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In vivo regeneration of rat laryngeal cartilage with mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells via neural crest cells / 神経堤細胞を介して誘導したヒトiPS細胞由来間葉系幹細胞を用いたラット喉頭軟骨再生

Yoshimatsu, Masayoshi 26 July 2021 (has links)
京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23417号 / 医博第4762号 / 新制||医||1052(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 松田 秀一特定拠点, 教授 妻木 範行, 教授 安達 泰治 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM
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The effect of electric fields on hyaline cartilage: an in vitro and in silico study

Vaca González, Juan Jairo 02 May 2019 (has links)
Tesis por compendio / [ES] El cartílago hialino es un tejido conectivo denso con poca capacidad de auto regeneración cuando es afectado por patologías degenerativas. Por lo tanto, la estimulación eléctrica se ha propuesto como una terapia alternativa no invasiva para mejorar la reparación del cartílago hialino. De acuerdo con esto, este trabajo presenta un enfoque computacional y experimental combinado para entender mejor la biología del cartílago hialino y su respuesta a la estimulación eléctrica usando diferentes modelos in vitro. En primer lugar, se ha desarrollado un modelo mecanobiológico para simular el proceso de osificación endocondral. Por otro lado, se ha evaluado el efecto de la estimulación eléctrica sobre el cartílago hialino en tres escenarios diferentes. Inicialmente se ha analizado la proliferación celular y la síntesis de glicosaminoglicanos de condrocitos cultivados en monocapa y estimulados con campos eléctricos. Luego, se ha realizado un análisis histomorfométrico a explantes de condroepífisis que fueron estimulados eléctricamente. Por último, se ha evaluado el efecto de los campos eléctricos sobre la diferenciación condrogénica de células madre mesenquimales cultivadas en hidrogeles. Los resultados indican que la estimulación eléctrica es un estímulo biofísico prometedor, ya que este tipo de estimulación mejora la viabilidad y la proliferación celular, induce cambios morfológicos en los condrocitos, y estimula la síntesis de las principales moléculas que componen el cartílago hialino, tales como SOX-9, glicosaminoglicanos y agrecan. Además, este proyecto es el primer paso hacia la implementación de un estímulo biofísico alternativo que modifica la dinámica celular de los condrocitos de la placa de crecimiento en condiciones ex vivo. Adicionalmente, este estudio resalta el efecto potencial de los campos eléctricos para inducir el proceso de condrogénesis de células madre mesenquimales cultivadas en condiciones basales. En general, la evaluación de la estimulación eléctrica sobre condrocitos, tejidos y andamios es una herramienta útil que puede contribuir al conocimiento actual de las terapias regenerativas enfocadas en la regeneración del cartílago hialino. / [CA] El cartílag hialí és un teixit connectiu dens amb poca capacitat d'auto regeneració quan es veu afectat per patologies degeneratives. Per tant, l'estimulació elèctrica s'ha proposat com una teràpia alternativa no invasiva per millorar la reparació del cartílag articular. D'acord amb això, aquest treball presenta un enfoc computacional i experimental combinat per entendre millor la biologia del cartílag hialí i la seva resposta a l'estimulació elèctrica usant diferents models in vitro. En primer lloc, s'ha desenvolupat un model mecanobiològic per simular el procés d'ossificació endocondral. D'altra banda, s'ha avaluat l'efecte de l'estimulació elèctrica sobre el cartílag hialí en tres escenaris diferents. Inicialment s'ha analitzat la proliferació cel·lular i la síntesi de glicosaminoglicans de condròcits cultivats en monocapa i estimulats amb camps elèctrics. Després, s'ha realitzat una anàlisi histomorfomètrica a explants de condroepífisis que van ser estimulats elèctricament. Finalment, s'ha avaluat l'efecte dels camps elèctrics sobre la diferenciació condrogénica de cèl·lules mare mesenquimals cultivades en hidrogels. Els resultats indiquen que l'estimulació elèctrica és un estímul biofîsic prometedor, ja que aquest tipus d'estimulació millora la viabilitat i la proliferació cel·lular, indueix canvis morfològics en els condròcits, i estimula la síntesi de les principals molècules que componen el cartílag hialí, com ara SOX-9, glicosaminoglicans i agrecan. A més, aquest projecte és el primer pas cap a la implementació d'un estímul biofísic alternatiu que modifica la dinàmica cel·lular dels condròcits de la placa de creixement en condicions ex vivo. Addicionalment, aquest estudi ressalta l'efecte potencial dels camps elèctrics per induir el procés de condrogènesi de cèl·lules mare mesenquimals cultivades en condicions basals. En general, l'avaluació de l'estimulació elèctrica sobre condròcits, teixits i scaffolds és una eina útil que pot contribuir al coneixement actual de les teràpies regeneratives enfocades a la regeneració del cartílag hialí. / [EN] Hyaline cartilage is a dense connective tissue with low self-healing capacity when is affected by degenerative pathologies. Therefore, electrical stimulation has been proposed as a possible non-invasive alternative therapy to enhance the restoration of the cartilaginous tissue. Accordingly, this work presents a combined computational and experimental approach to understand better the hyaline cartilage biology and its response to electrical stimulation using different in vitro models. On the one hand, a mechanobiological model was developed to simulate the endochondral ossification process. On the other hand, the electrical stimulation on hyaline cartilage was evaluated in three different scenarios. Initially, cell proliferation and glycosaminoglycans synthesis of chondrocytes, cultured in monolayer and stimulated with electric fields, was analyzed. Then, a histomorphometric analysis was performed to chondroepiphysis explants that were electrically stimulated. Finally, the effects of the electric fields on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells cultured in hydrogels was assessed. The results indicated that electrical stimulation is a promising biophysical stimulus, due to the fact that this type of stimulation enhances the viability and the proliferation of cells, induces morphological changes in the chondrocytes, and stimulates the synthesis of the main molecules that compose the hyaline cartilage, such as SOX-9, glycosaminoglycans and aggrecan. Moreover, this project is the first step towards the implementation of an alternative biophysical stimulus that modifies the cellular dynamics of growth plate chondrocytes in ex vivo conditions. Additionally, this study highlights the potential effect of electric fields to induce the chondrogenesis process of mesenchymal stem cells cultured in basal conditions. Overall, the assessment of electrical stimulation on chondrocytes, tissues and scaffolds is a useful tool that may contribute to the current knowledge of regenerative therapies focused on hyaline cartilage healing. / To the financial support from COLCIENCIAS – COLFUTURO through the fellowship No. 647 for national doctorates. To the financial support from COLCIENCIAS through the research grant 712-2015 No. 50457. To the financial support from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness through the MAT2016-76039-C4-1-R project. / Vaca González, JJ. (2019). The effect of electric fields on hyaline cartilage: an in vitro and in silico study [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/120023 / Compendio
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Histomorfologické změny chrupavkových tkání za patologických stavů i po transplantaci u lidí a v experimentu / Histomorphological Changes in Normal and Pathological Cartilage Tissues and after their Experimental and Clinical Transplantation

