, crotoxina ou fosfolipase A2 (PLA2), aumentando a difusão destes pelos tecidos dos camundongos. CdtHya1 potencializou a ação da crotoxina, como evidenciado pela morte de camundongos até o final do ensaio de edema de pata. A enzima nativa pura foi submetida a ensaios cristalográficos preliminares onde foram obtidos os primeiros cristais, constituindo assim um passo importante para a determinação da primeira estrutura tridimensional de hialuronidase de peçonha de serpente. Este estudo relata o procedimento de purificação da CdtHya1, a primeira hialuronidase isolada de peçonhas crotálicas com alta atividade antiedematogênica. / Hyaluronidases are responsible for hyaluronan hydrolysis, the major component of the interstitial matrix. These enzymes are ubiquitous in snake venoms, however their concentrations and characteristics may vary between species. Although studies indicate the presence of hyaluronidase activity in the Crotalus durissus terrificus venom and hyaluronidase presents important role in local and systemic envenoming, the enzyme has not been studied yet. The objectives of this study focused on the isolation and functional and structural characterization of hyaluronidase (CdtHya1) presents in Crotalus durissus terrificus snake venom. CdtHya1 was purified by ion exchange chromatography followed by molecular filtration and hydrophobic interaction (protein recovery = 0.23%), consisting in the first study on the isolation and characterization of a crotalic hyaluronidase. Its first 44 N-terminal amino acids were determined by Edman degradation and showed to share a high level of sequence identity against other hyaluronidases deposited in data banks. CdtHya1 is a glycoprotein and it showed maximum activity at 37 °C, pH 5.5 and in the presence of 0.2 mol/L NaCl. Its monomer of 64.5 kDa was estimated by SDS-PAGE under reducing conditions. The soluble venom specific activity was 145 turbidity reducing units per milligram (TRU/mg), against 5,066 TRU/mg for CdtHya1. The enzyme showed Kcat of 3,781.0 min-1 on hyaluronan and about 400 min-1 on chondroitin sulphates A, B or C, indicating higher activity on hyaluronan. Divalent cations (Ca2+ and Mg2+) and 1 mol/L NaCl significantly reduce the enzyme activity.The pure enzyme (32 TRU/40 ?L) decreased the edema caused by subplantar injections of buffer, crotoxin or phospholipase A2 (PLA2), increasing their diffusion through mice tissues. CdtHya1 potentiated crotoxin action, as evidenced by mice death by the end of the paw edema assay. The pure native enzyme was subjected to preliminary crystallographic studies where the first crystals were obtained, thus providing an important step in determining the first three-dimensional structure of hyaluronidase snake venom. This study reports the purification procedure of CdtHya1, the first hyaluronidase isolated from crotalic venoms with high antiedematogenic activity.

Hialuronidases são responsáveis pela hidrólise de hialuronan, o principal componente da matriz intersticial. Estas enzimas são ubíquas nas peçonhas de serpentes, contudo suas concentrações e características podem variar entre as espécies. Embora estudos indiquem a presença de atividade hialuronidásica na peçonha de Crotalus durissus terrificus e a hialuronidase apresente importante papel no envenenamento local e sistêmico, a enzima ainda não havia sido estudada. Os objetivos deste trabalho focaram o isolamento e a caracterização funcional e estrutural da hialuronidase (CdtHya1) presente na peçonha de serpente Crotalus durissus terrificus. CdtHya1 foi purificada por cromatografia de troca iônica seguida de filtração molecular e interação hidrofóbica (recuperação proteica = 0,23%), consistindo no primeiro estudo de isolamento e caracterização de uma hialuronidase crotálica. Os 44 primeiros aminoácidos do seu N-terminal foram determinados por degradação de Edman e mostraram compartilhar um elevado grau de identidade sequencial com outras hialuronidases depositadas em bancos de dados. CdtHya1 é uma glicoproteína e apresentou atividade máxima a 37°C, pH 5,5 e na presença de NaCl 0,2 mol/L. Seu monômero de 64,5 kDa foi estimado por SDS-PAGE sob condições redutoras. A atividade específica da peçonha solúvel foi 145 unidades turbidimétricas reduzidas por miligrama (UTR/mg), contra 5.066 UTR/mg para CdtHya1. A enzima apresentou Kcat de 3.781,0 min-1 sobre hialuronan e em torno de 400 min-1 sobre os sulfatos de condroitina A, B e C, indicando maior atividade sobre hialuronan. Cátions divalentes (Ca2+ e Mg2+) e NaCl 1 mol/L reduzem significativamente a atividade enzimática. A enzima pura (32 UTR/40 ?L) diminuiu o edema provocado pela injeção subplantar de tampão, crotoxina ou fosfolipase A2 (PLA2), aumentando a difusão destes pelos tecidos dos camundongos. CdtHya1 potencializou a ação da crotoxina, como evidenciado pela morte de camundongos até o final do ensaio de edema de pata. A enzima nativa pura foi submetida a ensaios cristalográficos preliminares onde foram obtidos os primeiros cristais, constituindo assim um passo importante para a determinação da primeira estrutura tridimensional de hialuronidase de peçonha de serpente. Este estudo relata o procedimento de purificação da CdtHya1, a primeira hialuronidase isolada de peçonhas crotálicas com alta atividade antiedematogênica. / Hyaluronidases are responsible for hyaluronan hydrolysis, the major component of the interstitial matrix. These enzymes are ubiquitous in snake venoms, however their concentrations and characteristics may vary between species. Although studies indicate the presence of hyaluronidase activity in the Crotalus durissus terrificus venom and hyaluronidase presents important role in local and systemic envenoming, the enzyme has not been studied yet. The objectives of this study focused on the isolation and functional and structural characterization of hyaluronidase (CdtHya1) presents in Crotalus durissus terrificus snake venom. CdtHya1 was purified by ion exchange chromatography followed by molecular filtration and hydrophobic interaction (protein recovery = 0.23%), consisting in the first study on the isolation and characterization of a crotalic hyaluronidase. Its first 44 N-terminal amino acids were determined by Edman degradation and showed to share a high level of sequence identity against other hyaluronidases deposited in data banks. CdtHya1 is a glycoprotein and it showed maximum activity at 37 °C, pH 5.5 and in the presence of 0.2 mol/L NaCl. Its monomer of 64.5 kDa was estimated by SDS-PAGE under reducing conditions. The soluble venom specific activity was 145 turbidity reducing units per milligram (TRU/mg), against 5,066 TRU/mg for CdtHya1. The enzyme showed Kcat of 3,781.0 min-1 on hyaluronan and about 400 min-1 on chondroitin sulphates A, B or C, indicating higher activity on hyaluronan. Divalent cations (Ca2+ and Mg2+) and 1 mol/L NaCl significantly reduce the enzyme activity.The pure enzyme (32 TRU/40 ?L) decreased the edema caused by subplantar injections of buffer, crotoxin or phospholipase A2 (PLA2), increasing their diffusion through mice tissues. CdtHya1 potentiated crotoxin action, as evidenced by mice death by the end of the paw edema assay. The pure native enzyme was subjected to preliminary crystallographic studies where the first crystals were obtained, thus providing an important step in determining the first three-dimensional structure of hyaluronidase snake venom. This study reports the purification procedure of CdtHya1, the first hyaluronidase isolated from crotalic venoms with high antiedematogenic activity.