Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2009

Proefschrift Maastricht. / Met lit. opg. en samenvatting in het Nederlands.

Adaptace na chronickou hypoxii zvyšuje toleranci srdce k ischemicko-reperfuznímu poškození. Tato adaptace je umožněna řadou fyziologických změn na buněčné úrovni. Jednou z nich je změna v buněčném energetickém metabolismu. Tento proces může být regulován proteinem FTO (z angl. fat mass and obesity associated), demetylázou epigeneticky regulující buněčnou syntézu proteinů. Srdeční metabolismus může být také modulován adipokiny leptinem a adiponektinem. Cílem tohoto projektu bylo proto studovat roli FTO a adipokinů v chronicky hypoxickém srdci. Dospělí samci potkanů kmene Sprague Dawley byli adaptováni na dva modely kontinuální normobarické hypoxie (CNH; 12 % O2 a 10 % O2; 3 týdny). CNH (10 % O2) redukovala u těchto zvířat rozsah infarktu myokardu o 20 %. CNH (12 % O2) nebyla kardioprotektivní. Hladina proteinu FTO byla měřena v tkáni levých (LV) a pravých (RV) komor, stejně jako v játrech a koncovém mozku hypoxických i normoxických zvířat. Za normoxie je hladina FTO v RV o 50 % vyšší než v LV. Ve vysoce metabolicky aktivních tkáních jater a koncového mozku jsou pak hladiny FTO vyšší dokonce 6krát a 11krát. CNH (12 % O2) vedla k signifikantnímu nárůstu hladiny proteinu FTO v srdci. Jednalo se o 21% nárůst v LV a 27% v RV. Hladiny v játrech a koncových mozcích nebyly CNH ovlivněny. Silnější CNH (10 % O2)...

Articular cartilage lesions that occur upon intensive sport, trauma or degenerative disease represent a severe therapeutic problem. At present, osteoarthritis is the most common joint disease worldwide, affecting around 10% of men and 18% of women over 60 years of age (302). The poor self-regeneration capacity of cartilage and the lack of efficient therapeutic treatment options to regenerate durable articular cartilage tissue, provide the rationale for the development of new treatment options based on cartilage tissue engineering approaches (281). The integrated use of cells, biomaterials and growth factors to guide tissue development has the potential to provide functional substitutes of lost or damaged tissues (2,3). For the regeneration of cartilage, the availability of mesenchymal stromal cells (MSCs) or their recruitment into the defect site is fundamental (281). Due to their high proliferation capacity, the possibility to differentiate into chondrocytes and their potential to attract other progenitor cells into the defect site, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BMSCs) are still regarded as an attractive cell source for cartilage tissue engineering (80). However, in order to successfully engineer cartilage tissue, a better understanding of basic principles of developmental processes and microenvironmental cues that guide chondrogenesis is required. / Verletzungen des Gelenkknorpels, die durch intensiven Sport, Trauma oder degenerative Krankheiten induziert wurden, stellen ein großes therapeutisches Problem dar. Heutzutage ist Arthrose die weltweit häufigste Gelenkerkrankung, die etwa 10% der männlichen und 18% der weiblichen Bevölkerung über 60 Jahre betrifft (302). Die geringe intrinsische Heilungskapazität von Knorpelgewebe und das Fehlen effizienter Behandlungsmethoden, um dauerhaften Gelenkknorpel zu erzeugen, bilden die Grundlage für die Entwicklung neuartiger Behandlungsmethoden auf Basis des Tissue Engineering (281). Hierbei verfügt speziell der integrierte Einsatz von Zellen, Biomaterialien und Wachstumsfaktoren über das Potential zerstörtes oder geschädigtes Gewebe zu ersetzen bzw. die Regeneration von neuem Gewebe zu fördern (2,3). Für die Regeneration von Knorpelgewebe ist vor allem die Verfügbarkeit von mesenchymalen Stammzellen (MSC) und deren Rekrutierung in die Defektzone von großer Bedeutung (281). Aufgrund ihrer hohen Proliferationsrate, der Fähigkeit in Chondrozyten zu differenzieren und des Potentials andere Vorläuferzellen in die Defektzone zu rekrutieren bilden MSCs auch heute noch einen attraktiven Ansatz im Knorpel-Tissue Engineering (80). Eine wichtige Voraussetzung für die erfolgreiche Entwicklung von Knorpelgewebe ist jedoch ein besseres Verständnis der grundlegenden Entwicklungsprozesse und der Einflussfaktoren der Mikroumgebung, die die Chondrogenese regulieren.

