Heterochromatin in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is composed of polymers of the SIR (Silent Information Regulator) complex bound to nucleosomal DNA. Assembly of heterochromatin requires all three proteins of the Sir complex: the histone deacetylase Sir2, and histone binding proteins Sir3 and Sir4. Heterochromatin establishment requires passage through at least one cell cycle, but is not dependent on replication. Inhibition of chromatin modifying enzymes may be a mechanism for how cells limit assembly. Dot1 dependent methylation of H3K79 is suggested to inhibit de novo assembly. Halving the levels of Sir4 in cells causes a loss of silencing, suggesting that Sir4 protein abundance regulates the assembly of heterochromatin. We examine de novo assembly using a single cell assay. Half the level of Sir4 affects establishment, but not the maintenance, of silencing at HM loci. Additional Sir4 accelerates the rate of assembly. Epistasis analysis suggests that Dot1 dependent chromatin modification may act upstream of Sir4 abundance. We hypothesize that dot1Δ mutants speed assembly by disrupting telomeric heterochromatin, which liberates Sir4 to act at the HM loci. Deletion of YKU70, which specifically disrupts telomeric silencing, also speeds de novo assembly, without altering the methylation of histone H3. Consistent with our model, we have shown that Sir4 abundance falls during pheromone and stationary phase arrests after which several cell cycles are required before silencing can be reestablished.

Cellular and tissue characteristics are results of dynamic regulation of gene expression. DNA wrapped into proteins, referred to as chromatin, requires involvement of mechanisms guiding accessibility of specific sequences. In higher organisms, chromatin remodeling proteins are indispensable in regulating chromatin structure including ISWI ATPase SMARCA5. SMARCA5 is involved in almost any transaction on DNA including transcription, however precise in vivo role of SMARCA5 in these processes remains unknown. To advance understanding of specific role of SMARCA5 in the development of chromatin structure during transcription we devised cellular model in which SMARAC5 level is manipulated while chromatin structure development and transcriptional response are monitored. Our data indicate that the transfected DNA template that is transcribed is enriched with histone H3 and its specific methylation of Histone H3 lysine (K) 4, a mark of active chromatin structure. Overexpression of SMARCA5 results within the reporter gene coding sequence in ~2,5-3 fold increase of both H3 occupancy an its modification H3K4Me3. Increased DNA template commitment into chromatinization is associated with repression of reporter gene expression. These results are supported by studies indicating dynamic development of nucleosomal...

<p dir="ltr">Epigenetics involves the study of mechanisms that influence gene expression. These mechanisms are heritable and dynamic, and despite altering gene transcriptional activity, they do not change the underlying DNA sequence. While epigenetic mechanisms govern gene expression throughout the lifetime of an organism, the dynamic nature and precision of the transcriptional control afforded by processes such as histone modifications and chromatin architecture remodeling are exemplified in early mammalian development. Perhaps unsurprisingly, perturbations to the epigenetic status of a cell can alter its function, and widespread epigenome disruptions due to changes in the developmental environment can compromise the growth, and even viability, of an embryo or fetus. By studying epigenetic mechanisms and the patterns they impart, we can better understand not only how developmental progression is regulated during embryonic development and beyond, but also what the consequences of aberrant epigenetic disturbances may be to developing organisms.</p><p><br></p><p dir="ltr">Many gaps remain in our knowledge concerning epigenetic mechanisms in domestic livestock species, particularly regarding early development. Pigs represent a compelling model organism for study in this area, as they are increasingly being used as a biomedical model for human-oriented research due to their physiological similarities to humans, and they remain a staple meat species in many parts of the world. Chapter 2 investigates the presence and transcriptional dynamics of the SWI/SNF chromatin remodeling complex GBAF in porcine trophectoderm (PTr2) and fetal fibroblast (PFF) cells. These cell lines represent two discrete developmental stages during early swine development, with the PTr2 cells originally obtained from the trophectoderm of a gestation day 12 elongating porcine conceptus, and the fetal fibroblast cells were collected from a fetus on day 40 of gestation. Using immunocytochemistry and Western blotting techniques, GBAF was identified in both cell lines. Further, co-immunoprecipitation of GBAF constituent subunits and other BAF family subcomplex subunits revealed a previously undescribed interaction between the GBAF subunit GLTSCR1 and the BAF subunit BAF170, the latter of which has not been shown to be present in human and mouse GBAF. This may suggest a species-specific GBAF composition in swine. Analysis of RNA-seq data from porcine embryos, PTr2 cells, and PFF cells showed that while transcription of GBAF-specific subunits BRD9 and GLTSCR1 was detectable, expression levels were lower compared to other BAF family subunits. Taken together these results suggest that, while GBAF is detectable in swine early development contexts, it may have a comparatively minor contribution as an epigenetic mechanism during the represented developmental timepoints.</p><p><br></p><p dir="ltr">Details in the literature about the epigenetic landscape and the resulting chromatin state during porcine early development are also limited at present. Chapter 3 involves the global epigenetic profiling of the histone marks H3K4me3, H3K27ac, and H3K27me3 and the SWI/SNF central ATPase BRG1 in PTr2 and PFF cells using CUT&RUN. The enrichment patterns observed for these features were consistent with known patterns described in the literature. H3K4me3 was primarily enriched in gene promoter regions, and H3K27ac showed enrichment in both promoter regions and distal intergenic regions, some of which are likely active enhancers. H3K27me3 showed broad genomic localization and was detected at genes known to be transcriptionally inactive in these cell types, as well as in distal intergenic regions. BRG1 showed some co-enrichment with H3K4me3 and H3K27ac in promoter regions, as well as several instances of H3K27ac co-enrichment at intergenic sites. The sequencing files were used to build a chromatin state prediction model for 10 states in each cell line, ranging from TSS to repressed genomic regions. Additionally, the transcriptomes of PTr2 and PFF cells were compared to those of human cells taken from comparable gestational time points to determine if these swine cell lines could potentially serve as translational <i>in vitro</i> models. PTr2 cells and human trophectoderm (TE) cells were relatively dissimilar in their cell-type specific gene identities (~24% overlap) and corresponding transcriptional levels, but the porcine and human fibroblast cells shared around 50% of the same cell type-specific genes, and expression levels were broadly similar among them. Altogether, these findings provide foundational epigenetic landscape information for PTr2 and PFF cells and potential insights regarding similarities and differences in cell identity between human and pig trophectoderm and fetal fibroblast cells.</p><p><br></p><p dir="ltr">The placenta is a transient organ that provides essential support to the developing fetus in the form of nutrient and gas exchange. Despite its significance in facilitating fetal development, our understanding of how the placenta is affected by its environment is greatly limited, and only a handful of studies exploring the placental epigenome in swine exist to date. To address these gaps, and building upon the epigenetic profiling methods developed in Chapter 3, Chapter 4 investigated whether, and to what extent, the placental epigenome changes in response to fetal endocrine perturbations. Placental tissue was collected at day 86 of gestation from untreated pregnant gilts and pregnant gilts treated for 21 days with methimazole (MMI) to induce fetal hypothyroidism. CUT&RUN was used to evaluate the enrichment of H3K4me3, H3K27ac, and BRG1 in placental tissue derived from n=6 male and female fetuses in each treatment group (n=12 samples per group). Differential enrichment of all three epigenetic features was seen in placental tissues obtained from MMI-treated fetuses, and, notably, existing sex-specific differences in placental epigenetic features were exacerbated by MMI-induced fetal hypothyroidism. This may suggest that the porcine placenta may be impacted by fetal endocrine status during late gestation. Together, these findings show that sex-specific differences in placental chromatin state exist and that a fetal hypothyroid state is sufficient to perturb the placental epigenome, ultimately providing novel insights into the intricate interplay between fetal endocrine status and regulation of the placental epigenome.</p>

