La production de cytokines et chimiokines par les polymorphonucléaires (PMN) est une fonction importante dans la réponse inflammatoire. La phagocytose et la migration, ainsi que d’autres fonctions des PMN changent en milieu hypoxique. II est bien connu que la régulation par l’hypoxie dépend principalement de l'activation du facteur de transcription HIF, cependant, l’effet de l’hypoxie sur la production des cytokines n’est pas encore établi. Notre hypothèse est que l’hypoxie change le profil de production des cytokines et chimiokines dans les neutrophiles humains en réponse aux agonistes en impliquant HIF. Dans ce travail, nous avons tout d’abord démontré que les PMN expriment constitutivement HIF-2? et HIF-3?. De plus, les agonistes G-CSF, GM-CSF, TNF? ou LPS augmentent l’expression de HIF-1? en hypoxie. D’autre part, nous avons démontré que l’hypoxie seule induit la sécrétion de TNF? et MIP-3a et modifie les niveaux des MIP-1?/1?, IL-8 et MIP-3? produites en réponse au GM-CSF, LPS et PGN. Ceci suggère que l'hypoxie oriente la production des cytokines dans les PMN de façon dépendante du stimulus et témoigne d’une mobilisation des voies de signalisation et des facteurs de transcription différente de celle connue en normoxie. Par la suite, nous avons étudié les mécanismes qui pourraient être à l’origine de ces modifications tels que la voie des MAPK p42/p44, STAT3, ERK, JNK et C/EBP-?. D’autre part, nous avons montré que la production inédite d’IL-8 par G-CSF en hypoxie dépend de STAT3 et p38 et que cette production met en jeu l'action autocrine des cytokines endogènes IL-18, IL-1ra et TNF?. De plus, l’utilisation d’une lignée cellulaire PLB-985 différenciée en PMN portant une mutation sur les sites consensus du NF-?B ou HIF, nous a permis de démontrer que non seulement l’hypoxie seule ou associé au G-CSF, GMCSF, TNF? ou au LPS régule l’activité de ce promoteur, mais le HIF régule aussi cette activité en normoxie. Finalement, les travaux présentés dans ce mémoire démontrent que l’hypoxie modifie l’expression et la production des cytokines par les neutrophiles humains de façon différente de la normoxie. Si le rôle crucial des neutrophiles dans l’inflammation physiologique et pathologique basé sur leur production des cytokines a été largement documenté en normoxie, il est primordial de réaliser des études pour approfondir ce rôle en considérant l’effet de l’hypoxie. [symboles non conformes]

Der Hirninfarkt ist einer der drei häufigsten Todesursachen in Deutschland. Er wird durch eine Unterversorgung des Gewebes mit Sauerstoff und Nährstoffen, häufig infolge von Gefäßverschlüssen, ausgelöst. Die bisher einzige Therapiemöglichkeit ist die Thrombolyse. Deshalb sind neue Therapieansätze nötig. Voraussetzung dafür sind geeignete Modelle. In dieser Arbeit wurden zellbasierte Hypoxiemodelle etabliert und charakterisiert. Es wurde der Einfluss von Sauerstoff- und/oder Glucoseentzug an humanen primären Makrophagen untersucht. Für Screeninguntersuchungen wurden neuronale und periphere (Makrophagen) Zelllinien von Ratte und Mensch verwendet. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Modelle genutzt, um die Wirkung von Adenin, eine rezeptorvermittelte Therapieoption, und des Phytopharmakons STW5 auf mögliche protektive Wirkungen zu untersuchen. Es wurden zellbiologische (MTT-Test, LDH-Test, DAPI-Färbung), immunologische (TNF α- ELISA, immunhistochemische Färbung), elektrophysiologische (Patch Clamp-Technik) und molekularbiologische (RT-PCR, Real-Time-PCR) Methoden angewendet. Es wurde erstmals der Adeninrezeptor an den untersuchten Zelllinien nachgewiesen und der pharmakologische Hinweis für eine bisher unbekannte humane Variante des Rezeptors erbracht. An neuronalen Zellen kam es zu einer Rezeptorinteraktion zwischen Adenin- und Adenosin-A1-Rezeptor. Antagonisten am Adeninrezeptor scheinen zur Behandlung hypoxiebedingter Zellschäden geeignet zu sein. STW5 hemmte unter hypoxischen Bedingungen die TNF α-Freisetzung humaner primärer Makrophagen. Der antiinflammatorischen Wirkung liegt die Blockierung erhöhter Kaliumströme zugrunde. An den untersuchten Zelllinien wirkte STW5 der hypoxieinduzierten Zellschädigung entgegen.

