No / Using preparative electrophoresis, a low molecular weight protein has been partially purified from a cell extract of the equine pathogen Streptococcus equi susp. equi. N-terminal sequence analysis and Western blotting revealed the protein to be HPr, a central component of the phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system (PTS). Interestingly, the only form of the HPr protein detected in S. equi was one with the amino-terminal methionine removed, a modification that has previously been associated with surface localization of streptococcal HPr proteins.

A técnica de espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear (NMR) de alta resolução foi utilizada para estudos estruturais em duas biomoléculas: a proteína HPr da bactéria Staphylococcus aureus, e o peptídeo C da insulina humana. Ambas estão relacionadas com a regulação da absorção de glicose pelas células, no primeiro caso em procariontes, e no segundo em organismos superiores. A proteína HPr (\"Histidine-containing protein\") de Staphylococcus aureus é uma das componentes centrais do sistema PTS (fosfoenolpiruvato:açúcar-fosfotransferase) de translocação grupal, responsável pelo transporte ativo de açúcar para o interior da célula bacterial. Nesse processo, a His15 do sítio ativo de HPr é fosforilada pela enzima EI, transferindo, a seguir, o grupo fosfato para a enzima EUA A mutação His15&#8594Ala interrompe a transferência do grupo fosfato; apesar disso, a afinidade entre HPr(H15A) e as enzimas EI/EIlA se mostrou semelhante à da nativa. Utilizando técnicas de NMR bidimensionais (COSY, TOCSY, NOESY, HSQC) etridimensionais (HNCA, HNCO, NOESY-HSQC) foi determinada a estrutura da mutante His15&#8594Ala de HPr de S. aureus. Sua estrutura consiste de um sanduíche-aberto, composto de 3 hélices-a paralelamente empacotadas contra uma folha formada por 4 fitas-&#946 anti-paralelas. Esse padrão é encontrado em todas as proteínas HPr já determinadas em diversas espécies, divergindo, porém, significativamente da estrutura previamente publicada para a proteína nativa de S. aureus com relação à orientação relativa de alguns elementos de estrutura secundária. Através de uma análise detalhada dos espectros NOESY das proteínas HPr mutante e nativa puderam ser encontradas diferenças conformacionais na região em tomo do sítio-ativo. Uma comparação com as outras estruturas de HPr já publicadas revelou uma maior semelhança entre a proteína mutante de S. aureus e a proteína no complexo HPr/EI de E. coli, fornecendo evidências de que a estrutura encontrada para a mutante represente a conformação assumida pela proteína HPr no momento de sua interação com a enzima EI, assim explicando a sua afinidade inalterada. O peptídeo-C da proinsulina é importante para a biosíntese da insulina, tendo sido considerado, por muito tempo, biologicamente inerte. Estudos recentes em pacientes diabéticos retomaram a discussão quanto a sua possível atividade reguladora. Utilizando a técnica de espectroscopia de NMR bidimensional (COSY, TOCSY, NOESY), foram realizados estudos estruturais no peptídeo-C da proinsulina humana. Quando dissolvido em 50%/50% água e TFE, o peptídeo-C apresentou 3 regiões centrais (9-12, 15-18, 22-25) com tendência à formação de dobras, uma região N-terminal (2-5) com 2 conformações em voltas-&#946 tipo I e I, e uma região Cterminal (26-31), de conformação extremamente bem definida, incluindo uma volta-&#946 tipo III\' (27-30). Em estudos descritos na literatura já foi demonstrada a atividade do pentapeptídeo C-terminal (EGSLQ), na forma de interações quirais com um receptor ainda desconhecido. Estudos anteriores por NMR prevêem a existência de uma estrutura na região C-terminal, a qual foi denominada de \"CA-Knuckle\". Nossa proposta é que a estrutura aqui obtida para o pentapeptídeo C-terminal seja justamente o \"CA-Knuckle\", representando o sítio-ativo do peptídeo-C da proinsulina humana. / High resolution Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy has been used for structural studies on two biological macromolecules; the HPr protein from the bacterium Staphylococcus aureus, and the Cpeptide from human proinsulin. Both are related to the regulation of glucose absorption by celIs, the former case in prokaryotes and the latter in higher organisms. The HPr protein (Histidine Containing Protein) from S. aureus is one of the central components of the PTS (Phosphoenolpyruvate;sugar-phosphotransferase) system responsible for the active transport of sugars into the bacterial celI. During this process, His15 of the HPr active site is phosphorylated by enzyme I (EI), and then subsequently transfers this phosphate onto enzyme lIA (EIIA). The His15&#8594Ala mutant of HPr, whilst unable to participate in phosphate transfer, nevertheless retains similar affinities for both EI and EIIA. Using two-dimensional (COSY, TOCSY, NOESY, HSQC) and three-dimensional (HNCA, HNCO, NOESY-HSQC) NMR techniques, the structure of the His15Ala mutant of the HPr protein from S. aureus was determined. Its structure consists of an open &#946-sandwich, composed of three &#945-helices packed against a four-stranded anti-parallel &#946-sheet. This pattern has been seen in all other HPr proteins from other species so far determined but is markedly different from the previously published native structure from S. aureus with respect to the relative orientations of some of the elements of secondary structure. A detailed comparison of the native and mutant structures revealed differences in the conformation of the active site loop. The latter assumes a conformation similar to that seen in the structure of the complex between E. coli HPr and EI. This may explain the normal affinities of the mutant protein for EI and EIIA despite the absence of the active site histidine. The C-peptide of proinsulin is important for the biosynthesis of insulin but has been considered for a long time to be biologically inert. Recent studies in diabetic patients have stimulated a new debate concerning its possible regulatory role. Structural studies of the C-peptide were performed using two dimensional NMR spectroscopy (COSY, TOCSY and NOESY). ln the presence of 50% TFE three central regions of the molecule (residues 9-12, 15-18 and 22-25) showed tendencies to form ~-bends. The N terminal region (residues 2 to 5) was present in the form of either a type I or I\' &#946-turn, whilst the C terminal region (26-31) presented the most welI-defrnedstructure of the whole molecule which included a type III\' &#946-turn. The C-terminal pentapeptide (EGSLQ) has been described in the literature as being responsible for chiral interactions with an as yet uncharacterized receptor. Previous NMR studies have predicted the existence of a well-defined structure at the C-terminus of the C-peptide, kwown as the CAknuckle. We propose that the structure described here for the C-terminal pentapeptide is the CA-knuckle and represents the active site of the C-peptide of human proinsulin.