Eukaryotic genomes are typically organized as chromatin, the complex of DNA and proteins that forms chromosomes within the cell\\\'s nucleus. Chromatin has pivotal roles for a multitude of functions, most of which are carried out by a complex system of covalent chemical modifications of histone proteins. The propagation of patterns of these histone post-translational modifications across cell divisions is particularly important for maintenance of the cell state in general and the transcriptional program in particular. The discovery of epigenetic inheritance phenomena - mitotically and/or meiotically heritable changes in gene function resulting from changes in a chromosome without alterations in the DNA sequence - was remarkable because it disproved the assumption that information is passed to daughter cells exclusively through DNA. However, DNA replication constitutes a dramatic disruption of the chromatin state that effectively amounts to partial erasure of stored information. To preserve its epigenetic state the cell reconstructs (at least part of) the histone post-translational modifications by means of processes that are still very poorly understood. A plausible hypothesis is that the different combinations of reader and writer domains in histone-modifying enzymes implement local rewriting rules that are capable of \\\"recomputing\\\" the desired parental patterns of histone post-translational modifications on the basis of the partial information contained in that half of the nucleosomes that predate replication. It is becoming increasingly clear that both information processing and computation are omnipresent and of fundamental importance in many fields of the natural sciences and the cell in particular. The latter is exemplified by the increasingly popular research areas that focus on computing with DNA and membranes. Recent work suggests that during evolution, chromatin has been converted into a powerful cellular memory device capable of storing and processing large amounts of information. Eukaryotic chromatin may therefore also act as a cellular computational device capable of performing actual computations in a biological context. A recent theoretical study indeed demonstrated that even relatively simple models of chromatin computation are computationally universal and hence conceptually more powerful than gene regulatory networks. In the first part of this thesis, I establish a deeper understanding of the computational capacities and limits of chromatin, which have remained largely unexplored. I analyze selected biological building blocks of the chromatin computer and compare it to system components of general purpose computers, particularly focusing on memory and the logical and arithmetical operations. I argue that it has a massively parallel architecture, a set of read-write rules that operate non-deterministically on chromatin, the capability of self-modification, and more generally striking analogies to amorphous computing. I therefore propose a cellular automata-like 1-D string as its computational paradigm on which sets of local rewriting rules are applied asynchronously with time-dependent probabilities. Its mode of operation is therefore conceptually similar to well-known concepts from the complex systems theory. Furthermore, the chromatin computer provides volatile memory with a massive information content that can be exploited by the cell. I estimate that its memory size lies in the realms of several hundred megabytes of writable information per cell, a value that I compare with DNA itself and cis-regulatory modules. I furthermore show that it has the potential to not only perform computations in a biological context but also in a strict informatics sense. At least theoretically it may therefore be used to calculate any computable function or algorithm more generally. Chromatin is therefore another representative of the growing number of non-standard computing examples. As an example for a biological challenge that may be solved by the \\\"chromatin computer\\\", I formulate epigenetic inheritance as a computational problem and develop a flexible stochastic simulation system for the study of recomputation-based epigenetic inheritance of individual histone post-translational modifications. The implementation uses Gillespie\\\'s stochastic simulation algorithm for exactly simulating the time evolution of the chemical master equation of the underlying stochastic process. Furthermore, it is efficient enough to use an evolutionary algorithm to find a system of enzymes that can stably maintain a particular chromatin state across multiple cell divisions. I find that it is easy to evolve such a system of enzymes even without explicit boundary elements separating differentially modified chromatin domains. However, the success of this task depends on several previously unanticipated factors such as the length of the initial state, the specific pattern that should be maintained, the time between replications, and various chemical parameters. All these factors also influence the accumulation of errors in the wake of cell divisions. Chromatin-regulatory processes and epigenetic (inheritance) mechanisms constitute an intricate and sensitive system, and any misregulation may contribute significantly to various diseases such as Alzheimer\\\'s disease. Intriguingly, the role of epigenetics and chromatin-based processes as well as non-coding RNAs in the etiology of Alzheimer\\\'s disease is increasingly being recognized. In the second part of this thesis, I explicitly and systematically address the two hypotheses that (i) a dysregulated chromatin computer plays important roles in Alzheimer\\\'s disease and (ii) Alzheimer\\\'s disease may be considered as an evolutionarily young disease. In summary, I found support for both hypotheses although for hypothesis 1, it is very difficult to establish causalities due to the complexity of the disease. However, I identify numerous chromatin-associated, differentially expressed loci for histone proteins, chromatin-modifying enzymes or integral parts thereof, non-coding RNAs with guiding functions for chromatin-modifying complexes, and proteins that directly or indirectly influence epigenetic stability (e.g., by altering cell cycle regulation and therefore potentially also the stability of epigenetic states). %Notably, we generally observed enrichment of probes located in non-coding regions, particularly antisense to known annotations (e.g., introns). For the identification of differentially expressed loci in Alzheimer\\\'s disease, I use a custom expression microarray that was constructed with a novel bioinformatics pipeline. Despite the emergence of more advanced high-throughput methods such as RNA-seq, microarrays still offer some advantages and will remain a useful and accurate tool for transcriptome profiling and expression studies. However, it is non-trivial to establish an appropriate probe design strategy for custom expression microarrays because alternative splicing and transcription from non-coding regions are much more pervasive than previously appreciated. To obtain an accurate and complete expression atlas of genomic loci of interest in the post-ENCODE era, this additional transcriptional complexity must be considered during microarray design and requires well-considered probe design strategies that are often neglected. This encompasses, for example, adequate preparation of a set of target sequences and accurate estimation of probe specificity. With the help of this pipeline, two custom-tailored microarrays have been constructed that include a comprehensive collection of non-coding RNAs. Additionally, a user-friendly web server has been set up that makes the developed pipeline publicly available for other researchers. / Eukaryotische