Zielsetzung der vorgestellten Arbeit war die Etablierung und Validierung einer Zellkultur isolierter equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen für morphologische und funk-tionelle Untersuchungen an den einzelnen Zelltypen und ihrer Interaktionen. Ein solches In-vitro-System könnte insbesondere für Studien zur der Pathogenese der Endometrose zum Einsatz kommen. Zu diesem Zweck wurden Endometriumbioptate und Uteri von gynäkologisch unauffälli-gen Stuten entnommen. Die Isolierung der Zellen erfolgte nach mechanischer Zerklei-nerung des Gewebes mittels enzymatischer Verdauung durch Kollagenase. Für die Se-paration und Aufreinigung der Epithel- und Stromazellen kam, nach unbefriedigenden Ergebnissen bezüglich Zellausbeute und –reinheit bei Verwendung der Verfahren allein, eine Kombination aus Filtration, diskontinuierlicher Dichtegradientenzentrifugation und Differenzialadhärenz zum Einsatz. So konnten Kreuzkontaminationen der beiden Zell-fraktionen von ≤ 2 % erreicht werden. Die Kultivierung der so gewonnenen Zellen er-folgte bei 37 °C, in Raumluft mit 5 % CO2 in wasserdampfgesättigter Atmosphäre in RPMI 1640 als Medium mit 10 % fötalem Kälberserum. Der Proliferationsvergleich auf unterschiedlichen Oberflächenbeschichtungen (Kunst-stoff, Kollagen, Matrigel®) zeigte einen Wachstumsvorteil der Epithelzellen auf dem ECM-Substrat Matrigel®. Im Gegensatz zu den stromalen Zellen, deren Wachstum auf dieser gegenüber den anderen Beschichtungen verlangsamt war. Die Stromazellen konnten über 1 Jahr bis zur Passage 19 in Kultur gehalten werden bevor deutliche De-generationserscheinungen auftraten. Bei den epithelialen Zellen war die Subkultivierung nach Trypsinierung nicht erfolgreich. Eine morphologische und funktionelle Charakterisierung der kultivierten Zellen fand mit-tels Lichtmikroskopie mit verschiedenen Färbungen, Immunhistologie sowie Transmissions- und Rasterelektronenmikroskopie statt. Für diesen Zweck erfolgte die Kultivierung der Zellen auf chamber slides und in Matrigel®-beschichteten Membraneinsätzen als Mono- und Kokultur. Die Epithelzellen stellten sich auf unbeschichteten Kunststoffoberflächen als flache, po-lygonale Zellen dar. Bei Bereitstellung von Matrigel® bildeten sie Organoide aus polari-sierten Zellverbänden mit Mikrovilli und Protrusionen an der Oberfläche aus. Als Zellver-bindungen traten Interdigitationen, tight junctions und Desmosomen auf. Im Zytoplas-ma waren neben rauem endoplasmatischen Retikulum, Golgi-Apparat und Mitochond-rien auch Sekretvakuolen zu finden. Immunhistologisch reagierten die Epithelien auch in vitro Zytokeratin-positiv. Dieses Charakteristikum diente als Unterscheidungsmerkmal von den Stromazellen, da nach einer Woche Kulturzeit auch der Vimentinnachweis bei den epithelialen Zellen positiv ausfiel. Progesteron- und Östrogenrezeptoren waren mit-tels Immunhistologie bei beiden kultivierten Zelltypen nicht nachweisbar. Die spindeligen bis sternförmigen Stromazellen wiesen keine Oberflächenmodifikationen auf. Intrazytoplasmatisch waren Mitochondrien, raues endoplasmatische Retikulum und ein Golgi-Apparat nachweisbar. Die stromalen Zellen waren immunhistologisch durch einen Vimentinnachweis gekennzeichnet. Zusätzlich konnte nach wenigen Tagen in der Kultur -Aktin und teils auch Desmin nachgewiesen werden. Diese Differenzierung zu Myofibroblasten trat unter hypoxischen Kulturbedingungen (1 % O2) verstärkt auf. Die morphologische und immunhistologische Charakterisierung zeigte, dass die Diffe-renzierung sowohl der epithelialen als auch der stromalen Zellen unter den eingesetzten Kulturbedingungen der von Endometrose betroffenen Zellen oder den Zellen in inakti-ven Endometrien während des Winteranöstrus in situ ähnelt. Die etablierte Zellkultur equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen aus Biopsiema-terial bildet die Grundlage für morphologische und funktionelle Untersuchungen an den einzelnen Zelltypen und ihrer Interaktionen zur Erforschung der Pathogenese der En-dometrose. Aus praktischer und ethischer (tierschutzrechtlicher) Sicht bietet sie eine hervorragende Möglichkeit experimenteller Untersuchungen an endometrialen Zellen der Stute.

Ulm, Univ. Diss., 2006.

Universiẗat, Diss., 2004--Giessen.

Proefschrift Rijksuniversiteit Limburg, Maastricht. / Met bibliogr., lit. opg. - Met een samenvatting in het Nederlands.

