El advenimiento de instrumentos comerciales de cromatografía de gasescon columnas capilares de alta resolución interfasados con espcctrómetros de masas pennite hoy en día la detección e identificación de diversos componen-tes presentes en solo partes por billón en mezclas de suma complejidad. Esteha sido el método elegido para el estudio de las sustancias orgánicasprovenientes de diversas actividades antropogénicas, que se adhieren a las partí-culas de polvo presentes en el aire que respiramos. De estas sustancias orgáni-cas, las que han atraído el mayor interés de los científicos dedicados a resguar-dar el medio ambiente son los hidrocarburos aromáticos policíclicos nitrados(HAPN), debido a que entre ellos se encuentran los más potentes carcinógenosy mutágenos / The reaction mechanism of polyciclic aromatic hydrocarbonsand nitrogen dioxide in solvents of low polarity in vol ves free radicals. The re-action products obtained under these conditions are similar to those found inambient air sarnples, suggesting a common reaction mechanism.

Doctora en Química / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo en el Portal de tesis, hasta enero de 2017 / Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) son una familia de más de 100 compuestos orgánicos; presentan al menos dos anillos aromáticos fusionados y son derivados principalmente de la combustión incompleta de biomasa y combustibles fósiles. Son ubicuos y su formación, fuentes y depositación son ampliamente estudiadas. En este contexto, es muy relevante su control en muestras ambientales. La presencia de los HAPs en diferentes matrices de Antártica y Groenlandia (suelos, sedimentos, nieve y agua de mar) ha sido detectada en niveles muy bajos de concentración. Debido a los niveles del orden de ultratrazas de estos compuestos en matrices acuosas de zonas remotas, las etapas de extracción y pre-concentración son requeridas previo a su determinación analítica. La extracción homogénea líquido-líquido (HLLE) constituye un método promisorio en cuanto a exactitud y precisión y presenta una serie de ventajas de tipo práctico (simple, tiempos cortos de extracción, bajo costo y uso de pequeños volúmenes de solvente) y entre ellas destaca la posibilidad de usar pequeños volúmenes de muestra, como los obtenidos en sistemas de fusión en continuo con muestreo discreto de testigos de hielo; dichas muestras son homogéneas y permiten obtener alta resolución temporal para el estudio de composición química en testigos de hielo. El objetivo de esta investigación fue desarrollar una metodología analítica basada en HLLE apropiada para el estudio de hidrocarburos aromáticos policíclicos en muestras acuosas prístinas obtenidas desde un testigo de hielo de Antártica. En HLLE los analitos son extraídos desde una solución homogénea en un pequeño volumen de fase sedimentada, formada por el fenómeno de separación de fases, en un sistema de componentes ternarios. La metodología de extracción se desarrolló y optimizó mediante técnicas de diseño multivariado utilizando cromatografía líquida de alta eficiencia con detección de arreglo de diodos (HPLC-DAD) para, posteriormente, validar el método de determinación de los compuestos por cromatografía líquida de alta eficiencia con detección de fluorescencia (HPLC-FLD), a fin de obtener límites de detección y cuantificación apropiados, de acuerdo a los niveles de concentración esperados en las muestras. La extracción desde muestras acuosas muy diluidas se realizó por adición de una mezcla de cloroformo y metanol y agitación manual por 30 segundos. La separación de fases fue por adición de NaCl, recuperándose el extracto (fase sedimentada) por centrifugación. Aplicando un diseño factorial a tres niveles con tres factores (33) se establecieron las condiciones óptimas de extracción y determinación simultánea para naftaleno, fenantreno, antraceno, benzo[k]fluoranteno, benzo[b]fluoranteno acenaftileno, fluoreno, fluoranteno, benzo[a]pireno (BaP), benzo[g,h,i]perileno, dibenzo[a,h]antraceno, indeno[1,2,3-c,d]pireno, (BghiP) acenafteno, pireno y criseno. Las condiciones óptimasde extracción fueron: 10% m/v de NaCl, 1,2 mL de CH3OH y 120 μL de CHCl3 (solvente extractante) para 3,5 mL de muestra. Los factores de enriquecimiento logrados fluctuaron entre 32 y 43 en el intervalo 8-50 ng mL-1 para la metodología HLLE-HPLC-DAD y desde 34 a 49 en el intervalo 0,03-0,11 ng mL-1 para HLLE-HPLC-FLD. Las recuperaciones de los HAPs bajo las condiciones óptimas a niveles de concentración de 20 ng mL-1 fluctuaron entre 67 y 92%, con desviaciones estándar relativas entre 0,7 y 5,1 %. Para la detección por fluorescencia las recuperaciones variaron entre 71 y 99 % en el intervalo de concentraciones de 0,048-0,130 ng mL-1, con desviaciones estándar relativas entre 1,1 y 9,9%. Para HLLE-HPLC-FLD la sensibilidad analítica/ límites de detección/ límites de cuantificación estuvieron entre 0,0078/ 0,0203/ 0,0676 ng mL-1 para fluoranteno y 0,0006/ 0,0015/ 0,0051 ng mL-1 para antarceno. Un comportamiento lineal para la extracción fue establecido, con valores de R2 entre 0,9654 para fluoranteno y 0,9998 para antraceno. La aplicación de HLLE-HPLC-FLD en muestras acuosas prístinas, correspondientes a secciones de un testigo de hielo, permitió la detección y cuantificación en el orden de los pg mL-1 de la mayoría de los analitos (menos BaA y coroneno) en las muestras, encontrándose diferencias a diferentes profundidades al considerar el total de HAPs estudiados. / Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are a family of over 100 organic compounds, having at least two fused aromatic rings. They are derived mainly from the incomplete combustion of fossil fuel and biomass. PAHs are ubiquitous and their formation, sources and fate have been extensively reviewed. In this context their control on environmental samples is highly relevant. The presence of PAHs in various matrices in Antarctica and Greenland (soil, sediment, snow and sea water) has been detected at very low concentrations levels. According to the ultra-trace levels in aqueous matrices from remote areas an extraction and pre-concentration step, prior to the analytical determination is required. Homogeneous liquid–liquid extraction (HLLE) is a promising method for the determination of organic compounds in aqueous matrices because of its accuracy and precision. In addition it presents several practical advantages (simple, with short extraction times, low cost and use of small volumes of solvent). This technique allows using small sample volumes, such as those attained from continuous ice core melter system with discrete sampling for different chemical analysis. These samples are homogeneous and provide a high temporal resolution for the study of ice core chemical composition. The objective of this research was to develop an analytical methodology based on HLLE appropriate for the study of polycyclic aromatic hydrocarbons in pristine aqueous samples obtained from an ice core of Antarctic. In HLLE analytes are extracted from a homogeneous solution in a small volume of sedimented phase formed by a phase separation phenomenon in a ternary component system. The