Genome sind typischerweise in Form von Chromatin organisiert, dem Komplex aus DNA und Proteinen, aus dem die Chromosomen im Zellkern bestehen. Chromatin hat lebenswichtige Funktionen in einer Vielzahl von Prozessen, von denen die meisten durch ein komplexes System von kovalenten Modifikationen an Histon-Proteinen ablaufen. Muster dieser Modifikationen sind wichtige Informationsträger, deren Weitergabe über die Zellteilung hinaus an beide Tochterzellen besonders wichtig für die Aufrechterhaltung des Zellzustandes im Allgemeinen und des Transkriptionsprogrammes im Speziellen ist. Die Entdeckung von epigenetischen Vererbungsphänomenen - mitotisch und/oder meiotisch vererbbare Veränderungen von Genfunktionen, hervorgerufen durch Veränderungen an Chromosomen, die nicht auf Modifikationen der DNA-Sequenz zurückzuführen sind - war bemerkenswert, weil es die Hypothese widerlegt hat, dass Informationen an Tochterzellen ausschließlich durch DNA übertragen werden. Die Replikation der DNA erzeugt eine dramatische Störung des Chromatinzustandes, welche letztendlich ein partielles Löschen der gespeicherten Informationen zur Folge hat. Um den epigenetischen Zustand zu erhalten, muss die Zelle Teile der parentalen Muster der Histonmodifikationen durch Prozesse rekonstruieren, die noch immer sehr wenig verstanden sind. Eine plausible Hypothese postuliert, dass die verschiedenen Kombinationen der Lese- und Schreibdomänen innerhalb von Histon-modifizierenden Enzymen lokale Umschreibregeln implementieren, die letztendlich das parentale Modifikationsmuster der Histone neu errechnen. Dies geschieht auf Basis der partiellen Informationen, die in der Hälfte der vererbten Histone gespeichert sind. Es wird zunehmend klarer, dass sowohl Informationsverarbeitung als auch computerähnliche Berechnungen omnipräsent und in vielen Bereichen der Naturwissenschaften von fundamentaler Bedeutung sind, insbesondere in der Zelle. Dies wird exemplarisch durch die zunehmend populärer werdenden Forschungsbereiche belegt, die sich auf computerähnliche Berechnungen mithilfe von DNA und Membranen konzentrieren. Jüngste Forschungen suggerieren, dass sich Chromatin während der Evolution in eine mächtige zelluläre Speichereinheit entwickelt hat und in der Lage ist, eine große Menge an Informationen zu speichern und zu prozessieren. Eukaryotisches Chromatin könnte also als ein zellulärer Computer agieren, der in der Lage ist, computerähnliche Berechnungen in einem biologischen Kontext auszuführen. Eine theoretische Studie hat kürzlich demonstriert, dass bereits relativ simple Modelle eines Chromatincomputers berechnungsuniversell und damit mächtiger als reine genregulatorische Netzwerke sind. Im ersten Teil meiner Dissertation stelle ich ein tieferes Verständnis des Leistungsvermögens und der Beschränkungen des Chromatincomputers her, welche bisher größtenteils unerforscht waren. Ich analysiere ausgewählte Grundbestandteile des Chromatincomputers und vergleiche sie mit den Komponenten eines klassischen Computers, mit besonderem Fokus auf Speicher sowie logische und arithmetische Operationen. Ich argumentiere, dass Chromatin eine massiv parallele Architektur, eine Menge von Lese-Schreib-Regeln, die nicht-deterministisch auf Chromatin operieren, die Fähigkeit zur Selbstmodifikation, und allgemeine verblüffende Ähnlichkeiten mit amorphen Berechnungsmodellen besitzt. Ich schlage deswegen eine Zellularautomaten-ähnliche eindimensionale Kette als Berechnungsparadigma vor, auf dem lokale Lese-Schreib-Regeln auf asynchrone Weise mit zeitabhängigen Wahrscheinlichkeiten ausgeführt werden. Seine Wirkungsweise ist demzufolge konzeptionell ähnlich zu den wohlbekannten Theorien von komplexen Systemen. Zudem hat der Chromatincomputer volatilen Speicher mit einem massiven Informationsgehalt, der von der Zelle benutzt werden kann. Ich schätze ab, dass die Speicherkapazität im Bereich von mehreren Hundert Megabytes von schreibbarer Information pro Zelle liegt, was ich zudem mit DNA und cis-regulatorischen Modulen vergleiche. Ich zeige weiterhin, dass ein Chromatincomputer nicht nur Berechnungen in einem biologischen Kontext ausführen kann, sondern auch in einem strikt informatischen Sinn. Zumindest theoretisch kann er deswegen für jede berechenbare Funktion benutzt werden. Chromatin ist demzufolge ein weiteres Beispiel für die steigende Anzahl von unkonventionellen Berechnungsmodellen. Als Beispiel für eine biologische Herausforderung, die vom Chromatincomputer gelöst werden kann, formuliere ich die epigenetische Vererbung als rechnergestütztes Problem. Ich entwickle ein flexibles Simulationssystem zur Untersuchung der epigenetische Vererbung von individuellen Histonmodifikationen, welches auf der Neuberechnung der partiell verlorengegangenen Informationen der Histonmodifikationen beruht. Die Implementierung benutzt Gillespies stochastischen Simulationsalgorithmus, um die chemische Mastergleichung der zugrundeliegenden stochastischen Prozesse über die Zeit auf exakte Art und Weise zu modellieren. Der Algorithmus ist zudem effizient genug, um in einen evolutionären Algorithmus eingebettet zu werden. Diese Kombination erlaubt es ein System von Enzymen zu finden, dass einen bestimmten Chromatinstatus über mehrere Zellteilungen hinweg stabil vererben kann. Dabei habe ich festgestellt, dass es relativ einfach ist, ein solches System von Enzymen zu evolvieren, auch ohne explizite Einbindung von Randelementen zur Separierung differentiell modifizierter Chromatindomänen. Dennoch ängt der Erfolg dieser Aufgabe von mehreren bisher unbeachteten Faktoren ab, wie zum Beispiel der Länge der Domäne, dem bestimmten zu vererbenden Muster, der Zeit zwischen Replikationen sowie verschiedenen chemischen Parametern. Alle diese Faktoren beeinflussen die Anhäufung von Fehlern als Folge von Zellteilungen. Chromatin-regulatorische Prozesse und epigenetische Vererbungsmechanismen stellen ein komplexes und sensitives System dar und jede Fehlregulation kann bedeutend zu verschiedenen Krankheiten, wie zum Beispiel der Alzheimerschen Krankheit, beitragen. In der Ätiologie der Alzheimerschen Krankheit wird die Bedeutung von epigenetischen und Chromatin-basierten Prozessen sowie nicht-kodierenden RNAs zunehmend erkannt. Im zweiten Teil der Dissertation adressiere ich explizit und auf systematische Art und Weise die zwei Hypothesen, dass (i) ein fehlregulierter Chromatincomputer eine wichtige Rolle in der Alzheimerschen Krankheit spielt und (ii) die Alzheimersche Krankheit eine evolutionär junge Krankheit darstellt. Zusammenfassend finde ich Belege für beide Hypothesen, obwohl es für erstere schwierig ist, aufgrund der Komplexität der Krankheit Kausalitäten zu etablieren. Dennoch identifiziere ich zahlreiche differentiell exprimierte, Chromatin-assoziierte Bereiche, wie zum Beispiel Histone, Chromatin-modifizierende Enzyme oder deren integrale Bestandteile, nicht-kodierende RNAs mit Führungsfunktionen für Chromatin-modifizierende Komplexe oder Proteine, die direkt oder indirekt epigenetische Stabilität durch veränderte Zellzyklus-Regulation beeinflussen. Zur Identifikation von differentiell exprimierten Bereichen in der Alzheimerschen Krankheit benutze ich einen maßgeschneiderten Expressions-Microarray, der mit Hilfe einer neuartigen Bioinformatik-Pipeline erstellt wurde. Trotz des Aufkommens von weiter fortgeschrittenen Hochdurchsatzmethoden, wie zum Beispiel RNA-seq, haben Microarrays immer noch einige Vorteile und werden ein nützliches und akkurates Werkzeug für Expressionsstudien und Transkriptom-Profiling bleiben. Es ist jedoch nicht trivial eine geeignete Strategie für das Sondendesign von maßgeschneiderten Expressions-Microarrays zu finden, weil alternatives Spleißen und Transkription von nicht-kodierenden Bereichen viel verbreiteter sind als ursprünglich angenommen. Um ein akkurates und vollständiges Bild der Expression von genomischen Bereichen in der Zeit nach dem ENCODE-Projekt zu bekommen, muss diese zusätzliche transkriptionelle Komplexität schon während des Designs eines Microarrays berücksichtigt werden und erfordert daher wohlüberlegte und oft ignorierte Strategien für das Sondendesign. Dies umfasst zum Beispiel eine adäquate Vorbereitung der Zielsequenzen und eine genaue Abschätzung der Sondenspezifität. Mit Hilfe der Pipeline wurden zwei maßgeschneiderte Expressions-Microarrays produziert, die beide eine umfangreiche Sammlung von nicht-kodierenden RNAs beinhalten. Zusätzlich wurde ein nutzerfreundlicher Webserver programmiert, der die entwickelte Pipeline für jeden öffentlich zur Verfügung stellt.