Kaňa, Radim January 2011 (has links)
1 Abstract Introduction Autologous transplants of the cartilage tissue from the pinna is commonly used in reconstructive surgery of the nasal skeleton. The present study used animal models to elucidate responses of the auricular cartilage to its damage or transplantation to ectopic sites. Histomorphological analysis of changes observed in auricular cartilage including immunohistochemical study of different isoforms of actin and S-100 proteins was performed. Human articular cartilage prepared by in vitro cultivation using artificial scaffolds was also studied after its transplantation. Aims of the study The aim was to study histological changes and expression of chondrocytic markers (α- SMA and S-100 proteins) in intact, artificially traumatised, or in a human auricular cartilage cultivated in culture medium. An attempt to grow human auricular cartilage chondrocytes implanted in vitro into various types of three dimensional scaffolds aimed at testing chondrocyte survival and phenotype both in the culture and after transplantation to immunodeficient mice. A human auricular cartilage transplanted into the nasal skeleton of patients during a reconstruction surgery should be submitted to a histomorphological examination. Research assumed also comparison of the auricular cartilage responses to a damage,...
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Histomorfologické změny chrupavkových tkání za patologických stavů i po transplantaci u lidí a v experimentu / Histomorphological Changes in Normal and Pathological Cartilage Tissues and after their Experimental and Clinical Transplantation

Kaňa, Radim January 2011 (has links)
1 Abstract Introduction Autologous transplants of the cartilage tissue from the pinna is commonly used in reconstructive surgery of the nasal skeleton. The present study used animal models to elucidate responses of the auricular cartilage to its damage or transplantation to ectopic sites. Histomorphological analysis of changes observed in auricular cartilage including immunohistochemical study of different isoforms of actin and S-100 proteins was performed. Human articular cartilage prepared by in vitro cultivation using artificial scaffolds was also studied after its transplantation. Aims of the study The aim was to study histological changes and expression of chondrocytic markers (α- SMA and S-100 proteins) in intact, artificially traumatised, or in a human auricular cartilage cultivated in culture medium. An attempt to grow human auricular cartilage chondrocytes implanted in vitro into various types of three dimensional scaffolds aimed at testing chondrocyte survival and phenotype both in the culture and after transplantation to immunodeficient mice. A human auricular cartilage transplanted into the nasal skeleton of patients during a reconstruction surgery should be submitted to a histomorphological examination. Research assumed also comparison of the auricular cartilage responses to a damage,...
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Histologische Charakterisierung eines murinen Knorpeldestruktionsmodells in der BALB/c Maus