A técnica de espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear (NMR) de alta resolução foi utilizada para estudos estruturais em duas biomoléculas: a proteína HPr da bactéria Staphylococcus aureus, e o peptídeo C da insulina humana. Ambas estão relacionadas com a regulação da absorção de glicose pelas células, no primeiro caso em procariontes, e no segundo em organismos superiores. A proteína HPr (\"Histidine-containing protein\") de Staphylococcus aureus é uma das componentes centrais do sistema PTS (fosfoenolpiruvato:açúcar-fosfotransferase) de translocação grupal, responsável pelo transporte ativo de açúcar para o interior da célula bacterial. Nesse processo, a His15 do sítio ativo de HPr é fosforilada pela enzima EI, transferindo, a seguir, o grupo fosfato para a enzima EUA A mutação His15&#8594Ala interrompe a transferência do grupo fosfato; apesar disso, a afinidade entre HPr(H15A) e as enzimas EI/EIlA se mostrou semelhante à da nativa. Utilizando técnicas de NMR bidimensionais (COSY, TOCSY, NOESY, HSQC) etridimensionais (HNCA, HNCO, NOESY-HSQC) foi determinada a estrutura da mutante His15&#8594Ala de HPr de S. aureus. Sua estrutura consiste de um sanduíche-aberto, composto de 3 hélices-a paralelamente empacotadas contra uma folha formada por 4 fitas-&#946 anti-paralelas. Esse padrão é encontrado em todas as proteínas HPr já determinadas em diversas espécies, divergindo, porém, significativamente da estrutura previamente publicada para a proteína nativa de S. aureus com relação à orientação relativa de alguns elementos de estrutura secundária. Através de uma análise detalhada dos espectros NOESY das proteínas HPr mutante e nativa puderam ser encontradas diferenças conformacionais na região em tomo do sítio-ativo. Uma comparação com as outras estruturas de HPr já publicadas revelou uma maior semelhança entre a proteína mutante de S. aureus e a proteína no complexo HPr/EI de E. coli, fornecendo evidências de que a estrutura encontrada para a mutante represente a conformação assumida pela proteína HPr no momento de sua interação com a enzima EI, assim explicando a sua afinidade inalterada. O peptídeo-C da proinsulina é importante para a biosíntese da insulina, tendo sido considerado, por muito tempo, biologicamente inerte. Estudos recentes em pacientes diabéticos retomaram a discussão quanto a sua possível atividade reguladora. Utilizando a técnica de espectroscopia de NMR bidimensional (COSY, TOCSY, NOESY), foram realizados estudos estruturais no peptídeo-C da proinsulina humana. Quando dissolvido em 50%/50% água e TFE, o peptídeo-C apresentou 3 regiões centrais (9-12, 15-18, 22-25) com tendência à formação de dobras, uma região N-terminal (2-5) com 2 conformações em voltas-&#946 tipo I e I, e uma região Cterminal (26-31), de conformação extremamente bem definida, incluindo uma volta-&#946 tipo III\' (27-30). Em estudos descritos na literatura já foi demonstrada a atividade do pentapeptídeo C-terminal (EGSLQ), na forma de interações quirais com um receptor ainda desconhecido. Estudos anteriores por NMR prevêem a existência de uma estrutura na região C-terminal, a qual foi denominada de \"CA-Knuckle\". Nossa proposta é que a estrutura aqui obtida para o pentapeptídeo C-terminal seja justamente o \"CA-Knuckle\", representando o sítio-ativo do peptídeo-C da proinsulina humana. / High resolution Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy has been used for structural studies on two biological macromolecules; the HPr protein from the bacterium Staphylococcus aureus, and the Cpeptide from human proinsulin. Both are related to the regulation of glucose absorption by celIs, the former case in prokaryotes and the latter in higher organisms. The HPr protein (Histidine Containing Protein) from S. aureus is one of the central components of the PTS (Phosphoenolpyruvate;sugar-phosphotransferase) system responsible for the active transport of sugars into the bacterial celI. During this process, His15 of the HPr active site is phosphorylated by enzyme I (EI), and then subsequently transfers this phosphate onto enzyme lIA (EIIA). The His15&#8594Ala mutant of HPr, whilst unable to participate in phosphate transfer, nevertheless retains similar affinities for both EI and EIIA. Using two-dimensional (COSY, TOCSY, NOESY, HSQC) and three-dimensional (HNCA, HNCO, NOESY-HSQC) NMR techniques, the structure of the His15Ala mutant of the HPr protein from S. aureus was determined. Its structure consists of an open &#946-sandwich, composed of three &#945-helices packed against a four-stranded anti-parallel &#946-sheet. This pattern has been seen in all other HPr proteins from other species so far determined but is markedly different from the previously published native structure from S. aureus with respect to the relative orientations of some of the elements of secondary structure. A detailed comparison of the native and mutant structures revealed differences in the conformation of the active site loop. The latter assumes a conformation similar to that seen in the structure of the complex between E. coli HPr and EI. This may explain the normal affinities of the mutant protein for EI and EIIA despite the absence of the active site histidine. The C-peptide of proinsulin is important for the biosynthesis of insulin but has been considered for a long time to be biologically inert. Recent studies in diabetic patients have stimulated a new debate concerning its possible regulatory role. Structural studies of the C-peptide were performed using two dimensional NMR spectroscopy (COSY, TOCSY and NOESY). ln the presence of 50% TFE three central regions of the molecule (residues 9-12, 15-18 and 22-25) showed tendencies to form ~-bends. The N terminal region (residues 2 to 5) was present in the form of either a type I or I\' &#946-turn, whilst the C terminal region (26-31) presented the most welI-defrnedstructure of the whole molecule which included a type III\' &#946-turn. The C-terminal pentapeptide (EGSLQ) has been described in the literature as being responsible for chiral interactions with an as yet uncharacterized receptor. Previous NMR studies have predicted the existence of a well-defined structure at the C-terminus of the C-peptide, kwown as the CAknuckle. We propose that the structure described here for the C-terminal pentapeptide is the CA-knuckle and represents the active site of the C-peptide of human proinsulin.