<p>Mammalian development is orchestrated by global transcriptional changes, which drive cellular differentiation, giving rise to diverse cell types. The mechanisms that mediate the temporal control of early differentiation can be studied using embryonic stem cell (ESCs) and embryonal carcinoma cells (ECCs) as model systems. In these stem cells, differentiation signals induce transcriptional repression of genes that maintain pluripotency (PpG) and activation of genes required for lineage specification. Expression of PpGs is controlled by these genes’ proximal and distal regulatory elements, promoters and enhancers, respectively. Previously published work from our laboratory showed that during differentiation of ESCs, the repression of PpGs is accompanied by enhancer silencing mediated by the Lsd1/Mi2-NuRD-Dnmt3a complex. The enzymes in this complex catalyze histone H3K27Ac deacetylation and H3K4me1/2 demethylation followed by a gain of DNA methylation mediated by the DNA methyltransferase, Dnmt3a. The absence of these chromatin changes at PpG enhancers during ESC differentiation leads to their incomplete repression. In cancer, abnormal expression of PpG is commonly observed. Our studies show that in differentiating F9 embryonal carcinoma cells (F9 ECCs), PpG maintain substantial expression concomitant with an absence of Lsd1-mediated H3K4me1 demethylation at their respective enhancers. The continued presence of H3K4me1 blocks the downstream activity of Dnmt3a, leading to the absence of DNA methylation at these sites. The absence of Lsd1 activity at PpG enhancers establishes a “primed” chromatin state distinguished by the absence of DNA methylation and the presence of H3K4me1. We further established that the activity of Lsd1 in these cells was inhibited by Oct3/4, which was partially repressed post-differentiation. Our data reveal that sustained expression of the pioneer pluripotency factor Oct3/4 disrupts the enhancer silencing mechanism. This generates an aberrant “primed” enhancer state, which is susceptible to activation and supports tumorigenicity. </p> <p>As differentiation proceeds and multiple layers of cells are produced in the early embryo, the inner cells are depleted of O₂, which triggers endothelial cell differentiation. These cells form vascular structures that allow transport of O₂ and nutrients to cells. Using ESC differentiation to endothelial cells as a model system, studies covered in this thesis work elucidated a mechanism by which the transcription factor Vascular endothelial zinc finger 1 (Vezf1) regulates endothelial differentiation and formation of vascular structures. Our data show that Vezf1-deficient ESCs fail to upregulate the expression of pro-angiogenic genes in response to endothelial differentiation induction. This defect was shown to be the result of the elevated expression of the stemness factor Cbp/p300-interacting transactivator 2 (Cited2) at the onset of differentiation. The improper expression of Cited2 sequesters histone acetyltransferase p300 from depositing active histone modifications at the regulatory elements of angiogenesis-specific genes that, in turn, impedes their activation. </p> <p>Besides the discovery of epigenetic mechanisms that regulate gene expression during differentiation, our studies also include development of a sensitive method to identify activities of a specific DNA methyltransferase at genomic regions. In mammals, DNA methylation occurs at the C5 position of cytosine bases. The addition of this chemical modification is catalyzed by a family of enzymes called DNA methyltransferases (Dnmts). Current methodologies, which determine the distribution of Dnmts or DNA methylation levels in genomes, show the combined activity of multiple Dnmts at their target sites. To determine the activity of a particular Dnmt in response to an external stimulus, we developed a method, Transition State Covalent Crosslinking DNA Immunoprecipitation (TSCC-DIP), which traps catalytically active Dnmts at their transition state with the DNA substrate. Our goal is to produce a strategy that would enable the determination of the direct genomic targets of specific Dnmts, creating a valuable tool for studying the dynamic changes in DNA methylation in any biological process.</p>

La nucléoline, une des protéines non-ribosomique les plus abondantes du nucléole, semble être impliquée dans de nombreux aspects du métabolisme de l'ADN en plus de son rôle dans la régulation de la transcription par l'ARN polymérase I, la maturation du pré-ARNr et l’assemblage des ribosomes. L'objectif de cette thèse est d'étudier l'interaction de la nucléoline avec la chromatine, et de déchiffrer la fonction de la nucléoline dans la régulation de l’expression génique. Il a été rapporté que la nucléoline est nécessaire pour la transcription des gènes codant pour l'ADN ribosomal in vivo, mais le mécanisme par lequel la nucléoline module la transcription d’ARN polymérase I (Pol I) est inconnue. Dans cette thèse, je montre que l’inhibition de l’expression de la nucléoline par siRNAconduit dans les gènes de l’ADNr à une augmentation de la marque hétérochromatine et une diminution des marques caractéristiques de l’euchromatine. La nucléoline est associée à des gènes ADNr non méthylés et ChIP-seq montrent un fort enrichissement de la nucléoline dans le promoteur et la région codante de l'ADNr. La nucléoline est capable d'interférer avec la liaison de TTF-1 sur le terminateur T0 proches du promoteur inhibant ainsi le recrutement du sous-unité NoRC TIP5 et HDAC1 et la création d'un état répressif hétérochromatine. Cette invasion de macroH2A1 dans le nucléole joue un rôle majeur dans l'inhibition de la transcription par la RNA Polymérase I en l'absence de la nucléoline. Ces résultats révèlent l'importance de la nucléoline pour le maintien de l'état euchromatien de l'ADNr et le rôle de macroH2A1 dans la régulation de la transcription de l'ADNr. / Besides the well-known role of the nucleolus in ribosome biogenesis, nucleoli play important roles in the regulation of many fundamental cellular processes, including cell cycle regulation, apoptosis, telomerase production, RNA processing and therefore it is not surprising that many nucleolar proteins appear to be multifunctional proteins. Nucleolin, one of the most abundant non-ribosomal proteins of the nucleolus, has been the focus of many studies since it was first described 35 years ago. It seems to be involved in many aspects of DNA metabolism, chromatin regulation and appeared to be a good pharmacological target for drug development in addition to its role in RNA polymerase I transcription and pre-ribosomal processing