Le diabète est associé à une augmentation de risque de maladie cardiovasculaire et une dérégulation du métabolisme. Il a été suggéré que la variabilité glycémique (VG) pouvait avoir un rôle dans le développement des complications du diabète. Afin d’étudier et de caractériser les dysfonctions induites par la VG, nous avons mis au point un modèle in vitro mimant la VG sur la lignée de cardiomyocytes HL-1. Nous avons ainsi développé un traitement de 12 heures, mimant hypoglycémie, normoglycémie, hyperglycémie et VG. L’étude de la signalisation cellulaire ne nous a pas permis de montrer un rôle délétère de la VG. Nous avons toutefois mis en évidence que la VG participait à des dysfonctions mitochondriales. En effet en situation de fluctuations en glucose, les mitochondries des cellules HL-1 présentent une augmentation de leur potentiel de membrane, ainsi qu’une augmentation de la production d’anions superoxydes. Bien que nous n’ayons pas réussi à montrer de perturbation de la chaîne respiratoire après 12 heures d’exposition, nous avons pu montrer que 72 heures d’exposition provoquaient une baisse de la respiration mitochondriale. Nous avons enfin étudié l’impact des fluctuations en glucose sur la susceptibilité au développement de lésions d’hypoxie, et avons montré que les lésions sont majorées après 36 heures d’hypoxie en cas d’exposition à des fluctuations en glucose. Nos résultats montrent un rôle délétère de la VG, néanmoins des expériences complémentaires sont nécessaires afin de caractériser de manière plus précise les mécanismes impliqués. / Diabetes mellitus is associated with higher risk of cardiovascular disease and metabolism dysregulation. Glycemic variability (GV) has been suggested as a risk factor in diabetic complication. In order to characterize dysfunctions induced by GV, we developed an in vitro model that transpose GV on the cardiac cell line HL-1. We exposed our cells to a treatment of 12 hours miming hypoglycemia, normoglycemia, hyperglycemia and GV. The exploration of signaling pathways didn’t allow us to show a deleterious effect of glucose fluctuation. However we were able to point mitochondrial alteration under glucose fluctuation. HL-1 cells mitochondria exhibit a higher membrane potential and an increase of superoxide anion production. Although we didn’t show any alteration in mitochondrial respiration after 12 hours of exposition, we showed that after 72 hours of glucose fluctuation, HL-1 cells showed a decrease in mitochondrial respiration. We finally studied the impact of glucose fluctuation on the susceptibility to develop hypoxic injuries. We showed that after 36 hours of hypoxia, injuries were higher for cells exposed to glucose fluctuation. Our results indicate a deleterious effect of GV, but additional experiments are needed to better characterize the mechanisms.

Cancer, despite significant advances in diagnosis and treatment, is the second most common cause of death in economically advanced countries. The main reason for the failure of anticancer therapy is the development of chemoresistance, which can be either internal or acquired, and is primarily mediated by the activation of various key regulators (eg MDR, PI3K/Akt, etc.). Genetic and epigenetic mechanisms are involved in activating these pathwa- ys. Significant epigenetic mechanisms that can participate in chemoresistance include regula- tion of gene expression by microRNA (miRNA) and long noncoding RNA (lncRNA). Dere- gulated expression of these non-coding RNAs has been observed in many diseases and their involvement in the initiation and progression of malignant tumors has been demonstrated. In this study, we investigated the expression of long non-coding RNA MIAT in hypoxia (1% O2) in chemosensitive and chemoresistant neuroblastoma cell lines (NBL), as hypoxia is a significant negative prognostic factor of many tumors and is involved in chemoresistance. Relative expression of MIAT was influenced by the number of cultured cells, where expression was increased by culturing more cells. MIAT expression was also significantly increased after 6 hours of NBL culture UKF-NB-4 in hypoxic conditions, and...

