The primary function of erythrocytes is transport of oxygen from lungs to various tissues of the body. Red blood cell mass, due to this important role, must be controlled at precise levels. The number of erythrocytes is primarilly increased by the glycoprotein hormon erythropoietin, which expression is controlled by HIF (hypoxia inducible factor). Transcriptional factor HIF consists of the two subunits, HIFα and HIFβ. Under normoxic conditions, alfa subunit of HIF is hydroxylated by PHD protein. This hydroxylation provides a recognition motif for the VHL protein, a part of an E3 ubiquitin ligase complex that targets hydroxylated HIF for proteasomal degradation. Under hypoxic conditions, the degradation is inhibited. The alfa subunit is translocated to the nucleus, where binds the beta subunit and regulates gene expression. HIF pathway regulates a broad spectrum of cellular functions - energy metabolism, angiogenesis, apoptosis and many others. This diploma thesis is focused on HIF2α and its role in erythropoiesis. In this present study, we used CRISPR/Cas9 technology and created HEL (human erythroleukemia) cell line with knock-out of the gene for HIF2α (EPAS1). To reveal the role of HIF2α, we used specific HIF2α inhibitor in order to block its function in HEL cell line. We also tested this...

L’obtention d’un nombre élevé de cellules souches hématopoïétiques (CSH) représente un enjeu majeur pour le développement de protocoles de thérapies cellulaires d’hémopathies ou de tumeurs solides. L’expansion ex vivo de ces cellules met en jeu différents acteurs (cytokiniques, environnementaux) et notamment les basses concentrations d’oxygène (O2), qui reflètent des conditions physiologiques retrouvées au sein de structures spécifiques de la moelle osseuse où résident les CSH et auxquelles notre équipe s’intéresse depuis plusieurs années. Les effets bénéfiques de ces basses concentrations d’O2 sur le maintien des CSH sont actuellement bien établis lors de courtes cultures de cellules de moelle osseuse, de sang placentaire ou mobilisées dans le sang. Nous avons cherché à confirmer et à étendre ces résultats à des cellules peu étudiées, les cellules souches de sang périphérique en situation d’homéostasie (CSSP-H). Ces cellules représentent en effet une source possible de CSH à usage thérapeutique, du fait de leur disponibilité et de leur facilité d’accès. Nos travaux ont permis d’établir et d’optimiser un protocole, rapide et simple, de purification de cellules CD34+ à partir de filtres de leucoréduction (LRF). La quantité et la pureté de ces cellules adaptées à la poursuite de nos travaux, ainsi que leur validation fonctionnelle, nous ont permis de les utiliser comme modèle pour l’étude des effets de cultures de 7 jours très faiblement oxygénées (0,1% d’O2). La détermination de combinaisons cytokiniques assurant le maintien et l’expansion des cellules primitives a révélé un rôle bénéfique de l’IL-3 et du SCF couplé à la TPO. Ces conditions de culture ont permis de révéler, comparativement à des cultures réalisées à 20% d’O2, le rôle majeur des faibles concentrations d’O2 dans le maintien de cellules quiescentes, indifférenciées, ne se divisant pas ou très peu et capables de reconstituer une hématopoïèse, suite à leur injection dans des souris NOG. Les mécanismes moléculaires et métaboliques intervenant dans ces processus restent, cependant, encore à établir. / Obtaining a high number of hematopoietic stem cells (HSCs) is a major challenge for developing cell therapies for blood diseases. Ex vivo expansion of HSCs involves various factors (cytokines, environment), including low oxygen (O2) concentrations, that reflect the physiological conditions found in specific structures of the bone marrow where HSCs reside. Our team is interested with the study of these low O2 levels for several years and their beneficial effects are currently well established during short-term cultures of cells from bone marrow, cord blood or mobilized in the blood. We sought to confirm and extend these results to poorly studied cells: stem cells from steady state peripheral blood (SSPB). Indeed, these cells represent a possible HSCs source devoted to the therapeutic use, because of their availability and their easy access. Our work has led to the establishment and the optimisation of a procedure, rapid and easy to set up, for CD34+ cells purification from leukoreduction filters (LRFs). The cell quantities and purities, adapted to our further work, together with their functional validation, led us to use these cells as a model for 7-days in vitro cultures performed at very low O2 concentration (0.1%). Cytokine combination assays, allowing the maintenance and the expansion of primitive cells, have revealed a beneficial influence of IL-3 or SCF + TPO additions. These cultures have revealed, comparatively to those performed at 20% O2, a major role of the very low O2 concentrations in the maintenance of quiescent and undifferentiated cells, showing an un- or low-cycling status and able to reconstitute hematopoiesis, consecutively to their injection into NOG mice. However, the molecular and metabolic mechanisms involved in these processes remain unknown.