extraction methodology was developed and optimized using multivariate design by using high-performance liquid chromatography with diode array detection (HPLC-DAD) for the analytical determination of PAHs. In a second stage the method was validated for the determination of compounds by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection (HPLC-FLD) in order to achieve the appropriate limits of detection (LODs) and quantification (LOQs) according to the possible concentration levels of samples. The extraction from very dilute aqueous samples was performed by adding a mixture of chloroform and methanol and manual shaking for 30 seconds. Phase separation was performed by adding NaCl and the extract (sedimented phase) was recovered by centrifugation. The optimization was carried out by applying a three-level factorial design with three factors (33) for the simultaneous extraction and analytical determination of 15 PAHs from water samples: naphthalene, phenanthrene, anthracene, acenaphthylene, fluorene, fluoranthene, benzo[k]fluoranthene, benzo[b]fluoranthene benzo[a]pyrene, acenaphthene, benzo[g,h,i]perylene, chrysene, pyrene, dibenzo[a,h]anthracene and indeno [1,2,3-c,d] pyrene. Optimal conditions were: 10% w/v of NaCl, 1.2 mL of CH3OH and 120 μL of CHCl3 (extracting solvent) for 3.5 mL of sample. The enrichment factors obtained were between 32 and 43 in the range 8-50 ng mL-1 for the HLLE-HPLC-DAD methodology and from 34 to 49 in the range 0.03-0.11 ng mL-1 for HLLE-HPLC-FLD. Recoveries under optimal conditions for a PAHs concentration levels of 20 ng mL-1 varied between 67 and 92% with a relative standard deviation between 0.7 and 5.1 %. For fluorescence detection mean recoveries were 71-99 % in the concentration range 0.048 -0.13 ng mL-1, with a relative standard deviation of 1.1-9.9% Analytical sensitivity/detection limit and quantification limits for the whole method varied between 0.0078/ 0.0203/ 0.0676 ng mL-1 for fluoranthene and 0.0006/ 0.0015/ 0.0051 ng mL-1 for anthracene. A linear behavior for the extraction method was established with R2 values between 0.9654 for fluoranthene and 0.9998 for anthracene. The application of HLLE-HPLC-FLD to aqueous pristine samples from ice core sections allowed the detection and quantification in the order of pg mL-1, of most analytes (less coronene and BaA) in samples. Significant differences were found at different depths when the total PAHs under study were considered. / Conicyt

Memoria para optar al título de Químico / Los Hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) son un grupo de compuestos orgánicos constituidos por 2 o más anillos aromáticos simples unidos, que no contienen heteroátomos ni otros sustituyentes. Generan diversos daños a la salud debido a su carácter cancerígeno y mutagénico. Considerando su carácter lipofílico los HAPs pueden acumularse en grasas y en los tejidos vegetales con una alta persistencia. Por esto los podemos ingerir indirectamente al incluir en nuestra dieta alimentos ricos en grasas o aceites como es el caso de los aceites vegetales. Las técnicas más ampliamente utilizadas para determinar las concentraciones de los HAPs en aceites han sido la cromatografía líquida de alta eficiencia asociada a detección por fluorescencia o espectrometría de masas. Sin embargo, al utilizar HPLC los tiempos de análisis y de preparación de muestra ocupan un tiempo considerable. Es un método relativamente costoso tanto en equipamiento de la técnica y en análisis. Una alternativa a estos métodos son aquellos basados en espectroscopía de fluorescencia, principalmente por su menor costo y rapidez. La relevancia de estos métodos ha sido limitada por su falta de selectividad, especialmente cuando compuestos similares deben ser analizados en matrices complejas. Una forma de alcanzar una mayor selectividad analítica es asociar la espectroscopía de fluorescencia con diferentes métodos quimiométricos de análisis de datos, constituyendo un método de calibración multivariado. En trabajos recientes, realizados en el laboratorio donde se desarrolló la presente tesis, se ha propuesto una extracción líquido-líquido asistida por microondas (MAE) asociada a extracción en fase sólida con sílica (SPE) como etapa de preparación de los aceites, previa a la cuantificación por espectroscopía de fluorescencia y calibración multivariada. En el presente estudio se utilizó la espectroscopía de fluorescencia asociada a calibración multivariada de segundo orden (U-PLS/RBL) para determinar un grupo de siete HAPs (Figuras 1-7: benzo[a]antraceno (BaA), benzo[b]fluoranteno (BbF), benzo[k]fluoranteno (BkF), benzo[a]pireno (BaP), indeno [1,2,3–c,d]-pyreno (IP), dibenzo[a,h]antraceno (DBahA) y benzo[g,h,i]perileno (BghiP). Se realizó una etapa de calibrado con mezclas de los estándares de los siete compuestos de interés preparados en solventes seleccionados, encontrando el intervalo espectral óptimo y el número óptimo de factores para cada HAPs. Se validó con un conjunto preparado en solvente, los valores obtenidos para el error relativo de predicción (REP) (entre 4,8% y 25,2% para BaP y BghiP) y la raíz de error cuadrado medio de predicción (RMSEP) (entre 0,03 ng mL-1 para BkF y 0,88 ng mL-1 para BghiP) se consideraron bajos por lo que las predicciones fueron satisfactorias. La capacidad predictiva del modelo de calibración U-PLS/RBL fue evaluada utilizando muestras de aceite fortificadas con los siete compuestos desde el inicio del proceso obteniendo altos valores de REP y RMSEP. Con el objetivo de incrementar la selectividad y así mejorar la capacidad predictiva disminuyendo los parámetros anteriores, tanto las matrices de excitación emisión (EEMs) del grupo de validación preparado en matriz así como los del conjunto de calibrado fueron derivados y usados para predecir las concentraciones de los HAPs. Otra de las medidas tomadas para mejorar la capacidad predictiva fue que al tratamiento de muestra (MAE-SPE) se le incorporó la precipitación de aceite co-extraído por disminución de temperatura logrando bajar la carga de algunos de los interferentes, que perjudican el análisis y así obtener mejores resultados en la predicción. Se preparó un nuevo grupo de muestras en duplicado fortificadas desde el comienzo del proceso, tratadas con MAE-precipitación de aceite co-extraído- SPE y analizadas mediante HPLC-FLD como método de referencia. Las recuperaciones promedio determinadas mediante HPLC-FLD estuvieron entre un 55 y 79%, no encontrándose diferencias significativas con los valores determinados mediante U-PLS/RBL para BbF, BkF, BaP, BghiP, DBahA e IP. Además, se estableció que los HAPs son estables al menos por dos meses en los extractos finales obtenidos luego del proceso de extracción; puesto que presentaron concentraciones semejantes entre ambos grupos duplicados, aun cuando uno de ellos se analizó después del tiempo señalado.El método propuesto fue aplicado a 15 aceites de oliva virgen comerciales, en uno solo de ellos se detectaron concentraciones por sobre el límite de detección (LOD) para BaA 1,62 ng g-1 y BghiP 1,88 ng g-1 dando un total de 3,5 ng g-1 de HAPs. A pesar de esto, ambos HAPs se encuentran bajo los