There has been a rapid increase in the number of overweight and obese individuals worldwide in the past 50 years. It has been assumed that an increased caloric intake and a more sedentary lifestyle are the main causes of this rise. However, recent evidence has shown that the microbes that live in the human gastrointestinal tract may play a role in the regulation of weight and obesity development. These microbes, termed the gut microbiota, are commensal and symbiotic microbes that are densely populated throughout an individual's gastrointestinal tract. This paper presents the relevant research and possible mechanisms of how these microbes, mainly bacteria, are thought to play a role in weight regulation and obesity.

No description available.

Antagonistic interactions between competing species of bacteria are an important driver of bacterial community composition in the human gut microbiota. Of particular significance is the role of the type six secretion system (T6SS), which many species of Gram-negative bacteria use to kill competitor bacteria in a contact-dependent manner. T6SSs are syringe-like nanomachines that function to deliver antibacterial toxins into susceptible competitors. Many bacteria present in the human gut microbiota possess an extremely potent T6SS that is capable of rapidly eradicating nearby bacteria. Remarkably, however, species of beneficial bacteria that coexist in the gut are often resistant to T6SS attack by their neighbours. This resistance is mediated by bacterial immunity proteins that block the activity of the antibacterial toxins delivered by the T6SS. Intriguingly, past studies have shown that the widespread T6SS-mediated competition in the gut has led to the acquisition of repertoires of immunity genes across different bacterial strains. By examining available human gut metagenomes, I identified a putative immunity locus, named I2, in a species of gut bacteria. This locus is located downstream of its cognate T6SS toxin-encoding locus, E2, and I show when co-expressed with E2 in E. coli, it protects against E2 mediated-toxicity. Additionally, I show that four gut-derived I2 homologues bearing sequence identity levels to I2 ranging from 38% to 75% are equally capable of abrogating E2 toxicity. Using quantitative biophysical measurements, I also show that these I2 homologues physically bind E2 equally tightly pointing to the potential molecular mechanism of toxin neutralization. Lastly, through mutagenesis experiments, I found that the E2-I2 interaction is likely mediated by electrostatic forces between a small number of residues found in the interaction interface of the two proteins. Overall, these findings demonstrate that a human gut microbiome encoded type VI secretion system effector can be neutralized by divergent immunity proteins. / Thesis / Master of Science (MSc)

Le microbiote digestif, composé de 1012 à 1014 bactéries par gramme de selle, est dominé par les bactéries anaérobies. Ces dernières, qui dépassent largement les aérobies, ont été découvertes en 1865 par Louis Pasteur dans ses travaux sur la fermentation. Les bactéries anaérobies représentent un intérêt médical particulier par leur implication dans les maladies infectieuses et métaboliques. Les anaérobies sont caractérisés par leur difficulté à être cultivés, car nécessitant une absence ou des concentrations faibles d’oxygène. Ainsi les connaissances sur ces microorganismes étaient limitées. Cependant, avec l’avènement des outils de biologie moléculaire notamment le séquençage à haut débit et le concept culturomics associé à l’identification par spectrométrie de mass MALDI-TOF, la connaissance des microorganismes anaérobies a été accentuée. Dans ce travail, nous nous sommes attelés dans un premier temps à la mise au point d’un milieu de culture efficace pour la culture des bactéries anaérobies et les tests d’activités antimicrobiennes. Nous avons montré dans un deuxième temps que culturomics, associé au MALDI-TOF, était un outil puissant dans l’identification des bactéries anaérobies en microbiologie clinique, mais également dans l’exploration de la diversité microbienne du tube digestif. Cette technique nous a permis d’isoler 19 nouvelles espèces de bactéries anaérobies dont 9 ont été décrites dans la troisième partie de ce travail. / The human gut microbiota is known to contain around 1012 to 1014 bacteria per gram of feces, with the majority being anaerobic. The latters were first discovered in 1865 by Louis Pasteur while working on fermentation. Anaerobic bacteria are known to play an important role in health and diseases and thus have taken a lot of attention in the medical field, especially in infectiousdiseases and metabolism. These bacteria are known for its sophisticated culture system because its growth requires little to no oxygen. Nevertheless, few is known about these type of microorganisms but with the advancement of molecular biology and sequencing techniques, its study became wider. Culturomics, is a recently developed culture-based approach that relies on optimizing culture conditions for bacterial growth and its identification by MALDI-TOF MS and 16S rRNA sequencing. The present work aims to create and optimized culture condition for anaerobic bacteria along with testing its anaerobic activities. Also, we aim to demonstrate the efficiency of Culturomics and MALDI-TOF in culturing, identifying and describing anaerobic bacteria in clinical microbiology and in the human gut. This approach allowed us to isolate 19 new anaerobic species out of which 9 has been described in this work.Keywords: Human gut microbiota, culture of anaerobic bacteria, culturomics, MALDI-TOF.