HPr fait partie du système de transport phosphoénolpyruvate: sucre phosphotransferase (PTS). HPr peut être phosphorylée sur Hisis, par l'enzyme I (El) du PTS, et sur Sér46, par la HPr(Ser) kinase/phosphorylase (HprK/P). Finalement, HPr peut être phosphorylée sur les deux résidus, ce qui génère HPr(Ser-P)(His~P). L'objectif principal de l'étude présentée dans cette thèse était de déterminer par quelle(s) voie(s) HPr(Ser-P)(His~P) est synthétisée chez les streptocoques. Théoriquement, HPr(Ser-P)(His~P) peut être synthétisée via la phosphorylation de HPr(Ser-P) par El et/ou de HPr(His-P) par HprK/P. Nous avons étudié la cinétique de ces voies de synthèse chez Streptococcus salivarius. Les résultats de l'étude avec El ont montré que (i) la kcat/Km pour HPr(Ser-P) était ~5 OOOx plus faible que pour HPr à pH 7,9 et 37°C, (ii) aucun intermédiaire glycolytique ne stimulait la synthèse de HPr(Ser-P)(His~P), (iii) la synthèse de HPr(Ser-P)(His~P) était ~8x plus efficace à pH acide, des conditions retrouvées dans le cytoplasme des streptocoques en croissance, et (iv) la synthèse du HPr(Ser-P)(His~P) de Bacillus subtilis par El de cet organisme était aussi stimulée à pH acide. Les résultats suggèrent que la synthèse de HPr(Ser-P)(His~P) chez les streptocoques résulterait des concentrations élevées en HPr(Ser-P) et de la stimulation de la réaction à pH acide. L'absence de HPr(Ser-P)(His~P) chez B. subtilis cultivée en présence de glucose s'expliquerait en partie par le fait que cette bactérie maintient son pH intracellulaire constamment au-dessus de la neutralité. Les résultats de l'étude avec HprK/P ont montré que les kQJKm pour les HPr(H15D) et HPr(H15E) étaient ~13x plus faibles que pour HPr à pH 7,4 et 37°C. Dans des conditions où HPr(His~P) était stable (pH 8,6 et 15°C), les kcJKm pour HPr(H15D) et HPr(His~P) Ill étaient respectivement neuf et 26 fois plus faibles que pour HPr. Finalement, la phosphorylation de HPr(H15D) n'était que marginalement stimulée à pH acide et le FBP ne stimulait pas la synthèse de HPr(Ser-P)(His~P). Les résultats suggèrent que (i) l'inefficacité de la phosphorylation de HPr(His~P) résulterait de la présence de la charge négative en position 15 et d'autres éléments structuraux et (ii) la contribution de HprK/P à la synthèse de HPr(Ser-P)(His~P) chez les streptocoques serait marginale.