límites máximos permitidos por la legislación Europea. Por último para investigar si al ser calentado el aceite de oliva en presencia de materia orgánica durante 24 horas, surgen modificaciones del perfil de concentraciones de dos HAPs modelo (BaA e IP), se aplicó el método MAE precipitación de aceite co-extraído SPE. El estudio mostró posibles fenómenos de sorción de los compuestos por la materia orgánica que varían en el tiempo / The Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) are a group of organic compound composed of 2 or more simple aromatic rings joined together, which contain neither heteroatoms nor others sustituents. They generate several health problems due to their carcinogenic and mutagenic nature. Considering their lipophilic nature, the PAHs can gather together in fat and vegetal tissues with a high persistence. For this reason we can ingest them indirectly when including fatty food or oils as in the case of vegetal oils. The techniques thoroughly used in order to determine the PAHs concentrations in oils have been the high efficiency liquid chromatography associated to detection by fluorescence or mass spectrometry. Nevertheless, HPLC analysis and the previous sample preparation take a considerable time. Moreover, is a relatively expensive method not only in the technique equipment, but also in the analysis. As alternative to these methods are those based on fluorescence spectroscopy, mainly because of its low cost and rapidity. The relevance of these methods has been limited by its lack of selectivity, specially when similar compounds must be analyzed in complex matrix. One way of achieving a bigger analytical selectivity is associating the fluorescence spectroscopy with different chemometrics methods of data analysis, constituting a multivaried calibration method. In recent research, carried out in the laboratory where this thesis was developed, it has been proposed a liquid-liquid microwave-assisted extraction (MAE) associated to silica-based solid phase extraction (SPE) as preparation phase of oils, prior to the quantification by fluerescence spectroscopy and multivaried calibration. In the present study it was used the fluorescence spectroscopy associated to a second order multivaried calibration (U-PLS/RBL) so as to determine a group of seven PAHs (Figures 1-7: benzo[a]anthracene (BaA), benzo[b]fluoranthene (BbF), benzo[k]fluoranthene (BkF), benzo[a]pyrene (BaP), indeno [1,2,3–c,d]- pyrene (IP), dibenzo[a,h]anthracene (DBahA) and benzo[g,h,i]pyrelene (BghiP). It was carried out a calibrated phase with mixture of the seven compounds of interest prepared in solvent, finding the optimal spectrum interval and the optimal number of factors for each PAHs. It was validated with a set prepared in solvent, the values obtained for the relative-error prediction (REP) (between 4,8% and 25,2% for BaP y BghiP) and the root of the mean squared error of prediction (RMSEP) (between 0,03 ng mL-1 for BkF and 0,88 ng mL-1 for BghiP) were low so the predictions were satisfactory. The predictive capacity of the calibration model U-PLS/RBL was evaluated using fortified oil samples with the seven compounds from the beginning of the process obtaining high values of REP and RMSEP. With the purpose of increasing the selectivity and, in that way, also improving the predictive capacity reducing the previous parameters, not only the Emission Excitation Matrix (EEMs) of the validation group prepared in matrix, but also those from the calibration set were derived and used in order to predict the HAPs concentrations. Another measure taken in order to improve the predictive capacity was incorporating to the sample treatment (MAE-SPE) the precipitation of co-extracted oil throught temperature reduction lowering the charge of some of the interferents. It was prepared a new duplicated sample group fortified from the beginning of the process, treated with MAE- low temperature precipitation-SPE and analyzed through HPLC-FLD as reference method. The average recoveries determined by HPLC-FLD fluctuated between 55 and 79%, finding no significant differences with the determined values through U-PLS/RBL for BbF, BkF, BaP, BghiP, DBahA and IP. Furthermore, it was established that HAPs are steady at least for two months in the final extracts obtained after the extraction process; due to the fact that they presented similar concentrations between both duplicated groups, even though one of them was analized after the indicated period of time. The proposed method was applied to 15 commercial virgin olive oils, only in one of them were detected concentrations over the limit of detection (LOD) for BaA 1,62 ng g-1 and BghiP 1,88 ng g-1 revealing a total of 3,5 ng g-1 of HAPs. In despite of this, both HAPs are under the maximum limits allowed by the European legislation. Lastly, the method was applied to evaluate possible change of the profile of two selected PAHs (BaP and IP) in olive oil heated up in presence of organic matter for 24 hours. The study showed possible sorption phenomena of the compounds on the organic matter depending on time / FONDECYT

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Los ambientes costeros mundiales están experimentando un incremento de presión antrópica, que incluye el vertido de desechos industriales y urbanos (muchos de ellos sin ningún tratamiento previo), el aumento de concentraciones de sustancias perjudiciales, los dragados periódicos en los puertos, la ocupación de terrenos intermareales y submareales, entre otros. Entre los compuestos potencialmente contaminantes se encuentran los Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (PAHs, del inglés, Polycyclic aromatic hydrocarbons). Se conocen más de 1000 PAHs, pero a nivel ambiental, sólo un pequeño grupo de estos compuestos adquiere importancia. Los PAHs son tóxicos, persistentes, bioacumulables y tienen la capacidad de ser transportados a través del aire y depositados a largas distancias, causando efectos negativos sobre la salud y el medio ambiente tanto cerca como lejos de su fuente emisora; por esto, comúnmente son incluidos dentro de la categoría de compuestos orgánicos persistentes (COPs). A pesar de que pueden tener origen natural, se considera que la principal fuente de liberación de los PAHs en el medio ambiente son las actividades antropogénicas. Frente a este problema, el objetivo general del presente trabajo de tesis doctoral es estudiar, monitorear e integrar el conocimiento del estado de impacto, flujo y transferencia de PAHs a los compartimentos bióticos. Para ello se obtuvieron muestras de sedimentos superficiales y moluscos bivalvos autóctonos (mejillín, Brachidontes rodriguezii) en diversos sitios de muestreo del Estuario de Bahía Blanca, en las cuales se analizó la presencia de 17 PAHs de interés toxicológico-ambiental. Los resultados obtenidos mostraron que los PAHs se acumulan tanto en sedimentos como en bivalvos para el área de estudio. Las concentraciones halladas permitieron clasificar la zona con niveles moderados de contaminación en relación a otros sitios costeros similares alrededor del mundo. Los máximos valores de PAHs para ambas matrices fueron registrados en inmediaciones del área portuaria industrial, mostrando una tendencia general decreciente a medida que aumentó la distancia a los sitios industriales o más densamente poblados. Por último, se identificaron orígenes mixtos de PAHs para ambas matrices, destacándose los procesos pirolíticos por sobre los petrógenicos. / Global coastal environments are supporting an increased human pressure, including industrial and urban discharges (many of them without adequate treatment), increased concentrations of hazardous substances, periodic dredging in ports, and occupation of intertidal and subtidal lands, among others. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) are a large group of compounds (more than 1000), but only a small group of these compounds are of environmental importance. PAHs are a unique class of persistent organic pollutants (POPs) due to their persistence, toxicity, ability to bioaccumulate, long-range transport properties, and adverse effects on environmental and human health. Anthropogenic activities are generally considered the major source of PAHs release into the environment, even though they may have natural origins. In view of this, the main objective of this Ph. D. Thesis is to study, monitor and integrate knowledge of the state of impact, flow and transfer of PAHs to biotic compartments. Following the mentioned objective, surface sediment samples and native bivalves (Mussel, Brachidontes rodriguezii) were collected from the Bahía Blanca Estuary and the presences of 17 PAHs were analyzed. The results showed that PAHs accumulates in both sediments and bivalves within the study area. The concentrations found allowed to classify the area as with moderate levels of contamination in relation to other similar coastal sites around the world. The maximum levels of PAHs were found in the vicinity of the port-industrial area and concentrations of PAHs appeared to decrease as the distance from the urban/industrial core increased. Finally, in both sediment and mussel, mixed PAHs sources were identified, with a slight imposition of pyrolytic over the petrogenic inputs.

Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs), algunos de ellos tóxicos y mutagénicos, son compuestos hidrofóbicos altamente persistentes en el ambiente. Estudios previos realizados en la región Costera Patagónica, particularmente en un sitio crónicamente contaminado con hidrocarburos en Bahía Ushuaia, demostraron un alto potencial para la degradación microbiana de estos compuestos. Sin embargo, estos estudios sólo se orientaron al análisis de fragmentos de genes codificantes para enzimas oxigenasas de anillos aromáticos involucradas en el primer paso de la degración de HAPs. Con el objetivo de conocer la relevancia ecológica de los microorganismos con capacidad de degradar HAPs en este ambiente y revelar los mecanismos que utilizan para ello, en el presente trabajo se emplearon diferentes técnicas independientes del cultivo de microorganismos. La construcción y análisis de una biblioteca metagenómica en fósmidos permitió identificar fragmentos de ADN pertenecientes a microorganismos del phylum Proteobacteria, dos de los cuales podrían provenir de miembros estables de la comunidad microbiana altamente especializados en la degradación de compuestos aromáticos. Asimismo, se detectaron genes completos codificantes para enzimas de la vía alta de degradación de HAPs y de la vía baja de degradación por gentisato y catecol, sugiriendo que las poblaciones degradadoras de los sedimentos intermareales de Bahía Ushuaia utilizan diferentes rutas degradativas para el metabolismo de estos compuestos. Entre estos genes, aquellos codificantes para enzimas oxigenasas de clase A y extradiol dioxigenasas representan potenciales marcadores funcionales para el estudio de la abundancia y dinámica de los microorganismos degradadores de hidrocarburos aromáticos.

Los hidrocarburos constituyen una de las principales amenazas para el ecosistema costero de la Patagonia. A pesar de ello, aún existe un gran desconocimiento sobre cuáles son los microorganismos que poseen el potencial para degradar hidrocarburos en este ambiente. Esta Tesis fue desarrollada con el objetivo de incrementar nuestros conocimientos sobre las poblaciones bacterianas ecológicamente relevantes para la biodegradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) en sedimentos costeros con un alto grado de exposición a la contaminación con estos compuestos. Para ello, se empleó un enfoque multidisciplinario que involucró la determinación de variables fisicoquímicas y ambientales de los sitios de estudio, como así también la aplicación de distintas herramientas moleculares independientes del cultivo de microorganismos, la mayoría de ellas diseñadas para este estudio. La estructura y diversidad de las comunidades bacterianas que habitan los sedimentos intermareales contaminados con hidrocarburos de las zonas norte-centro y sur de Patagonia fue analizada en profundidad por medio de la pirosecuenciación de fragmentos del gen ARNr 16S bacterianos amplificados a partir de ADN purificado de los sedimentos. Este análisis nos permitió además estimar la diversidad y abundancia relativa de las poblaciones bacterianas de estos ambientes que podrían presentar el potencial para degradar hidrocarburos. Por otro lado, los genes que codifican enzimas dioxigenasas de HAPs, las cuales participan en el primer paso de la degradación aeróbica de estos compuestos, fueron utilizados como marcadores funcionales. La abundancia relativa de siete variantes de estos genes en sedimentos de las zonas norte-centro y sur de Patagonia se cuantificó por PCR cuantitativa (qPCR), lo cual nos permitió evaluar la relevancia ecológica de las poblaciones que llevan estos genes y su distribución biogeográfica. Los genes de oxigenasas B, C y D, variantes recientemente identificadas en sedimentos de Bahía Ushuaia, se encontraron en altas abundancias a lo largo de seis años de muestreo en los sedimentos subantárticos, sugiriendo que las bacterias que portan estos genes probablemente presenten un rol clave en la biodegradación de HAPs en este ambiente marino. Además, los genes phnA1, identificados en Cycloclasticus spp., se detectaron en nueve de las once muestras analizadas pertenecientes a dos regiones biogeográficas, y su abundancia se vio positivamente correlacionada con la concentración de fenantreno, HAPs de tres anillos y HAPs de bajo peso molecular. Estos resultados sugirieren que bacterias del género Cycloclasticus podrían presentar un rol importante en la biodegradación de HAPs de bajo peso molecular en sedimentos de la costa Patagónica. Finalmente, se detectaron 14 variantes novedosas de genes de oxigenasas en los sedimentos de Bahía Ushuaia, utilizando cebadores diseñados en base a secuencias de genes de dioxigenasas de bacterias Gram-positivas.biodegradación de HAPs de bajo peso molecular en sedimentos de la costa Patagónica. Finalmente, se detectaron 14 variantes novedosas de genes de oxigenasas en los sedimentos de Bahía Ushuaia, utilizando cebadores diseñados en base a secuencias de genes de dioxigenasas de bacterias Gram-positivas. Los resultados