Naue, Janine 02 November 2015 (has links) (PDF)
Die rheumatoide Arthritis ist eine chronisch-entzündliche Bindegewebserkrankung mit symmetrischem Befall der Gelenke. Die genaue Ätiologie ist bisher unbekannt. Aktivierte synoviale Fibroblasten sollen durch gesteigerte Adhäsion und Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Matrix-lysierenden Proteasen maßgeblich an der Gelenkdestruktion beteiligt sein. Ziel dieser Arbeit war es, ein neues in-vivo-Knorpeldestruktions-Modell zu etablieren, in welchem unter immunkompetenten Bedingungen, die Invasion und Destruktion von Gelenkknorpel durch die Fibroblasten-Zelllinie LS48 über einen längeren Zeitraum simuliert werden kann. Die am Institut für klinische Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig etablierte Zelllinie LS48 wurde in die ipsilateralen Kniegelenke von BALB/c-Mäusen injiziert. Die dadurch induzierte Gewebsdestruktion wurde über zehn Wochen in zweiwöchigem Abstand histopathologisch beurteilt und klassifiziert. Als vergleichende Fibroblasten-Zelllinie wurden nicht-invasive NIH/3T3-Zellen eingesetzt. An Hand der Score-Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion wurde eine mäßige bis schwer-wiegende Gewebsdestruktion durch die LS48-Zellen bereits ab der zweiten Untersuchungswoche lichtmikroskopisch nachgewiesen, ohne dass dabei pathologische Effekte in den kontralateralen Kniegelenken aufgetreten sind. Polarisationsmikroskopisch wurden für den Parameter Knorpeldestruktion vergleichbare Ergebnisse erzielt. Damit wurde gezeigt, dass das Modell BALB/c LS48 ein erfolgversprechendes Instrument darstellt, das zur Testung neuer therapeutischer Strategien gegen die Gelenkdestruktion verwendet werden kann. Inwieweit die Auseinandersetzung der LS48-Zellen mit dem spezifischen Immunsystem der BALB/c-Maus Auswirkungen auf den Verlauf der Gewebsdestruktion hat, sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden.
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Histologische Charakterisierung eines murinen Knorpeldestruktionsmodells in der BALB/c Maus