Ce travail de thèse a pour but de modéliser la capacité de dégradation des polysaccharides non digestibles par le microbiote intestinal humain. Nous exploitons pour cela des données métagénomiques. Il s'agit de données d'abondances de séquences de nucléotides dans 1408 échantillons dont les fonctions métaboliques sont assignées par annotation contre une base de données. Les séquences sont annotées par des marqueurs fonctionnels. Après une étape de sélection manuelle de 86 marqueurs fonctionnels pertinents à l'activité de métabolisation des polysaccharides, nous étudions leurs variations d'abondances parmi les échantillons métagénomiques.Nous proposons une approche de modélisation écologique du microbiote intestinal humain et considérons principalement la sélection fonctionnelle intense de cet écosystème pour faire l'hypothèse que des regroupements identiques de fonctions métaboliques sont présents en proportions différentes dans tous les microbiotes intestinaux humains. Nous proposons le terme d'assemblage fonctionnel qui rend compte de la co-occurrence spatiale et temporelle d'un groupement de fonctions. Ces assemblages sont en pratiques déterminés par leur composition en marqueurs fonctionnels, et peuvent s'interpréter comme une combinaison de traits fonctionnels agrégés au niveau des microorganismes composant l'assemblage.Les assemblages fonctionnels sont inférés par le biais d'une factorisation en matrice positive aussi nommée NMF de l'anglais Non-Negative Matrix Factorisation. Cette méthode permet de déterminer les assemblages fonctionnels, à la fois concernant leur composition et à la fois concernant leur abondance dans chacun des 1408 échantillons. Nous exploitons par ailleurs une information métabolique provenant de 190 génomes microbiens et de la bibliographie qui permet de préciser la composition de ces assemblages fonctionnels. Cette information se traduit sous forme d'une contrainte.Nous trouvons 4 assemblages en considérant un consensus entre différents critères. L'utilisation de l'information métabolique nous permet d'interpréter biologiquement ces assemblages. Les métadonnées associées aux 1408 échantillons nous permettent d'observer un comportement différent pour les échantillons provenant d'individus atteints de la maladie de Crohn. Nous validons cette observation sur des données extérieures.Nous avons proposé une approche réductionniste permettant de représenter un processus métabolique important à l'échelle du microbiote. Nous trouvons un nombre réduit de 4 assemblages fonctionnels qui sont biologiquement vraisemblables et permettent de bien approcher les 1408 échantillons métagénomiques. / The purpose of this work of thesis is to model the capacity of degradation of non-digestible polysaccharides by the human intestinal microbiote. To this end we exploit metagenomic data. We use abundances of nucleotide sequences in 1408 samples whose metabolic function are assigned by annotation against a database. The sequences are annotated with functional markers. Upon manual selection of 86 functional markers relevant to the activity of metabolisation of polysaccharides, we their abundances variation among the metagenomic samples are studied.We propose an ecological approach in modeling the human intestinal microbiote. We consider the intense functional selection of this ecosystem and assume that identical cluster of metabolic functions can be found in different proportions in every human gut microbiota. We propose the term of functional assembly as to account for spacial and temporal co-occurence of functional cluster. In practice, theses assemblies are determined by their composition and can be interpreted as combinations of functional traits aggregated at the levels of the cluster of microorganisms composing each assembly. Functional assemblies are inferred by the means of Non-Negative Matrix Factorization (NMF). This method allows to determine the composition of functional assemblies and their abundance in each of the 1408 metagenomic sample.Furthermore, we exploit metabolic information from bibliographic resources and 190 microbial genomes in order to specify the composition of these functional assemblies. This information is translated in the form of a constraint.We find 4 assemblies by considering a consensus between various criteria. The use of metabolic information allow to interpret theses assemblies biologically. By exploiting the metadata of the 1408 samples, we observe a different behaviour for the samples coming from individuals suffering from Crohn disease. We validate this observation on external data.We proposed a reductionistic approach allowing to represent an important metabolic process at the level of the microbiota. We find a small number of 4 functional assemblies which are biologically likely and approach well the 1408 metagenomic samples.