obtenidos en esta Tesis muestran la existencia de una diversidad de poblaciones bacterianas con capacidad para degradar HAPs en sedimentos de la costa Patagónica, en particular en sedimentos Subantárticos, y sugieren la existencia de genes de dioxigenasas aún no identificados. Se observaron importantes diferencias en las abundancias de dichas poblaciones microbianas, tanto en el tiempo como en el espacio. / Hydrocarbons constitute one of the main threats to the coastal ecosystem of Patagonia. In spite of this, there is still great uncertainty about which local microorganisms have the potential to degrade hydrocarbons. The goal of this Thesis was to increase our knowledge about the bacterial populations that are ecologically relevant to polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) biodegradation in coastal sediments that are highly exposed to hydrocarbon contamination. To reach this goal, a multidisciplinary approach involving the assessment of physicochemical and environmental variables from the study sites was used. In addition, different culture-independent molecular tools were applied, most of which were designed in this study. On the one hand, the structure and diversity of the bacterial communities that inhabit hydrocarbon-contaminated intertidal sediments from North-central and South Patagonia were analyzed in depth by pyrosequencing bacterial 16S rRNA gene fragments. These fragments were previously amplified from DNA which was purified from sediment samples. In addition, this analysis allowed us to estimate the diversity and relative abundance of bacterial populations in these environments that are capable of degrading hydrocarbons. On the other hand, the genes encoding PAH-dioxygenase enzymes, which are involved in the first step of the aerobic degradation of these compounds, were used as functional markers. The relative abundance of seven variants of these genes in sediments from North-central and South Patagonia was quantified in this Thesis by quantitative PCR (qPCR). This allowed us to analyze the ecological relevance of populations carrying these genes and their biogeographical distribution. Oxygenase gene variants B, C and D, recently identified in sediments from Ushuaia Bay, were highly abundant during a six-year time span in these subantarctic sediments. This suggests that bacteria carrying these genes could play a key role in PAH biodegradation in this marine environment. Additionally, phnA1 genes identified in Cycloclasticus spp. were detected in nine out of eleven samples from two biogeographic regions. Their abundance was found to be positively correlated with the concentration of phenanthrene, three-ring PAHs and low molecular weight PAHs. These results suggest that Cycloclasticus spp. could play an important role in low molecular weight-PAH biodegradation in coastal sediments from Patagonia. Finally, 14 novel oxygenase gene variants were detected in coastal sediments from Ushuaia Bay, using a primer set designed targeting dioxygenase gene sequences from Gram-positive bacteria. The results obtained in this Thesis show that coastal sediments from Patagonia, particularly from subantarctic sediments, hold a great diversity of bacterial populations capable of degrading PAHs, and suggest the existence of hitherto unidentified dioxygenase genes. Differences in time and space were observed in the abundances of these microbial populations.

Magíster en Bioquímica área de especialización Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento hasta enero de 2019 / La Antártica es el continente más austral de la tierra, contiene cerca del 80% de las reservas de agua dulce del planeta y presenta una serie de condiciones extremas, como bajas temperaturas y alta radiación ultravioleta. A pesar de esto, el hombre ha sido capaz de sobrevivir en la región y realizar actividades científicas y de explotación durante más de 80 años. Como consecuencia, las distintas zonas habitadas han sufrido contaminación, principalmente asociada a diesel. Este compuesto es nocivo, ya que presenta una gran cantidad de moléculas orgánicas como hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) y compuestos inorgánicos como metales pesados (Cd, Cr y Pb). La descontaminación de HAPs se puede llevar a cabo mediante procesos físicos, químicos y biológicos. Los procesos biológicos representan una opción ecológica, económica y segura, que involucra una menor alteración de los suelos y en consecuencia constituye una excelente alternativa para la descontaminación del territorio Antártico. A la fecha, se ha reportado un gran número de bacterias capaces de degradar HAPs. Sin embargo, debido al Tratado Antártico no está permitido ingresar microorganismos o ADN foráneo al continente, por lo que se hace vital encontrar bacterias nativas que puedan ser usadas en la biorremediación de diesel en Antártica. Debido a su mayor solubilidad en agua, menor toxicidad para el humano y similitud estructural con otros HAPs, el compuesto que se utiliza como modelo para aislar y estudiar microorganismos degradadores de HAPs es el fenantreno. En base a lo expuesto, se planteó la hipótesis: “La presencia de hidrocarburos aromáticos policíclicos y metales pesados en suelos antárticos ha favorecido el desarrollo de bacterias degradadoras de fenantreno resistentes a metales”. El objetivo general de este trabajo fue aislar y caracterizar bacterias antárticas resistentes a metales pesados (Cd, Cr y Pb) y evaluar su capacidad de metabolizar fenantreno. Para esto se utilizó muestras de suelo antártico obtenido de distintas zonas expuestas y no expuestas a diesel, las cuales fueron caracterizadas química y biológicamente. Además, se aisló y caracterizó bacterias degradadoras de fenantreno resistentes a metales y se estudiaron los procesos asociados a la degradación de fenantreno. Durante este trabajo de tesis se utilizó muestras de suelo obtenidas de la 49° Expedición Científica Antártico (ECA 49°): 4 muestras de suelos no expuestos a diesel (A0, B4, C3 y C8) y 4 muestras de suelos expuestos a diesel (D3, D4, E2 y E4). El análisis del suelo determinó la presencia de HAPs en los suelos expuestos a diesel, en promedio 1000 veces más concentrado que en los suelos sin exposición. Además, en los suelos D3 y D4 (suelos expuestos a diesel) se observó una mayor concentración de cadmio y plomo total en comparación a todas las muestras, sobre los 30 y 600 mg Kg-1, respectivamente. Respecto a la caracterización biológica, el suelo expuesto a diesel D4 presentó mayor actividad biológica y número de heterótrofos, relacionado directamente al contenido de HAP (el suelo D4 presentó la mayor concentración del hidrocarburo, ̴ 30 mg Kg-1). De los 8 suelos se aisló 350 microorganismos, de los cuales 53 fueron capaces de degradar fenantreno. Mediante un screening desarrollado durante esta tesis basado en espectroscopía de fluorescencia total asociada a calibración multivariada, se seleccionó 3 aislados por su alto nivel de degradación. Estos microorganismos se caracterizaron, en particular la cepa D43FB (identificada como Pseudomonas flavescens) resiste 25 mg L-1 de Cd+2 y 5 mg L-1 de Cr+6. Además, tras 7 