L’hypoxie tumorale est l’une des principales causes de l’agressivité des glioblastomes (GB). Plusieurs études attestent de l’implication de l’isoforme HIF-1α (hypoxia inducible factor-1α) dans la progression de ces tumeurs et dans leur résistance à la radiothérapie (RT). Plus récemment, il a été établi que l’isoforme HIF-2α régule la capacité tumorigénique des cellules souches de GB (CSG). Cependant, le rôle de ce facteur dans la croissance des cellules de GB différenciées et leur réponse à la RT est moins documenté. Dans ce contexte, l’objectif de ce travail a été de renforcer ces connaissances à l’échelle préclinique en utilisant deux approches d’ARN interférence (ARNi) pour moduler l’expression de HIF-2 : cibler directement HIF-2α ou cibler HAF (hypoxia associated factor), un facteur impliqué dans le switch de HIF-1α vers HIF-2α. Les résultats obtenus sur un modèle orthotopique de cellules humaines de GB (U251-MG) différenciées montrent que l’invalidation de HAF conduit à un fort ralentissement de la croissance de ces tumeurs mais indépendamment de HIF-1α ou HIF-2α. L’effet de l’invalidation de HIF-2α serait, quant à lui, dépendant de l’environnement tumoral. En effet, la diminution d’expression de HIF-2α dans les cellules U251 ne modifie pas la croissance tumorale dans un modèle de greffe sous-cutanée, alors que celle-ci favorise la croissance tumorale lorsque les cellules de GB sont implantées en intracérébral. Par comparaison aux tumeurs contrôles, ces tumeurs sont plus invasives et mieux perfusées. In vitro, l’inhibition de l’expression de HIF-2α n’a aucun effet sur la survie des cellules U251 alors qu’elle diminue la mort apoptotique de ces cellules exposées aux rayons X.L’ensemble des données présentées dans cette étude suggère que HAF et HIF-2α pourraient réguler la capacité tumorigénique des cellules de GB différenciées, tout comme observé pour les CSG. En outre, ces résultats soulignent la nécessité de prendre en compte le microenvironnement cellulaire afin de mieux comprendre le comportement de la tumeur dans son environnement hypoxique. / Hypoxia is one of the main causes of glioblastoma (GB) aggressiveness. Various studies attest on the involvement of the HIF-1α isoform (hypoxia inducible factor-1α) in the progression of these tumors and in their resistance to radiation therapy (RT). More recently, it was established that the HIF-2α isoform regulates the tumorigenic capacity of GB stem cells (GSC). However, the role of this factor in the growth of differentiated GB cells and their response to RT is less documented. In this context, the goal of this work was to strengthen this knowledge at the preclinical level by using two RNA interference (RNAi) strategies to modulate the expression of HIF-2: one directly targets HIF-2α, the other one targets HAF (hypoxia associated factor), a factor involved in the switch of HIF-1α to HIF-2α. Our results obtained on an orthotopic model of differentiated human GB (U251-MG) cells showed that the invalidation of HAF leads to a strong slowdown in tumor growth but independently of HIF-1α or HIF-2α. On the other hand, the effect of HIF-2α silencing seems dependent on the tumor environment. Indeed, the extinction ofHIF-2α expression in U251 cells does not modify tumor growth in a subcutaneous model, whereas it promotes tumor growth when GB cells are intracerebrally grafted. Compared to control tumors, these tumors are more invasive and highly perfused. In vitro, the inhibition of HIF-2α expression has no effect on GB cell survival whereas decreasing the X-rays induced apoptotic death.Collectively, these data suggest that HAF and HIF-2α could regulate the tumorigenic capacity of differentiated GB cells, like it does in CSGs. In addition, these results highlight the need to take into account the cellular microenvironment to better understand the behavior of the tumor in its hypoxic environment.