and assembly in pre-ribosomes. In eukaryotic cells, DNA is packed into nucleosomes to form chromatin in the nucleus. The cells develop a variety of strategies to overcome the nucleosomal barriers. These strategies include DNA methylation, histone post-translational modifications, incorporation of histone variants and ATP dependent chromatin remodeling. The aim of this thesis is to study the interaction of nucleolin with chromatin, and to decipher the mechanism of nucleolin in gene regulation. It was reported that nucleolin possesses a histone chaperone activity, helps the transcription through nucleosomes, and it is required for ribosomal DNA gene (rDNA) transcription in vivo, but the mechanism by which nucleolin modulates RNA polymerase I (Pol I) transcription is unknown. In the thesis it is shown that nucleolin knockdown results in an increase of the heterochromatin mark H3K9me2 and a decrease of H4K12Ac and H3K4me3 euchromatin histone marks in rDNA genes. Nucleolin is associated with unmethylated rDNA genes and ChIP-seq experiments identified a strong enrichment of nucleolin in the promoter and coding regions of rDNA. Nucleolin is able to interfere with the binding of TTF-1 on the promoter-proximal terminator T0 thus inhibiting the recruitment of the nucleolar remodeling complex (NoRC) subunit TIP5 and HDAC1 and the establishment of a repressive heterochromatin state. In addition, in absence of nucleolin or after inhibition of Pol I by actinomycin D, a strong relocalization of the histone variant macroH2A1 to the nucleolus and on the rDNA genes was observed. This invasion of macroH2A1 in the nucleolus plays a major role in the inhibition of Pol I transcription in absence of nucleolin, as knockdown of macroH2A1 eliminates the repressive effect of nucleolin depletion. These results reveal the importance of nucleolin for the maintenance of the euchromatin state of rDNA required for an efficient production of ribosomal RNAs and the role of macroH2A1 in rDNA transcription.

Une grande partie du génome des eucaryotes est constituée d’éléments transposables(ET). Ces séquences d’ADN répétées ont la capacité de se déplacer d’un site chromosomiqueà un autre et de multiplier le nombre de leurs copies, pouvant ainsi être la cause d’uneinstabilité génétique. Face à ce potentiel de mutagénèse, un certain nombre de systèmes ontété sélectionnés dans les génomes eucaryotes qui conduisent à une réduction de l’activité desET. Notamment, chez la drosophile, on a récemment mis en évidence des mécanismes derégulation impliquant les modifications d’histones, et une nouvelle classe de petits ARN,appelés piARN, qui contrôlent spécifiquement les éléments transposables dans les tissusreproducteurs.tirant est un rétrotransposon à LTR de la drosophile, de type Gypsy, isolé au sein dulaboratoire dans les populations naturelles de D. simulans, où le nombre de ses copies estvariable entre populations. Cet ET possède la même structure génomique que les rétrovirus.Dans la première partie de cette thèse, j’ai caractérisé un élément tirant actif dans lespopulations naturelles de D. simulans. Je me suis intéressé en particulier au gène de laprotéine d’enveloppe (env), qui confère le caractère infectieux du rétrovirus. La comparaisondes transcrits et de la protéine du gène env entre populations de D. simulans a montré quetirant est actif dans une population, et cette activation est associée à sa mobilisation, alors quedans les autres populations tirant est présent, mais régulé.Dans la deuxième partie de mon travail, je me suis intéressé à l’étude de l’influence detirant sur la structure de la chromatine au niveau de son site d’insertion et à son influence surl’expression des gènes voisins. J’ai étudié trois modifications d’histones dans troispopulations naturelles, dont une où tirant est inséré dans un intron du gène tkv. Les résultatsobtenus montrent que tirant est capable de modifier la structure de la chromatine au niveau deson site d’insertion, mais aussi en amont, par l’hétérochromatinisation d'un promoteur du gènetkv, en affectant ainsi son taux de transcription.Enfin, je me suis intéressé à la régulation post-transcriptionnelle de tirant par lespiARN. Par l’analyse de croisements intraspécifiques entre des souches contenant ou non descopies de tirant dans l’euchromatine, j’ai montré qu’une régulation post-transcriptionnelle parles piARN germinaux qui contrôle tirant dans les cellules folliculaires de l’ovaire. J’ai aussipu montrer une expression variable entre populations des gènes de la voie piARN. / Eukaryotic genomes harbor a wide variety of repeated sequences, such as transposableelements (TE). These sequences are able to move from one chromosomal site to another, tomultiply their number of copies, and can be the cause of a genetic instability. Sophisticatedgenomic defenses have evolved to restrict their activity. In Drosophila, epigeneticmodification such as post-translational histone modifications and RNAi interference areinvolved in TE silencing in reproductive tissues. The silencing of an LTR like element, tirant,has been deeply analyzed in this work. Tirant is a Gypsy like element, isolated in ourlaboratory in natural populations of D. simulans, in which a high level of copy numbervariability is observed between strains.Here, I first describe an active tirant element in natural populations of D. simulans. Ihave focused on the envelope protein gene (env), which confers the infectious behavior to theretrovirus. By comparison of tirant transcripts level and protein localization between naturalpopulations of D.simulans, I showed that tirant is active in one population, and this activationis correlated with its mobilization.I then focused on the effects of TE insertions on chromatin structure and in its influenceon the expression of the nearby genes. I studied three histone modification marks in threenatural populations, in the locus in which tirant was inserted. I show that tirant is associatedwith repressive marks and active marks, which explains the activity of the element. We alsoshowed that tirant modifies the structure of the chromatin at the level of its site of insertion,but also upstream, by the heterochromatinization of the promoter of tkv gene, interfering withthe level of transcription of the gene.Finally, I was interested in the post-transcriptional regulation of tirant involving thepiRNA pathway. By crossing D.simulans strains which contains different copy numbers ofthe tirant element, I showed that tirant is regulated in the follicular cells by the germ linepiRNA pathway. I was also able to show a variable expression between populations of theproteins of the piRNA pathway.