Proefschrift Universiteit Maastricht. / 905681444. Met biliogr., lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

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Les glioblastomes (GB) sont des tumeurs cérébrales extrêmement agressives, très hypoxiques qui récidivent dans les champs d'irradiation malgré un traitement bien conduit qui associe radio et chimiothérapie. L'hypoxie tumorale et les facteurs de transcription inductibles par l'hypoxie (HIF-1alpha et HIF-2alpha) sont des facteurs importants de résistance aux thérapeutiques anti-cancéreuses, en particulier dans les glioblastomes. Récemment, un nouveau partenaire de HIF-2alpha a été identifié. Il s'agit de la protéine Int6 également connue sous le nom d'eIF3e, sous-unité " e " du facteur d'initiation de la traduction eIF3. De façon intéressante, des études ont montré que les niveaux d'expression d'eIF3e étaient associés à l'état d'avancement tumoral, dans les cancers du sein et du colon. Ces données de la littérature suggèrent que le facteur Int6/eIF3e pourrait être une cible particulièrement intéressante dans les cellules de glioblastome. Au cours de ma thèse et dans l'optique de vérifier cette hypothèse, j'ai démontré sur un plan fonctionnel que l'inhibition d'Int6/eIF3e dans différentes lignées de GB diminue la prolifération en provoquant un arrêt du cycle cellulaire en phase G1 et en augmentant la mort cellulaire, notamment par apoptose et par une augmentation des processus autophagiques. Sur un plan moléculaire j'ai mis en évidence que cette diminution de la survie des cellules de glioblastome en réponse à l'inhibition d'Int6/eIF3e est en partie causée par une réduction de l'expression des HIFs. De plus, l'étude de la biosynthèse protéique et en particulier de la traduction, via l'analyse des ARNm associés aux polysomes combinée à une analyse microarray, a permis de mettre en évidence une modulation de la traduction d'ARNm spécifiques permettant d'expliquer les phénotypes observés. Dans une perspective thérapeutique, j'ai pu démontrer que l'association de l'inhibition d'Int6/eIF3e avec les radiations ionisantes potentialise les effets de l'irradiation sur ces cellules de GB. Enfin sur un plan clinique j'ai mis en évidence une corrélation entre la perte d'expression d'Int6/eIF3e et une augmentation de la survie des patients atteints de GB. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis de valider Int6/eIF3e comme une nouvelle cible essentielle pour la survie des cellules de glioblastome en régulant la traduction d'ARNm spécifiques. / Glioblastomas (GB) are very aggressive and malignant brain tumors, with frequent relapses despite an appropriate treatment combining surgery, chemotherapy and radiotherapy. In GB, hypoxia is a characteristic feature and activation of the Hypoxia Inducible Factors (HIF-1a and HIF-2a) has been associated with resistance to anti-cancer therapeutics. Int6, also named eIF3e, is the "e" subunit of the translation initiation factor eIF3, and was identified as novel regulator of HIF-2a. Interestingly, studies led in colon and breast cancers showed that high expression of eIF3e was correlated with a bad prognosis. These data suggest that Int6/eIF3e could become an interesting target in cancer cells and particularly in glioblastoma. During my graduate work and to assess this hypothesis, I first demonstrated at a functional level that Int6/eIF3e inhibition leads to a decreased GB cell proliferation induced by a cell cycle arrest in G1 phase and an increased cell death, especially apoptotic and autophagic processes in various GB cell lines. At the molecular level, I showed that this decreased GB cell survival in response to Int6/eIF3e inhibition was partly due to a reduction in HIFs expression. Moreover, the study of protein synthesis mechanisms, and particularly translation, via polysome-bound mRNA and microarray analyses revealed a modulation in the translation of specific subsets of mRNA, which could potentially explain our phenotypes. From a therapeutic prospect, I demonstrated that combination of Int6/eIF3e inhibition with ionizing radiations potentiates radiation effects on GB cells. Finally, immunohistochemistry studies showed that low expression of Int6/eIF3e is correlated with a longer survival for patients with GB, suggesting a potential relevance for Int6/eIF3e as a prognostic marker. In conclusion, my doctoral work allowed us to identify Int6/eIf3e as a new target essential for glioblastoma cell survival through the regulation of translation of specific mRNA subsets.

The role of lipids and ROS in cardioprotective mechanism of chronic hypoxia Cardiovascular diseases, mainly ischemic heart disease is one of the most frequently cause of morbidity and mortality in developed countries. Therefore effective protection of the heart against ischemia and reperfusion injury is the crucial aim of experimental and clinical cardiology. One of the main streams of cardiovascular research is looking for possibilities of natural heart resistance augmentation. Adaptation to chronic hypoxia is one possibility how to protect the heart against ischemia-reperfusion injury. Chronic hypoxia increases resistance of the myocardium to acute deficiency of oxygen leading to vetricular arrythmias, postischemic contractile dysfunction and necrotic changes in the tissue. Recently, it has been shown that reactive oxygen species (ROS) play an important role in the cardioprotective mechanism of chronic hypoxia. It is known that oxidative stress has a harmful effect in acute ischemia-reperfusion however ROS generated during the adaptation to hypobaric intermittent chronic hypoxia play a role in the induction of cardioprotection. In this study, we demonstrated that adaptation of adult rats to chronic hypoxia increased the activity and protein abundance of manganese superoxide dismutase (MnSOD) in the...