de incubación es capaz de degradar hasta un 80% de fenantreno en medio M9 con el hidrocarburo como única fuente de carbono. Al agregar 0.025, 0.05 y 0.5 mg L-1 de Cd+2 el porcentaje de degradación es 60, 26 y 25 mg L-1, respectivamente. Además, en un proceso de bioaumetación de suelos degrada aproximadamente un 75% de los hidrocarburos presentes en el terrario. Por otro lado, a este aislado se asoció su capacidad de degradar fenantreno a la facultad de formar biopelículas y adherirse a cristales de este compuesto, junto con descartar la liberación de biosurfactante o la quimiotaxis. Siendo una excelente alternativa para más ensayos de biorremediación de suelos. El trabajo planteado tiene profundas implicaciones para estudios en biorremediación y potencialmente podría representar una alternativa de descontaminación de ecosistemas antárticos aprovechando los bio recursos propios de la Antártica. La proyección de este trabajo está asociada a dilucidar completamente los procesos asociados a la degradación de Pseudomonas flavescens D43FB y continuar ensayos de biorremediación en terrarios, y así eventualmente terminar la investigación en un proceso in situ en Antártica / Antarctica is the southernmost continent on earth, contains ~80% of the planet's fresh water and presents a series of extreme conditions such as low temperatures and high ultraviolet radiation. Despite this, the man has been able to survive in the region doing scientific and operational activities for over 80 years. Consequently, various inhabited areas have been contaminated mainly with diesel. This compound is harmful, because it is composed by organic molecules such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and heavy metals (Cd, Cr and Pb). Decontamination of PAHs can be accomplished by physical, chemical and biological processes. Biological processes represent an ecological, economical and safe option that involves a minor alteration of the soil and thus is an excellent alternative for the decontamination of the Antarctic territory. To date, a large number of bacteria capable of degrading PAHs has been reported, however due to the Antarctic treaty is prohibited to enter foreign DNA and microorganisms to the mainland, so it is vital to find native bacteria that can be used in diesel bioremediation. Due to its higher solubility in water, lower toxicity to humans and structural similarities to other PAHs, the compound used as a model to isolate and study PAH degraders is phenanthrene. Based on the above, in this thesis the following hypothesis was proposed: "The presence of polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in Antarctic soils has favored the development of phenanthrene degrading bacteria resistant to heavy metals". The overall objective of this work was to isolate and characterize Antarctic bacteria resistant to heavy metals (Cd, Cr and Pb) and assess their ability to metabolize phenanthrene. To accomplish this, Antarctic soils obtained from different areas exposed to diesel were characterized chemically and biologically. Also, phenanthrene degrading bacteria resistant to heavy metals were isolated and characterized, and the degradation mechanisms involved were studied. Soil samples were obtained during the 49th expedition to the Antarctic continent (ECA 49), 4 soils none exposed to diesel (A0, B4, C3 and C8) and 4 soils exposed to diesel (D3, D4, E2 and E4). Soil analysis determined the presence of tri-aromatic polycyclic hydrocarbons in soil exposed to diesel, on average 1000 times more concentrated than in soils with no exposure. Moreover, D3 and D4 soils (exposed to diesel) display a greater cadmium concentration and total lead when compared to all samples, ~30 and 600 mg Kg-1, respectively. Regarding the biological characterization, soil exposed to diesel D4, display greater biological activity and heterotrophes, a result that was directly related to PAH content (D4 soil display the highest concentration of hydrocarbons, ~30 mg Kg-1). This relationship was confirmed by a soil enrichment test with phenanthrene, where it was observed that phenanthrene acts as a supplement in soils exposed to diesel. 350 environmental microorganisms were isolated from the 8 Antarctic soils, 53 of them were able to degrade phenanthrene. Three of them were selected for their high capacity to degrade the hydrocarbon. These isolates were selected through a screening developed during this thesis, based on total fluorescence spectroscopy associated to second order multivariate calibration. Selected isolates were characterized and the resistance to heavy metals was determined. In particular, strain D43FB (corresponding to Pseudomonas flavescens) resists 25 mg L-1 of Cd+2 and 5 mg L-1 of Cr+6. After 7 days, this bacterium was able to degrade ~80% of phenanthrene in M9 medium with the hydrocarbon as a sole carbon source. By adding 0.025, 0.05 and 0.5 mg L-1 of Cd+2 this value decreases to 60, 26 and 25 mg L-1, respectively. Moreover, in a bioaugmentation assay of soil the isolate is capable of degrading ̴75 % of PAH present in the terrarium. In the other hand, the capacity of this microorganism to degrade phenanthrene was associated with their ability to form biofilm and adhere to phenanthrene crystals. The proposed work has profound implications for bioremediation studies and potentially could represent an alternative for the decontamination of Antarctic ecosystems. The projection of this work is linked to fully elucidate the mechanism of degradation of Pseudomonas flavescens D43FB and continue testing bioremediation in terrariums, and so eventually complete the investigation with an in situ process in Antarctica / Fondecyt, INACH T_19-11 e INACH MT-05_13

Doctora en Química / Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), generados por combustión incompleta de materia orgánica, presentan particular interés debido a sus características cancerígenas y/o mutagénicas. Para el ser humano una de las vías de exposición a los PAHs es el consumo de alimentos grasos como los aceites vegetales. Los principales problemas de la determinación de PAHs en estas matrices oleosas son su baja concentración y la presencia de diversos interferentes. En general, su determinación involucra extracción seguida por “clean-up” y posterior análisis cromatográfico, lo que significa consumo de tiempo y solventes. En esta investigación se estudió el potencial analítico de la extracción líquido-líquido asistida por microondas con extracción en fase sólida (MAE-SPE) asociado a espectroscopía de fluorescencia, para desarrollar un método rápido de “screening” y un método de cuantificación con el objetivo de detectar simultáneamente siete PAHs de alta masa molar (228-278 g mol-1) en aceites comestibles de oliva extra-virgen (OEV) y maravilla refinado (MR). Los compuestos estudiados fueron: benzo[a]antraceno, benzo[b]fluoranteno, benzo[k]fluoranteno, benzo[a]pireno, dibenzo[a,h]antraceno, benzo[g,h,i]perileno e indeno[1,2,3-c,d]-pireno. Para el desarrollo del método de “screening” los datos de fluorescencia de una vía (a una longitud de onda), dos vías (espectros de emisión) y tres vías (matrices de