Pilzentwicklung und Sekundärmetabolismus werden durch Einwirkung von Umwelteinflüssen von Regulatorproteinen kontrolliert. Das VeA Protein repräsentiert die velvet-Domänen-Familie der Pilzregulatoren. VeA passt die sexuelle Entwicklung und den dazu gehörenden Sekundärmetabolismus von Aspergillus nidulans an die Lichtverhältnisse an. VeA bindet im Dunkeln an VelB und bildet schließlich den trimeren VelB-VeA-LaeA (velvet) Komplex. VeA dient als Brückenprotein für das velvet-Domänen-Protein VelB als Regulator der Entwicklung und die Methyltransferase LaeA als Regulator des Sekundärmetabolismus. VelB kann mit VosA einen zweiten licht-regulierten Komplex bilden, der die asexuelle Entwicklung reprimiert. Auch VosA gehört zur Familie der Velvet- Proteine. LaeA kontrolliert die Bildung der VelB-VosA und VelB-VeA-LaeA Komplexe während der Entwicklung. laeA Nullmutationen können nicht mehr auf Licht reagieren, was ihre Schlüsselrolle als Regulatoren der Entwicklung unterstreicht. Die Abwesenheit von LaeA führt zur Bildung von wesentlich kleineren Fruchtkörpern. Grund hierfür ist das Fehlen runder Hülle-Zellen, die den jungen Fruchtkörper ernähren und in seiner Entwicklung unterstützen. LaeA spielt damit eine dynamische Rolle während der morphologischen und biochemischen Entwicklung des Pilzes, indem die Expression, Interaktion und die Modifikation der velvet Regulatoren kontrolliert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die VeA-Plattform für Protein-Protein Interaktionen weiter untersucht. VeA interagierende Proteine (Vips) identifiziert in einen „Yeast-two-hybrid“ System führten zu einem trimeren Methyltransferase-Komplex, der Signaltransduktion mit epigenetischer Kontrolle verbindet. Der neuartige Komplex enthält das Plasmamembran-assoziierte Trimer VapA-VipC-VapB. Das Dimer VipC-VapB ist über das FYVE-ähnliche Zinkfinger Protein VapA an die Plasmamembran gebunden und ermöglicht dem nuklearen VelB-VeA-LaeA Komplex die Aktivierung der Transkription der sexuellen Entwicklung. Sobald die Abkopplung vom VapA stattgefunden hat, wird VipC-VapB zum Kern transportiert. VipC-VapB interagiert physikalisch mit VeA, vermindert dessen Transport zum Kern und die Stabilität. Folglich wird der Anteil des VelB-VeA-LaeA Komplexes im Kern reduziert. Die nukleare VapB Methyltransferase vermindert die Entstehung des fakultativen Chromatins indem es die Histon 3 Lysin 9 Methylierung (H3K9 me3) vermindert. Dies begünstigt die Aktivierung der frühen Regulatorgene flbA und flbC, die dann das asexuelle Programm im Licht vorantreiben. Der VapA-VipC-VapB Methyltransferase-Weg vereinigt die Kontrolle des Kernimportes und der Stabilität von Transkriptionsfaktoren mit der Modifikation von Histonen. Erst dieses komplexe Zusammenspiel unterschiedlicher Mechanismen erlaubt eine angemessene Antwort für die Differenzierung des Pilzes.

JMJD6 or PSR (phosphatidyl serine receptor) was initially proposed to be a membrane receptor involved in apoptotic cell clearance by recognition of apoptotic cells. However, sequence analyses implied the presence of a jelly roll or double stranded beta helix (DSBH) structural domain in PSR/JMJD6 and similarity with JmjC family of enzymes which are involved in chromatin regulation. Subsequently, PSR was renamed as JMJD6 and was reported to be a histone arginine demethylase. Previous work from our group has shown that JMJD6 is a lysine hydroxylase that interacts with nuclear proteins including CROP and U2AF65 which are involved in mRNA splicing. Peptide screening and cell based assays led to the conclusion that JMJD6 catalyses lysine hydroxylation of splicing regulatory proteins containing arginine serine rich domains (SR proteins) including U2AF65 and Luc7like-2. Studies were carried out to investigate the putative arginine demethylation activity of JMJD6 using MS analysis of histone peptides and luminescence-based assays. New substrates from SR proteins were identified by immunoprecipitation of JMJD6 expressed in human cell lines followed by LC-MS/MS analysis and MALDI-MS based assays of synthesised peptide substrates. Work then focussed on studying the mechanism of lysyl-hydroxylation from substrate and enzyme perspective. A crystal structure of seleno-methionine labelled JMJD6 was obtained and it provided insights into the JMJD6 active site and its substrate interactions. Based on this data, single point variants of JMJD6 were prepared and their substrate binding properties were studied by MALDI-MS and 2OG turnover assays. Collagen lysyl-hydroxylases are also 2OG dependent oxygenases. Efforts to investigate the stereochemistry of JMJD6 catalysed hydroxylation, employing NMR and amino acid analyses were carried out. These studies led to the interesting finding that the C-5 stereochemistry of hydroxylysine in LUC7L2 peptide is opposite (2S,5S-hydroxylysine) to that present in collagen (2S,5R-hydroxylysine). It was found that JMJD6 undergoes autocatalytic self-hydroxylation. Lysine residues from both recombinant JMJD6 and that from HeLa cells at endogenous level were identified to be hydroxylated by amino acid and LC-MS/MS analyses. JMJD6 has a strong tendency to form aggregates and gel electrophoresis always reveals multimeric bands of various JMJD6 constructs. Characterisation and identification of oligomeric states of JMJD6 was carried out using Electron Microscopy. Studies were initiated to identify possible inhibitors by screening a set of 2OG analogues. The results from this preliminary inhibition studies have identified the tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates, succinate and fumarate to be JMJD6 inhibitors and form a basis of further studies aimed at identifying selective inhibitors.