No / We have investigated the surface localisation of the phosphotransferase system protein HPr in the equine pathogen Streptococcus equi subsp. equi using immunogold localisation and transmission electron microscopy. Like the LppC acid phosphatase lipoprotein, a reference surface antigen, the S. equi HPR could be clearly detected on the surfaces of intact cells. This study is consistent with previous reports that some streptococcal HPr is cell surface associated and suggests that the extracytoplasmic mobilisation and transfer of phosphate groups by streptococci warrant further investigation.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2009. / Bibliogr.: f. 166-196. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

No / We have investigated the surface localisation of the phosphotransferase system protein HPr in the equine pathogen Streptococcus equi subsp. equi using immunogold localisation and transmission electron microscopy. Like the LppC acid phosphatase lipoprotein, a reference surface antigen, the S. equi HPR could be clearly detected on the surfaces of intact cells. This study is consistent with previous reports that some streptococcal HPr is cell surface associated and suggests that the extracytoplasmic mobilisation and transfer of phosphate groups by streptococci warrant further investigation.

För att transporterna skall bli mer ekonomiska och samtidigt ha en liten miljöpåverkan krävs det att maximera transporterna viktmässigt och minimera avstånden. Ett tillvägagångssätt för att utnyttja lastkapaciteten är att ha en hög medellängd på virket för att transportera mindre luft i den begränsade volymen på lastbilen. Den här studien undersöker medellängder på massaved hos Sydved. Sydved har ett miljömål där 90% av volymen skall hålla minst 4,2 m medellängd på barr, gran och lövmassaved. En ökad medellängd på massaveden får inte påverka timmerutbytet eftersom det primära skall vara att aptera för bästa ekonomi för markägaren. Studien undersöker om och hur aptering för en ökad medellängd på massaved av gran påverkar timmerutbytet. Studien resulterar i att aptera massaveden till högre medellängder för att nå miljömålet kan påverka timmerutbytet både positivt och negativt.

C-Terminal glycine-extended prohormones are enzymatically converted to á-amidated peptides, by peptidylglycine á-amidating monooxygenase (PAM). PAM is a bifunctional enzyme with two catalytic domains: peptidylglycine á-hydroxylating monooxygenase (PHM) and peptidylglycine peptidylglycineaminoglycolate lyase (PAL). PAM has a significant role in the proliferation of androgen-independent prostate cancer. Thus, the inhibition of PAM could halt cancer growth. Hippurate and hippurate analogs were used as lead compounds for developing inhibitors for PAM. The hippurate analogs exhibiting the highest affinity to PAM (lowest inhibition constant) did inhibit the growth of human androgen-independent prostate cancer DU 145 cells.

Regensburg, Univ., Diss., 2008.