Naue, Janine 21 September 2015 (has links)
Die rheumatoide Arthritis ist eine chronisch-entzündliche Bindegewebserkrankung mit symmetrischem Befall der Gelenke. Die genaue Ätiologie ist bisher unbekannt. Aktivierte synoviale Fibroblasten sollen durch gesteigerte Adhäsion und Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Matrix-lysierenden Proteasen maßgeblich an der Gelenkdestruktion beteiligt sein. Ziel dieser Arbeit war es, ein neues in-vivo-Knorpeldestruktions-Modell zu etablieren, in welchem unter immunkompetenten Bedingungen, die Invasion und Destruktion von Gelenkknorpel durch die Fibroblasten-Zelllinie LS48 über einen längeren Zeitraum simuliert werden kann. Die am Institut für klinische Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig etablierte Zelllinie LS48 wurde in die ipsilateralen Kniegelenke von BALB/c-Mäusen injiziert. Die dadurch induzierte Gewebsdestruktion wurde über zehn Wochen in zweiwöchigem Abstand histopathologisch beurteilt und klassifiziert. Als vergleichende Fibroblasten-Zelllinie wurden nicht-invasive NIH/3T3-Zellen eingesetzt. An Hand der Score-Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion wurde eine mäßige bis schwer-wiegende Gewebsdestruktion durch die LS48-Zellen bereits ab der zweiten Untersuchungswoche lichtmikroskopisch nachgewiesen, ohne dass dabei pathologische Effekte in den kontralateralen Kniegelenken aufgetreten sind. Polarisationsmikroskopisch wurden für den Parameter Knorpeldestruktion vergleichbare Ergebnisse erzielt. Damit wurde gezeigt, dass das Modell BALB/c LS48 ein erfolgversprechendes Instrument darstellt, das zur Testung neuer therapeutischer Strategien gegen die Gelenkdestruktion verwendet werden kann. Inwieweit die Auseinandersetzung der LS48-Zellen mit dem spezifischen Immunsystem der BALB/c-Maus Auswirkungen auf den Verlauf der Gewebsdestruktion hat, sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden.:Bibliographische Zusammenfassung II Inhaltsverzeichnis III Abkürzungsverzeichnis IV 1 Einleitung 1 1.1 Rheumatische Erkrankungen 1 1.2 Die rheumatoide Arthritis 2 1.2.1 Immunologische Grundlagen der rheumatoiden Arthritis 2 1.2.1.1 Hypothese der Fibroblasten-Abhängigkeit 3 1.2.1.2 Hypothese der T-Zell-Abhängigkeit 4 1.3 Allgemeine Anatomie und Histologie des Kniegelenks 6 1.4 Die Histopathologie der rheumatoiden Arthritis 9 1.4.1 Verschiedene Synovialmembrantypen bei rheumatoider Arthritis 10 1.5 Tiermodelle zur Untersuchung der rheumatoiden Arthritis 11 1.5.1 Das Tiermodell der Fibroblasten-induzierten Gelenkdestruktion in der BALB/c-Maus 12 1.6 Histopathologische Score-Systeme der rheumatoiden Arthritis in Tiermodellen 13 1.7 Ziel 13 1.7.1 Fragestellungen 14 2 Material und Methoden 16 2.1 Zelllinien und Versuchstiere 16 2.1.1 Die Fibroblasten-Zelllinie NIH/3T3 16 2.1.2 Die Fibroblasten-Zelllinie LS48 16 2.1.3 Die BALB/c-Maus 17 2.2 Tierversuchsplan 18 2.3 Zellkultur 19 2.3.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 19 2.3.2 Reagenzien 20 2.3.3 Durchführung 21 2.4 Isolation der murinen Kniegelenke 22 2.5 Histologische Aufarbeitung 23 2.5.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 23 2.5.2 Reagenzien 24 2.5.3 Entkalkung, Entwässerung, Einbettung und Schneiden der Präparate 26 2.5.4 Azanfärbung nach Heidenhain (Kernechtrubin-Anillinblau-Orange G-Färbung) 27 2.6 Klassifikation mit dem Durchlichtmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (Balb/c-LS48) 29 2.7 Klassifikation mit dem Polarisationsmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (Balb/c-LS48) 29 2.8 Statistik 30 3 Ergebnisse 31 3.1 Score-Erhebung mit dem Lichtmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 31 3.1.1 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Zellinvasion 32 3.1.2 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Pannusformation 35 3.1.3 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Knorpeldestruktion 38 3.2 Datenanalyse der lichtmikroskopisch untersuchten Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 41 3.2.1 Zellinvasion 41 3.2.2 Pannusformation 45 3.2.3 Knorpeldestruktion 48 3.2.4 Gesamtscore 51 3.3 Score-Erhebung mit dem Polarisationsmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 56 3.3.1 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Knorpeldestruktion 56 3.4 Datenanalyse des polarisationsmikroskopisch untersuchten Parameters Knorpel-destruktion für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 59 3.5 Statistischer Vergleich der licht- und polarisationsmikroskopischen Analysemethoden für den Parameter Knorpeldestruktion 62 3.6 Statistischer Vergleich der medialen und lateralen histologischen Sagittalschnitte der Kniegelenke 63 4 Diskussion 64 4.1 Die Bedeutung der histopathologischen Score-Parameter für das Modell der Fibroblasten-induzierten Gelenkdestruktion in der BALB/c-Maus 65 4.1.1 Der Score-Parameter Zellinvasion 65 4.1.1.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Zellinvasion 67 4.1.1.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Zellinvasion für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 69 4.1.2 Der Score-Parameter Pannusformation 70 4.1.2.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Pannusformation 71 4.1.2.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Pannusformation für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 73 4.1.3 Der Score-Parameter Knorpeldestruktion 74 4.1.3.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Knorpeldestruktion 75 4.1.3.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Knorpeldestruktion für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 76 4.1.4 Interpretation des lichtmikroskopisch erhobenen Gesamtscores für das Knorpeldestruktionsmodell (BALB/c-LS48) im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 78 4.1.4.1 Verlaufsvergleich zu anderen Tiermodellen 81 4.2 Die histopathologischen Auswirkungen der Zelllinien LS48 und NIH/3T3 im ipsilateralen Kniegelenk der BALB/c-Maus im Vergleich 83 4.3 Vergleich der medialen und lateralen Sagittalebenen der histologischen Präparate der Kniegelenke 85 4.4 Beurteilung histopathologischer Veränderungen in den kontralateralen Kniegelenken im Verlauf von zehn Wochen 86 4.5 Vergleich der licht- und polarisationsmikroskopischen Untersuchungsergebnisse 87 4.6 Schlussfolgerungen und Ausblick 89 Zusammenfassung 94 Literaturverzeichnis 99 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 116 Eigenständigkeitserklärung VIII Danksagung IX

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