Die invasive Aspergillose ist eine gefürchtete Erkrankung besonderes bei immunsupprimierten Patienten, die eine Stammzelltransplanation erhalten sollen. Diese Patienten leiden in der Regel an einer hämatologischen Grunderkrankung wie einer Leukämie oder einem Lymphom. Das Prinzip der Stammzelltransplanatation ist es, das kranke Knochenmark mittels Chemotherapie und Bestrahlung zu zerstören und es dann mit gesunden Stammzellen zu ersetzen. Während dieser Konditionierung ist der Patient also ohne eigene Abwehrzellen. In dieser Phase gestaltet sich die rechtzeitige Diagnose häufig als schwierig, weil die konventionellen Diagnosemethoden von der Anwesenheit von neutrophilen Granulozyten abhängen. Häufig ist die Infektion bei der Entwicklung von unspezifischen Symptomen wie Fieber oder Dyspnoe schon weit fortgeschritten. Hat sich der Pilz in der Lunge ausgebreitet, so kommt es zur Ausbildung einer Hypoxie und im Verlauf auch zu einer Hypoxämie aufgrund einer Diffusionsstörung in den entzündeten Lungenabschnitten. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von Hypoxie auf die Interaktion zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen besser zu verstehen. Dendritische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunabwehr von Pilzinfektion und bilden das Verbindungsstück zwischen angeborenen und erworbenen Immunsystem. T-Zellen übernehmen ebenfalls wichtige Aufgaben bei der Abwehr von Pilzinfektionen, indem sie Interferon gamma produzieren. Zudem sollte die Funktion verschiedener Botenstoffe in Signalkaskaden näher untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion von dendritischen Zellen mit Aspergillus fumigatus unter Hypoxie, die dendritischen Zellen anschließend unter Normoxie dazu befähigt, eine verstärkte adaptive Immunantwort hervorzurufen. Hypoxie könnte somit als zusätzlicher Faktor verwendet werden, um dendritische Zellen als effektive Adjuvantien in einer Impfung gegen Aspergillus fumigatus zu verwenden. Ursächlich für die verstärkte Fähigkeit naive T-Zellen zu aktivieren, scheint zum einen die Apoptose und zum anderen eine verstärkte Produktion von Interleukin 12p70 zu sein. / The invasive pulmonary aspergillosis is a dreaded disease particularly in immunocompromised patients. These patients often receive a stem cell transplantation because they suffer from leukemia or lymphoma. If patients receive a stem cell transplantation, the sick bone marrow is destroyed by chemotherapy and radiation and replaced with healthy stem cells. During this conditioning, the patients have no cells against pathogen organism. When the patient shows symptoms like fever or dyspnea, in most cases the infection has already progressed and is at an advanced stage. In case of the spreading of the mold, a hypoxia occurs as reason of the diffusion impairment in the infected sections of the lungs. Aim of the present study was to understand the influence of hypoxia on the interaction between dendritic cells and t cells in a better way. Dendritic cells play a crucial role in the immune defense against fungal infections and form the link between the innate and adaptive immune system. T cells also have a main part in the defense against such infections. In addition, the function of different messengers in signal cascades should be further explored. We could show that an infection of dendritic cells by Aspergillus fumigatus under hypoxic conditions leads to an enhanced adaptive immune response. Thus, hypoxia could be an additive factor to use dendritic cells as an effective adjuvant in a vaccination against Aspergillus fumigatus. Apoptosis and an increased production of interleukin 12p70 appears to be the cause of the increased ability to activate naïve t cells.

Les lésions cérébrales du nouveau-né sont majoritairement causées par un manque d'oxygène et/ou une infection périnatale. Le profil des lésions cérébrales retrouvées chez le nouveau-né prématuré diffère de celui retrouvé à terme, malgré les mêmes facteurs de risque qui sont décrits. Une corrélation positive de l'expression de cytokines et la présence de dommages cérébraux est établie. Pourtant, bien qu'il soit connu que la réponse anti-inflammatoire vienne contrebalancer les effets pro-inflammatoires pouvant être délétères, très peu de données sont disponibles sur l'expression intracérébrale de cytokines anti-inflammatoires dans le contexte de lésions cérébrales du nouveau-né. De plus l'apport de l'immunité systémique est connu dans les dommages cérébraux chez l'adulte, mais peu connu chez le nouveau-né. Ce projet a pour but de comparer la réponse neuroinflammatoire dans les lésions cérébrales d'un cerveau prématuré versus à terme. Méthodes : Dans un modèle animal de ratons ayant une maturation cérébrale correspondant à un humain prématuré (jour post-natal (P)1) versus un humain à terme (P12), l'expression intracérébrale de cytokines anti-inflammatoires (IL-6, TGF[bêta]1, IL-10 et IL-1ra) et pro-inflammatoires (IL-1[bêta] et du TNF[alpha]) est déterminée par ELISA et IHC suite à une exposition au LPS et/ou à l'HI postnatale. L'expression des chimiokines CINC-1 et MCP-1 respectivement impliquée dans le recrutement des neutrophiles et des macrophages sera étudiée, en plus des cellules infiltrantes elles-mêmes. Résultats : Le cerveau de ratons à P1 ne démontre aucune augmentation de l'expression de ces cytokines anti-inflammatoires, contrairement aux cerveaux à P12 des ratons exposés à l'HI et au LPS+HI qui présente une augmentation de cytokines dans l'hémisphère ipsilatérale à l'ischémie. Cette augmentation est détectée autant dans la substance grise que blanche. L'augmentation des cytokines pro-inflammatoires est retrouvée seulement par IHC à P1 dans les conditions HI et LPS+HI, mais est retrouvé aussi à P12. Le recrutement de neutrophiles et macrophages est détecté à P12 suite à l'exposition à l'HI avec ou sans LPS. Conclusion : Notre travail démontre que la réponse neuroinflammatoire chez le prématuré est immature, comparativement à celle chez le nouveau-né à terme exposé à de mêmes agressions.