excitación-emisión, MME) fueron utilizados para construir los calibrados de concentración total de PAHs, aplicando regresión lineal simple, mínimos cuadrados parciales (PLS) y mínimos cuadrados parciales desdoblados (U-PLS), respectivamente. El método de cuantificación fue desarrollado utilizando calibración de segundo orden, aplicando mínimos cuadrados parciales desdoblados acoplado a bilinearización residual (U-PLS/RBL) y análisis de factores paralelos (PARAFAC), asociados a matrices de excitación-emisión. El grupo de tocoferoles y pigmentos (clorofila y feofitina) presentes en los aceites fueron los principales interferentes en la detección de los PAHs por espectroscopía de fluorescencia, observándose solapamiento espectral parcial y fenómenos de filtro interno en el intervalo de longitudes de emisión de los analitos. La eficiencia para remover estos interferentes utilizando extracción en fase sólida en distintos adsorbentes (sílica, C-18, carbón grafitizado no poroso-CGNP- y fase mixta de CGNP con aminopropil sílica) fue estudiada, encontrando que sílica era la fase más eficiente para eliminar pigmentos y tocoferoles, permitiendo detectar claramente la presencia de los PAHs en los aceites comestibles a través de espectroscopía de fluorescencia. Las recuperaciones individuales de los PAHs luego de aplicar MAE-SPE fueron obtenidas mediante HPLC-FLD, con resultados satisfactorios (62-84%). Los límites de detección (LOD) alcanzados por el método de “screening” (expresados como concentración total de PAHs) dependieron del uso de datos espectrales de una, dos o tres vías y estuvieron comprendidos entre 0,79 y 7,0 μg kg-1. La mejor sensibilidad analítica (0,24 μg kg-1) y el menor LOD (0,79 μg kg-1) fue alcanzado aplicando U-PLS a los datos de tres vías. En el método de cuantificación, U-PLS/RBL resultó ser el mejor algoritmo aplicado para resolver la mezcla de PAHs en presencia tanto de matrices oleosas de gran complejidad (aceites de OEV y MR) como de PAHs inesperados. Los límites de detección obtenidos con este método estuvieron entre 0,07 y 2,0 μg kg-1 y las concentraciones predichas por U-PLS/RBL fueron satisfactoriamente comparadas con las obtenidas por HPLC-FLD. Por lo que el método propuesto es comparable y competitivo con el método cromatográfico, siendo sus principales ventajas la reducción considerable del tiempo de análisis y el consumo de solventes. Finalmente, el método propuesto fue aplicado a 21 muestras reales incluyendo muestras comerciales de aceites de OEV, oliva puro (OP) y MR. Ninguna de las muestras de aceite de MR presentó PAHs a niveles de concentración detectables. Sólo en tres muestras de aceite OEV se detectó la presencia de un PAH (BkF). Las concentraciones predichas por el método propuesto fueron comparables con las obtenidas por el método cromatográfico. La muestra de aceite de OP fue la única que presentó más de un analito (BaA, BbF, BkF y DBahA) y sobre-exigió al modelo en las predicciones de BaA y BbF. La gran diferencia en la composición química de un aceite de OP y un OEV o MR provocó la mala descomposición de los datos. / Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), mostly formed by incomplete combustion of organic matter, stand out mainly by their carcinogenic and mutagenic characteristics. For humans one of the routes of exposure for PAHs is the intake of fatty food such as vegetable oils. The major problems in the determination of PAHs in oily matrices are the diversity of potential interferences present in the matrix and the low analyte levels. Most of the methods for determination of PAHs usually implicate an extraction step, followed by clean-up and finally a chromatographic determination, which involve solvent and time consumption. In this study, the suitability of microwave assisted liquid-liquid extraction coupled to solid phase extraction (MAE-SPE) and fluorescence spectroscopy was investigated to develop a rapid screening and quantification method for the simultaneous determination of seven high molecular weight PAHs (228-278 g mol-1) in extra-virgin olive oil (EVO) and sunflower oil (SO). The studied compounds were: benz[a]anthracene (BaA), benzo[b]fluoranthene (BbF), benzo[k]fluoranthene (BkF), benzo[a]pyrene (BaP), indeno[1,2,3-c,d]-pyrene (IP), dibenz[a,h]anthracene (DBahA), and benzo[g,h,i]perylene (BghiP). For the develop of the screening method fluorescence data of one (one wavelength), two (emission spectrum) and three way (excitation emission matrix, EEM) were used to build the calibration models for total PAHs concentrations, applying simple linear regression, partial least squares (PLS) and unfolded partial least square (U-PLS), respectively. The quantification method was performed using second order calibration applying unfolded partial least square coupled to residual bilinearization (U-PLS/RBL) and parallel factor analysis (PARAFAC), associated with EEMs. Tocopherols and pigments (chlorophyll and pheopytin) present in oils were the principal interferences on the PAHs detection by fluorescence spectroscopy, observing partial spectral overlap and inner filter effects in the emission of analytes. The efficiency to remove the interferences from oil using solid phase extraction on different adsorbents (silica, C-18, graphitized carbon black -GCB- and dual phase GCB-aminopropyl silica) was studied. The results demonstrated that only silica was efficient enough to remove pigments and tocopherols, allowing the correct detection of PAHs in edible oils by fluorescence spectroscopy. The individual recoveries of PAHs after the application of MAE-SPE were obtained by HPLC-FLD, with successful results (62-84%). The limits of detection (LOD) achieved for the screening method (expressed as total concentration of PAHs) depended on the use of one, two or three way spectral data. The LODs were between 0.79 and 7.0 μg kg-1. The best analytical sensitivity (0.24 μg kg-1) and LOD (0.79 μg kg-1) were achieved applying U-PLS to three way fluorescence data. In the quantification method, U-PLS/RBL was the best algorithm applied to resolve the mixture of PAHs in presence of both complex oily matrices (EVO and SO) and other unexpected PAHs. The LODs obtained were between 0.07 and 2.0 μg kg-1 and the concentrations predicted by applying U-PLS/RBL method were statistically comparable to those provided by the reference HPLC-FLD technique. Hence, the proposed method using here is comparable and competitive to chromatographic method, being their main advantage the reduction of both time of analysis and solvent consume. Finally, twenty one commercial samples of EVOO, pure olive oil (POO) and SO were analyzed using the proposed method. None of SO samples exhibited PAHs at detectable concentrations. Only in three EVOO samples one PAH was detected (BkF). The predicted concentrations by the proposed method were similar compared to those obtained using the chromatographic method. Exclusively POO sample exhibited more than one PAH (BaA, BbF, BkF and DBahA) and the model was unable to predict the concentration of of BaA and BbF concentrations. The great difference between the chemical composition of POO and EVOO or SO produces bad data decomposition. / Conicyt