Eukaryotic genomes are typically organized as chromatin, the complex of DNA and proteins that forms chromosomes within the cell\\\''s nucleus. Chromatin has pivotal roles for a multitude of functions, most of which are carried out by a complex system of covalent chemical modifications of histone proteins. The propagation of patterns of these histone post-translational modifications across cell divisions is particularly important for maintenance of the cell state in general and the transcriptional program in particular. The discovery of epigenetic inheritance phenomena - mitotically and/or meiotically heritable changes in gene function resulting from changes in a chromosome without alterations in the DNA sequence - was remarkable because it disproved the assumption that information is passed to daughter cells exclusively through DNA. However, DNA replication constitutes a dramatic disruption of the chromatin state that effectively amounts to partial erasure of stored information. To preserve its epigenetic state the cell reconstructs (at least part of) the histone post-translational modifications by means of processes that are still very poorly understood. A plausible hypothesis is that the different combinations of reader and writer domains in histone-modifying enzymes implement local rewriting rules that are capable of \\\"recomputing\\\" the desired parental patterns of histone post-translational modifications on the basis of the partial information contained in that half of the nucleosomes that predate replication. It is becoming increasingly clear that both information processing and computation are omnipresent and of fundamental importance in many fields of the natural sciences and the cell in particular. The latter is exemplified by the increasingly popular research areas that focus on computing with DNA and membranes. Recent work suggests that during evolution, chromatin has been converted into a powerful cellular memory device capable of storing and processing large amounts of information. Eukaryotic chromatin may therefore also act as a cellular computational device capable of performing actual computations in a biological context. A recent theoretical study indeed demonstrated that even relatively simple models of chromatin computation are computationally universal and hence conceptually more powerful than gene regulatory networks. In the first part of this thesis, I establish a deeper understanding of the computational capacities and limits of chromatin, which have remained largely unexplored. I analyze selected biological building blocks of the chromatin computer and compare it to system components of general purpose computers, particularly focusing on memory and the logical and arithmetical operations. I argue that it has a massively parallel architecture, a set of read-write rules that operate non-deterministically on chromatin, the capability of self-modification, and more generally striking analogies to amorphous computing. I therefore propose a cellular automata-like 1-D string as its computational paradigm on which sets of local rewriting rules are applied asynchronously with time-dependent probabilities. Its mode of operation is therefore conceptually similar to well-known concepts from the complex systems theory. Furthermore, the chromatin computer provides volatile memory with a massive information content that can be exploited by the cell. I estimate that its memory size lies in the realms of several hundred megabytes of writable information per cell, a value that I compare with DNA itself and cis-regulatory modules. I furthermore show that it has the potential to not only perform computations in a biological context but also in a strict informatics sense. At least theoretically it may therefore be used to calculate any computable function or algorithm more generally. Chromatin is therefore another representative of the growing number of non-standard computing examples. As an example for a biological challenge that may be solved by the \\\"chromatin computer\\\", I formulate epigenetic inheritance as a computational problem and develop a flexible stochastic simulation system for the study of recomputation-based epigenetic inheritance of individual histone post-translational modifications. The implementation uses Gillespie\\\''s stochastic simulation algorithm for exactly simulating the time evolution of the chemical master equation of the underlying stochastic process. Furthermore, it is efficient enough to use an evolutionary algorithm to find a system of enzymes that can stably maintain a particular chromatin state across multiple cell divisions. I find that it is easy to evolve such a system of enzymes even without explicit boundary elements separating differentially modified chromatin domains. However, the success of this task depends on several previously unanticipated factors such as the length of the initial state, the specific pattern that should be maintained, the time between replications, and various chemical parameters. All these factors also influence the accumulation of errors in the wake of cell divisions. Chromatin-regulatory processes and epigenetic (inheritance) mechanisms constitute an intricate and sensitive system, and any misregulation may contribute significantly to various diseases such as Alzheimer\\\''s disease. Intriguingly, the role of epigenetics and chromatin-based processes as well as non-coding RNAs in the etiology of Alzheimer\\\''s disease is increasingly being recognized. In the second part of this thesis, I explicitly and systematically address the two hypotheses that (i) a dysregulated chromatin computer plays important roles in Alzheimer\\\''s disease and (ii) Alzheimer\\\''s disease may be considered as an evolutionarily young disease. In summary, I found support for both hypotheses although for hypothesis 1, it is very difficult to establish causalities due to the complexity of the disease. However, I identify numerous chromatin-associated, differentially expressed loci for histone proteins, chromatin-modifying enzymes or integral parts thereof, non-coding RNAs with guiding functions for chromatin-modifying complexes, and proteins that directly or indirectly influence epigenetic stability (e.g., by altering cell cycle regulation and therefore potentially also the stability of epigenetic states). %Notably, we generally observed enrichment of probes located in non-coding regions, particularly antisense to known annotations (e.g., introns). For the identification of differentially expressed loci in Alzheimer\\\''s disease, I use a custom expression microarray that was constructed with a novel bioinformatics pipeline. Despite the emergence of more advanced high-throughput methods such as RNA-seq, microarrays still offer some advantages and will remain a useful and accurate tool for transcriptome profiling and expression studies. However, it is non-trivial to establish an appropriate probe design strategy for custom expression microarrays because alternative splicing and transcription from non-coding regions are much more pervasive than previously appreciated. To obtain an accurate and complete expression atlas of genomic loci of interest in the post-ENCODE era, this additional transcriptional complexity must be considered during microarray design and requires well-considered probe design strategies that are often neglected. This encompasses, for example, adequate preparation of a set of target sequences and accurate estimation of probe specificity. With the help of this pipeline, two custom-tailored microarrays have been constructed that include a comprehensive collection of non-coding RNAs. Additionally, a user-friendly web server has been set up that makes the developed pipeline publicly available for other researchers. / Eukaryotische Genome sind typischerweise in Form von Chromatin organisiert, dem Komplex aus DNA und Proteinen, aus dem die Chromosomen im Zellkern bestehen. Chromatin hat lebenswichtige Funktionen in einer Vielzahl von Prozessen, von denen die meisten durch ein komplexes System von kovalenten Modifikationen an Histon-Proteinen ablaufen. Muster dieser Modifikationen sind wichtige