L’avènement du séquençage métagénomique aléatoire a révolutionné la microbiologie en permettant la caractérisation sans culture préalable de communautés microbiennes complexes telles que le microbiote intestinal humain. Des outils bioinformatiques récemment développés atteignent une résolution au niveau de la souche en recensant des gènes accessoires ou en capturant des variants nucléotidiques (SNPs). Toutefois, ces outils sont limités par l’étendue des génomes de référence disponibles qui sont loin de couvrir toute la variabilité microbienne. En effet, de nombreuses espèces n’ont pas encore été séquencées ou sont représentées par seulement quelques génomes.La création de catalogues de gènes non redondants par assemblage de novo suivie du regroupement des gènes co-abondants révèlent une partie de la matière noire microbienne en reconstituant le répertoire de gènes d’espèces potentiellement inconnues. Bien que les méthodes existantes identifient avec précision les gènes core présents dans toutes les souches d’une espèce, elles omettent de nombreux gènes accessoires ou les divisent en petits groupes de gènes qui ne sont pas associés aux core génomes. Or, capturer ces gènes accessoires est indispensable en recherche clinique et épidémiologique car ces derniers assurent des fonctions spécifiques à certaines souches telles que la pathogénicité ou la résistance aux antibiotiques.Lors de cette thèse, nous avons développé MSPminer, un logiciel performant qui reconstitue et structure des pan-génomes d’espèces métagénomiques (ou MSPs pour Metagenomic Species Pan-genomes) en regroupant les gènes co-abondants dans un ensemble d’échantillons métagénomiques. MSPminer s’appuie sur une nouvelle mesure robuste de la proportionnalité couplée à un classificateur empirique pour regrouper et distinguer les gènes core mais aussi les gènes accessoires des espèces microbiennes.Grâce à MSPminer, nous avons structuré un catalogue de 9,9 millions de gènes du microbiote intestinal humain en 1 661 MSPs. L’homogénéité de l’annotation taxonomique, de la composition nucléotidique ainsi que la présence de gènes essentiels indiquent que les MSPs ne correspondent pas à des chimères mais à des objets biologiquement cohérents regroupant des gènes provenant de la même espèce. Parmi ces MSPs, 1 301 (78%) n’ont pas pu être annotées au niveau espèce montrant que de nombreux microorganismes colonisant l’intestin humain demeurent inconnus malgré les progrès substantiels des techniques de culture microbienne. Remarquablement, les MSPs capturent bien plus de gènes que les clusters générés par les outils existants tout en garantissant une spécificité élevée.Cet ensemble de MSPs peut d’ores et déjà être utilisé pour le profilage taxonomique et la découverte de biomarqueurs dans des échantillons de selles humaines. Ainsi, nous tirons parti des MSPs pour comparer l’impact sur le microbiote intestinal des deux principaux types de chirurgie bariatrique, la gastrectomie par laparoscopie (LSG) et la dérivation gastrique de Roux-en-Y (LRYGB). Enfin, les MSPs ouvrent la voie à des analyses au niveau souche. Dans une autre cohorte, nous avons mis en évidence l’existence de sous-espèces associées à l’origine géographique de l’hôte en étudiant les profils de présence/absence des gènes accessoires groupés dans les MSPs. / The advent of shotgun metagenomic sequencing has revolutionized microbiology by allowing culture-independent characterization of complex microbial communities such as the human gut microbiota. Recently developed bioinformatics tools achieved strain-level resolution by making a census of accessory genes or by capturing nucleotide variants (SNPs). Yet, these tools are hampered by the extent of available reference genomes which are far from covering all the microbial variability. Indeed, many species are still not sequenced or are represented by only few genomes.Building of non-redundant gene catalogs followed by the binning of co-abundant genes reveals a part of the microbial dark matter by reconstituting the gene repertoire of species potentially unknown. While existing methods accurately identify core genes present in all the strains of a species, they miss many accessory genes or split them into small gene groups that remain unassociated to core genomes. However, capturing these accessory genes is essential in clinical research and epidemiology because they provide functions specific to certain strains such as pathogenicity or antibiotic resistance.In this thesis, we developed MSPminer, a computationally efficient software tool that reconstitutes Metagenomic Species Pan-genomes (MSPs) by binning co-abundant genes across metagenomic samples. MSPminer relies on a new robust measure of proportionality coupled with an empirical classifier to group and distinguish not only species core genes but accessory genes also.With MSPminer, we structured a catalog made up of 9.9 million genes of the human gut microbiota in 1 661 MSPs. The homogeneity of the taxonomic annotation, of the nucleotide composition as well as the presence of essential genes indicate that the MSPs do not correspond to chimeras but to biologically consistent objects grouping genes from the same species. Among these MSPs, 1 301 (78%) could not be annotated at species level showing that many microorganisms colonizing the human intestinal tract are still unknown despite the substantial improvements of microbial culture techniques. Remarkably, MSPs capture more genes than clusters generated by existing tools while ensuring high specificity.This set of MSPs can be readily used for taxonomic profiling and biomarkers discovery in human gut metagenomic samples. In this way, we take advantage of the MSPs to compare the impact of two main types of surgeries, the laparoscopic sleeve gastrectomy (LSG) and the Roux-En-Y gastric bypass (LRYGB). Finally, the MSPs open the way to strain-level analyses. In another cohort, we identified subspecies associated the host geographical origin by studying presence/absence patterns of the accessory genes grouped in the MSPs.