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are pollutants of great concern due to their toxicity, ubiquitous distribution and environmental persistence. Generally, the PAHs are found as part of complex mixtures such as crude oil and derivatives, and mineral coal. Mismanagement during industrial operations, and accidental spills result in the contamination of wide areas with potential risk for the public health and negative impact in the local economy. Nowadays, there is a considerable interest in the use of biological procedures to clean up polluted environments because of their pollutant removal efficiency, feasibility and associated low cost. Bioremediation experiences are based on the ability that microorganisms (bacteria, algae and fungi) possess in degrading a wide range of pollutants, including PAHs containing from two to five aromatic rings. The microbial biodegradation of low molecular weight (LMW) PAHs has been extensively studied revealing a variety of bacteria capable to efficiently degrade these pollutants. The studies with high molecular weight (HMW) PAHs, more recalcitrant and with higher toxicity, indicate that in soil environments this compounds are generally degraded by members of the group Actinobacteria. However, little is known about HMW-PAH degradation in marine environments. Recent studies carried out with marine consortia and isolates have identified a few genera as PAHs degraders in sea waters, but no associations have been established between pyrene degradation and actinobacteria in such environments. Here, with the study of a pyrene microbial marine consortium, we provide the first evidence on the key role of actinobacteria in the removal of pyrene from polluted marine shorelines. Moreover, the detailed analysis of the community structure of the microbial consortium have revealed the presence of a bacterial strain not classifiable in the previously described genus, that have been isolated, thoroughly characterized and proposed as a type strain of a new genus and species. Bioremediation experiences do not always produce the desired results. PAHs are usually degraded until certain limit after which degradation is hardly observed. This phenomenon may be mainly caused by the low bioavailiability and limited concentration of nutrients. PAHs are usually found in non-aqueous phase liquids (NAPLs), which results in a slow partition of these components into the aqueous phase and their persistence in to the environment for long periods. In order to enhance microbial degradation and reduce the residual PAH concentration in polluted environments, we have conducted an experiment in which the effect of an oleophilic fertilizer has been evaluated. We also have targeted the possible nutritional deficiencies during bioremediation and have examined the biodegradation of PAHs and potential accumulation of partially oxidized metabolites, more available and toxic than their parent PAHs. Finally, we have evaluated the efficiency of sunflower rhizosphere in PAH removal from polluted soils that have undergone extensive remediation but still contain intolerable levels of pollutants. The results indicate that the sunflower rhizosphere enhance the removal of PAHs by promoting the selective growth of degradative bacteria, incrementing the bioaccesibility and possible favouring the degrading processes through specific mechanism associated with the composition of the roots exudates. These results represent a promising alternative for increasing bioremediation in a sustainable and cost-efficient manner. / Los hidrocarburos aromáticos policíclicos son un grupo de contaminantes que suscitan gran preocupación debido a su toxicidad, amplia distribución y persistencia en el medio ambiente. Generalmente, los HAPs se encuentran formando parte de mezclas complejas como crudos de petróleo, carbón mineral y derivados. La mala gestión durante las operaciones industriales, y los vertidos accidentales causan amplias áreas contaminadas que conllevan un importante riesgo para la salud pública junto con un impacto negativo en la economía local. Actualmente, hay un notable interés en el uso de procedimientos biológicos para descontaminar emplazamientos debido a la eficiencia en la eliminación, viabilidad y bajo coste asociado de estos métodos. Las experiencias de biorremediación se basan en la capacidad de los microorganismos (bacterias, algas y hongos) de degradar una amplia variedad de contaminantes, incluyendo HAPs. La degradación microbiana de HAPs de bajo peso molecular ha sido ampliamente estudiada revelando numerosas bacterias capaces de eliminar eficientemente estos compuestos. Los estudios realizados con HAPs de alto peso molecular, más recalcitrantes y con mayor toxicidad, han mostrado que en suelos la degradación de estos compuestos es principalmente llevada a cabo por miembros del grupo Actinobacteria. Sin embargo, se desconoce la degradación de HAPs de elevado peso molecular en ambientes marinos. Estudios recientes llevados a cabo en consorcios marinos han identificado algunos géneros degradadores de HAPs en agua de mar, pero no se han establecido asociaciones entre el pireno y actinobacterias. Aquí, con el estudio del consorcio marino degradador de pireno, nosotros proveemos la primera evidencia del papel de las actinobacterias en la eliminación del pireno de costas marinas. Además, el análisis de la estructura de la comunidad bacteriana nos reveló la presencia de una cepa no clasificable en los géneros previamente descritos, que fue aislada, profundamente caracterizada y propuesta como cepa tipo de un nuevo género y especie. Las experiencias de biorremediación no siempre producen los resultados deseados. A menudo. los HAPs son degradados hasta cierto límite tras el cual la degradación apenas es observada. Este fenómeno puede ser causado principalmente por la baja disponibilidad y limitación de nutrientes. Los HAPs generalmente se encuentran formando parte de fases líquidas no acuosas (FLNAs), lo que resulta en una lenta partición de estos compuestos hacia la fase acuosa y por tanto en una persistencia medioambiental. Con el fin de incrementar la degradación microbiana y reducir la concentración residual de los HAPs en ambientes contaminados, se realizó un experimento en el cual se evaluaba el efecto de un fertilizante oleofílico. También se examinaron las posibles deficiencias nutricionales y la acumulación de metabolitos parcialmente oxidados resultantes de la degradación, los cuales son más disponibles y tóxicos que sus parentales. Finalmente, hemos evaluado la eficiencia de la rizosfera de girasol en la eliminación de HAPs de suelos contaminados con HAPs que han sido sometidos a una extensiva remediación, pero que contienen niveles inaceptables de HAPs. Los resultados indican que la rizosfera de girasol aumentó la eliminación de HAPs promoviendo el crecimiento selectivo de bacterias degradadoras y favoreciendo los procesos de degradación a través de mecanismos asociados con la composición de los exudados. Los resultados representan por tanto una alternativa prometedora para potenciar la biorremediación de una manera sostenible y rentable.