Informationsträger, deren Weitergabe über die Zellteilung hinaus an beide Tochterzellen besonders wichtig für die Aufrechterhaltung des Zellzustandes im Allgemeinen und des Transkriptionsprogrammes im Speziellen ist. Die Entdeckung von epigenetischen Vererbungsphänomenen - mitotisch und/oder meiotisch vererbbare Veränderungen von Genfunktionen, hervorgerufen durch Veränderungen an Chromosomen, die nicht auf Modifikationen der DNA-Sequenz zurückzuführen sind - war bemerkenswert, weil es die Hypothese widerlegt hat, dass Informationen an Tochterzellen ausschließlich durch DNA übertragen werden. Die Replikation der DNA erzeugt eine dramatische Störung des Chromatinzustandes, welche letztendlich ein partielles Löschen der gespeicherten Informationen zur Folge hat. Um den epigenetischen Zustand zu erhalten, muss die Zelle Teile der parentalen Muster der Histonmodifikationen durch Prozesse rekonstruieren, die noch immer sehr wenig verstanden sind. Eine plausible Hypothese postuliert, dass die verschiedenen Kombinationen der Lese- und Schreibdomänen innerhalb von Histon-modifizierenden Enzymen lokale Umschreibregeln implementieren, die letztendlich das parentale Modifikationsmuster der Histone neu errechnen. Dies geschieht auf Basis der partiellen Informationen, die in der Hälfte der vererbten Histone gespeichert sind. Es wird zunehmend klarer, dass sowohl Informationsverarbeitung als auch computerähnliche Berechnungen omnipräsent und in vielen Bereichen der Naturwissenschaften von fundamentaler Bedeutung sind, insbesondere in der Zelle. Dies wird exemplarisch durch die zunehmend populärer werdenden Forschungsbereiche belegt, die sich auf computerähnliche Berechnungen mithilfe von DNA und Membranen konzentrieren. Jüngste Forschungen suggerieren, dass sich Chromatin während der Evolution in eine mächtige zelluläre Speichereinheit entwickelt hat und in der Lage ist, eine große Menge an Informationen zu speichern und zu prozessieren. Eukaryotisches Chromatin könnte also als ein zellulärer Computer agieren, der in der Lage ist, computerähnliche Berechnungen in einem biologischen Kontext auszuführen. Eine theoretische Studie hat kürzlich demonstriert, dass bereits relativ simple Modelle eines Chromatincomputers berechnungsuniversell und damit mächtiger als reine genregulatorische Netzwerke sind. Im ersten Teil meiner Dissertation stelle ich ein tieferes Verständnis des Leistungsvermögens und der Beschränkungen des Chromatincomputers her, welche bisher größtenteils unerforscht waren. Ich analysiere ausgewählte Grundbestandteile des Chromatincomputers und vergleiche sie mit den Komponenten eines klassischen Computers, mit besonderem Fokus auf Speicher sowie logische und arithmetische Operationen. Ich argumentiere, dass Chromatin eine massiv parallele Architektur, eine Menge von Lese-Schreib-Regeln, die nicht-deterministisch auf Chromatin operieren, die Fähigkeit zur Selbstmodifikation, und allgemeine verblüffende Ähnlichkeiten mit amorphen Berechnungsmodellen besitzt. Ich schlage deswegen eine Zellularautomaten-ähnliche eindimensionale Kette als Berechnungsparadigma vor, auf dem lokale Lese-Schreib-Regeln auf asynchrone Weise mit zeitabhängigen Wahrscheinlichkeiten ausgeführt werden. Seine Wirkungsweise ist demzufolge konzeptionell ähnlich zu den wohlbekannten Theorien von komplexen Systemen. Zudem hat der Chromatincomputer volatilen Speicher mit einem massiven Informationsgehalt, der von der Zelle benutzt werden kann. Ich schätze ab, dass die Speicherkapazität im Bereich von mehreren Hundert Megabytes von schreibbarer Information pro Zelle liegt, was ich zudem mit DNA und cis-regulatorischen Modulen vergleiche. Ich zeige weiterhin, dass ein Chromatincomputer nicht nur Berechnungen in einem biologischen Kontext ausführen kann, sondern auch in einem strikt informatischen Sinn. Zumindest theoretisch kann er deswegen für jede berechenbare Funktion benutzt werden. Chromatin ist demzufolge ein weiteres Beispiel für die steigende Anzahl von unkonventionellen Berechnungsmodellen. Als Beispiel für eine biologische Herausforderung, die vom Chromatincomputer gelöst werden kann, formuliere ich die epigenetische Vererbung als rechnergestütztes Problem. Ich entwickle ein flexibles Simulationssystem zur Untersuchung der epigenetische Vererbung von individuellen Histonmodifikationen, welches auf der Neuberechnung der partiell verlorengegangenen Informationen der Histonmodifikationen beruht. Die Implementierung benutzt Gillespies stochastischen Simulationsalgorithmus, um die chemische Mastergleichung der zugrundeliegenden stochastischen Prozesse über die Zeit auf exakte Art und Weise zu modellieren. Der Algorithmus ist zudem effizient genug, um in einen evolutionären Algorithmus eingebettet zu werden. Diese Kombination erlaubt es ein System von Enzymen zu finden, dass einen bestimmten Chromatinstatus über mehrere Zellteilungen hinweg stabil vererben kann. Dabei habe ich festgestellt, dass es relativ einfach ist, ein solches System von Enzymen zu evolvieren, auch ohne explizite Einbindung von Randelementen zur Separierung differentiell modifizierter Chromatindomänen. Dennoch ängt der Erfolg dieser Aufgabe von mehreren bisher unbeachteten Faktoren ab, wie zum Beispiel der Länge der Domäne, dem bestimmten zu vererbenden Muster, der Zeit zwischen Replikationen sowie verschiedenen chemischen Parametern. Alle diese Faktoren beeinflussen die Anhäufung von Fehlern als Folge von Zellteilungen. Chromatin-regulatorische Prozesse und epigenetische Vererbungsmechanismen stellen ein komplexes und sensitives System dar und jede Fehlregulation kann bedeutend zu verschiedenen Krankheiten, wie zum Beispiel der Alzheimerschen Krankheit, beitragen. In der Ätiologie der Alzheimerschen Krankheit wird die Bedeutung von epigenetischen und Chromatin-basierten Prozessen sowie nicht-kodierenden RNAs zunehmend erkannt. Im zweiten Teil der Dissertation adressiere ich explizit und auf systematische Art und Weise die zwei Hypothesen, dass (i) ein fehlregulierter Chromatincomputer eine wichtige Rolle in der Alzheimerschen Krankheit spielt und (ii) die Alzheimersche Krankheit eine evolutionär junge Krankheit darstellt. Zusammenfassend finde ich Belege für beide Hypothesen, obwohl es für erstere schwierig ist, aufgrund der Komplexität der Krankheit Kausalitäten zu etablieren. Dennoch identifiziere ich zahlreiche differentiell exprimierte, Chromatin-assoziierte Bereiche, wie zum Beispiel Histone, Chromatin-modifizierende Enzyme oder deren integrale Bestandteile, nicht-kodierende RNAs mit Führungsfunktionen für Chromatin-modifizierende Komplexe oder Proteine, die direkt oder indirekt epigenetische Stabilität durch veränderte Zellzyklus-Regulation beeinflussen. Zur Identifikation von differentiell exprimierten Bereichen in der Alzheimerschen Krankheit benutze ich einen maßgeschneiderten Expressions-Microarray, der mit Hilfe einer neuartigen Bioinformatik-Pipeline erstellt wurde. Trotz des Aufkommens von weiter fortgeschrittenen Hochdurchsatzmethoden, wie zum Beispiel RNA-seq, haben Microarrays immer noch einige Vorteile und werden ein nützliches und akkurates Werkzeug für Expressionsstudien und Transkriptom-Profiling bleiben. Es ist jedoch nicht trivial eine geeignete Strategie für das Sondendesign von maßgeschneiderten Expressions-Microarrays zu finden, weil alternatives Spleißen und Transkription von nicht-kodierenden Bereichen viel verbreiteter sind als ursprünglich angenommen. Um ein akkurates und vollständiges Bild der Expression von genomischen Bereichen in der Zeit nach dem ENCODE-Projekt zu bekommen, muss diese zusätzliche transkriptionelle Komplexität schon während des Designs eines Microarrays berücksichtigt werden und erfordert daher wohlüberlegte und oft ignorierte Strategien für das Sondendesign. Dies umfasst zum Beispiel eine adäquate Vorbereitung der Zielsequenzen und eine genaue Abschätzung der Sondenspezifität. Mit Hilfe der Pipeline wurden zwei maßgeschneiderte Expressions-Microarrays produziert, die beide eine umfangreiche Sammlung von nicht-kodierenden RNAs beinhalten. Zusätzlich wurde ein nutzerfreundlicher Webserver programmiert, der die entwickelte Pipeline für jeden öffentlich zur Verfügung stellt.