Les α-galactosides sont des glucides non digestibles constitués d'unités galactose liées en α(1,6). Les α-galactosides de la famille du raffinose (RFO) sont, avec le saccharose, les principaux oligosaccharides des légumineuses. Cependant, aucune activité α(1,6)-galactosidase n'est retrouvée au niveau de l'épithélium intestinal humain, les RFO sont donc exclusivement fermentés par les enzymes microbiennes. Ces travaux introduisent une enzyme bifonctionnelle de Ruminococcus gnavus E1, un membre majoritaire du microbiote intestinal humain, présentant une activité α(1,6)-galactosidase/ saccharose kinase (AgaSK). L'analyse de la séquence peptidique montre qu'AgaSK présente deux domaines : un domaine homologue aux α-galactosidases GH36, et un autre contenant un motif de fixation des nucléotides (motif A de Walker). La caractérisation des paramètres biochimiques d'AgaSK met en évidence cette bifonctionnalité puisqu'elle est capable d'hydrolyser les α(1,6)-galactosides solubles, et parallèlement en présence d'ATP de phosphoryler le saccharose spécifiquement sur la position C6 du glucose. La production directe de saccharose-6-phosphate à partir de l'hydrolyse du raffinose constitue une voie métabolique jamais décrite chez les bactéries. L'analyse de chacun des domaines montre que les domaines isolés d'AgaSK sont actifs mais la comparaison de leurs paramètres cinétiques montre qu'il y a des différences entre la protéine entière et les domaines isolés. La résolution de la structure du domaine α-galactosidase en complexe avec le galactose démontre que l'état oligomérique est nécessaire pour le bon repliement de la protéine et pour une fixation efficace du substrat. / Α-galactosides are non digestible carbohydrates present in many leguminous plants. Soluble α-galactosides consist of galactose units α(1,6) linked to different carbohydrates. Among these, the raffinose family oligosaccharides (RFO) and sucrose, are the most abundant oligosaccharides found in legumes. However, no α(1,6)galactosidase activity exists in the human intestine mucosa and α-galactosides are exclusively fermented by microbial α(1,6)galactosidases (EC3.2.1.22). Here we introduce a bifunctional enzyme, the α(1,6)galactosidase/sucrose kinase (AgaSK) whose gene is highly transcribed in vivo by Ruminococcus gnavus E1, a major member of human dominant intestinal microbiota. Sequence analysis showed that AgaSK is composed of two domains: one closely related to α-galactosidases from glycoside hydrolase family GH36 and the other containing a nucleotide binding motif (Walker A motif). Its biochemical characterization showed that AgaSK is able to hydrolyze efficiently soluble α-galacosides. Furthermore, AgaSK it is able to bind nucleotide to phosphorylate specifically on the C6 position of glucose sucrose. The production of sucrose-6-P directly from raffinose brings out a glycolytic pathway in bacteria, not described so far. In addition, AgaSK isolated domains are active but the biochemical characterization has shown that there are differences in the activities between the whole protein and isolated domains. The crystal structures of the galactosidase domain in complex with the product shed light onto the reaction and substrate recognition mechanisms and highlight an oligomeric state necessary for efficient substrate binding.