L’immunothérapie anticancéreuse est basée sur la capacité du système immunitaire à reconnaître les cellules tumorales comme étrangères et à les éliminer. Les stratégies immunothérapeutiques abordées dans ce travail, incluent l’activation du système immunitaire par l’expression de facteurs immunomodulateurs (l’interleukine-2) via l’utilisation d’un vecteur dérivé du parvovirus MVM, ou par présentation des antigènes tumoraux par la machinerie des cellules dendritiques (DC), via la génération d’hybrides entre DC et cellules tumorales (TC). L’intérêt majeur du parvovirus autonome MVM en tant que vecteur pour la thérapie génique du cancer vient de son expression préférentielle dans les cellules transformées (oncotropisme) et de son aptitude à lyser celles-ci (oncolyse). Les vecteurs générés au laboratoire conservent l’unité de transcription NS et expriment l’IL2 humaine sous contrôle du promoteur P38, à la place des protéines de capside. Malgré les améliorations apportées à la production de vecteurs recombinants, la faible concentration des stocks reste un problème. Il a été montré que, de nombreux virus sont mieux produits en conditions de faible tension en oxygène (hypoxie). Nous avons tenté d’améliorer les titres des vecteurs en les produisant sous faible tension d’oxygène mais sans y parvenir (annexe 1). Dans un modèle in vivo utilisant la lignée de mélanome K-1735 dans des souris immunocompétentes, des cellules tumorales infectées in vitro avant leur implantation en sous-cutané ont montré un effet anti-tumoral du vecteur MVM/IL2 (annexe 2). Afin de mettre en évidence l’apport de l’oncolyse parvovirale dans l’activité anti-tumorale, nous avons mis au point des expériences, dans le même modèle de tumeur, visant à comparer l’efficacité du vecteur MVM/IL2 à celle d’autres vecteurs, Ad/IL2 et Rétrovirus/IL2, ne possédant pas d’activité oncolytique. Dans le but de mettre en évidence une éventuelle réponse immune in vivo, nous avons utilisé le modèle de tumeur TC-1 mais ce modèle s’est montré moins sensible à l’effet du vecteur MVM/IL2 et nous n’avons pas pu démontrer d’activation de cellules cytotoxiques spécifiques de la tumeur. Il a été proposé d’utiliser des hybrides entre DC/TC pour la vaccination anti-tumorale pour optimaliser la présentation des antigènes tumoraux. Une lignée cellulaire exprimant la protéine fusogène du virus de la leucémie du Gibbon (GaLV-FMG, Gibbon ape leukemia virus) a été dérivée de la lignée cellulaire CHO (cellules ovariennes de hamster chinois) au laboratoire. Cette lignée CHO-FMG, utilisée comme partenaire intermédiaire, a permis la fusion entre cellules tumorales et dendritiques (annexe 3). Nous avons montré que l’expression transitoire après infection par un vecteur AAV-FMG ou après transfection transitoire ne génère pas un pourcentage significatif d’hybrides. En effet, le niveau d’expression ainsi que le pourcentage de cellules transduites exprimant FMG s’est révélé trop faible. Ceci a mis en valeur l’efficacité de la lignée stable CHO-FMG comme intermédiaire de la fusion. De plus, nous avons intégré dans la lignée fusogène, le gène de l’interleukine-2, qui devrait permettre d’augmenter l’efficacité de l’induction de la réponse immune. L’activation des cellules effectrices de l’immunité anti-tumorale via la présentation antigénique et/ou par des cytokines est au centre de ce travail. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents devrait permettre d’améliorer ces systèmes de vaccination non-conventionnels.