Notre étude a porté, d'une part sur l'effet du bicalutamide, un inhibiteur du récepteur aux androgènes, sur la réponse de trois lignées de cancer de prostate en association avec les rayonnements ionisants, d'autre part sur la recherche d'une corrélation entre l'expression des microARN miR-210 et miR-373 sur la tolérance à l'hypoxie et la réponse au rayonnement.Nous montrons que le bicalutamide induit un effet cytostatique et cytotoxique dans la lignée LNCaP, qui exprime le récepteur aux androgènes. Les lignées DU145 et PC3, qui n’expriment pas ou peu le récepteur, sont sensiblement plus résistantes mais sont cependant affectées par les concentrations élevées de bicalutamide. Cette sensibilité résiduelle suggère l'existence d'un mécanisme secondaire, indépendant de la voie de signalisation du récepteur aux androgènes. L'inhibition de la prolifération produite par le bicalutamide s'accompagne d'un blocage du cycle cellulaire en phase G1 avec une augmentation de l’expression de la protéine p27 et une diminution de l’expression de la protéine HER2. L'association concomitante au bicalutamide se traduit par un effet radioprotecteur dans la lignée LNCaP. Cette observation nous conduit à déconseiller l’association concomitante du bicalutamide avec la radiothérapie, notamment en cas d’irradiation hypofractionnée.Facteur bien connu de radiorésistance dans les tumeurs solides, l'hypoxie est associée à un mauvais pronostic dans les cancers de la prostate. Nos données montrent qu'en sus de l'induction de marqueurs classiques comme HIF-1α, CA9 et VEGF, l'hypoxie promeut l’expression du microARN miR-210, (mais non de miR-373) indépendamment de l’expression du récepteur aux androgènes. Les données suggèrent que miR-210, dont l'expression apparaît corrélée à la résistance à l'hypoxie, pourrait constituer un bon biomarqueur pronostique dans le cancer de la prostate. En revanche, l’inhibition de l’expression de miR-210 n'a aucun effet sur la radiosensibilité des cellules en condition d’hypoxie. / The first aim of our study was to evaluate the effect of the association between bicalutamide, an androgen receptor inhibitor, and ionizing radiation in three prostate cancer cell lines. The second aim was to examine a possible a correlation between the expression of miR-210 or miR-373, the tolerance to hypoxia tolerance and the responses to radiation.We found that bicalutamide produced cytostatic and cytotoxic effects in the androgen receptor- positive LNCaP cell line. The androgen receptor-negative DU145 and PC3 cell lines were more resistant to bicalutamide. However, these cell lines were affected by high bicalutamide concentration with the same endpoints as for LNCaP cells. The inhibition of proliferation by bicalutamide was associated with G1 cell cycle phase arrest, increased expression of p27KIP1 protein, and decreased expression of HER2 protein. Last but not least, bicalutamide elicited a marked radioprotective effect in LNCaP cells when associated with concomitant irradiation. This result suggests that bicalutamide and radiotherapy should not be delivered in close temporal proximity, especially in case of hypofractionated radiotherapy protocols.Hypoxia is a well known radioresistance factor in tumors and is associated with a bad prognosis in prostate cancer. In this study, we found that hypoxia promotes the expression of HIF-1α, CA9, VEGF and miR-210 but not miR-373 in prostate cancer cell lines irrespective of their androgen receptor status.Our findings suggest that miR-210 expression is correlated with resistance to hypoxia and could be used as a prognostic marker in prostate cancer. Conversely, miR-210 inhibition did not impact the radiation susceptibility of PC3 prostate cancer cell line under hypoxia.

Le microenvironnement tumoral, et notamment le stress hypoxique, joue un rôle immunosuppressif permettant l’échappement des cellules tumorales à la surveillance du système immunitaire. Des études récentes ont montré que l’échange de microvésicules (MVs) entre les cellules tumorales et les cellules du système immunitaire peut être responsable de l’établissement d’un microenvironnement immunosuppressif. Dans ce contexte, nous avons étudié l’effet des MVs issues des cellules tumorales hypoxiques sur la cytotoxicité des cellules «Natural Killer» (NKs). Nos résultats démontrent clairement que les cellules NKs sont capables d’internaliser les MVs issues des cellules tumorales normoxiques et hypoxiques. Cependant, seules les MVs hypoxiques sont capables de diminuer significativement la cytotoxicité des cellules NKs. Ainsi, nous avons déterminé que les MVs dérivées des cellules tumorales hypoxiques séquestrent deux immunomodulateurs, le TGF- et le miR-23a. Nous avons montré que le transfert de TGF- et miR-23a aux cellules NKs était responsable de la diminution respective de l’expression du récepteur activateur NKG2D à leur surface et de la protéine membranaire associée aux lysosomes (LAMP-1/CD107a) impliquée dans la dégranulation des granules cytotoxiques. Dans la deuxième partie de cette étude nous avons montré que les cellules tumorales soumises à un stress hypoxique étaient capables de déjouer un système immunitaire fonctionnel et d’échapper ainsi à la surveillance immunitaire des cellules NKs. En effet, nos résultats ont clairement démontré que la résistance des cellules tumorales hypoxiques à la lyse par les cellules NKs n’était pas liée à un défaut de reconnaissance, mais plutôt à l’activation d’un mécanisme de résistance intrinsèque dans les cellules tumorales. Ce mécanisme de résistance implique l’activation de l’autophagie qui opère dans les cellules tumorales pour dégrader le granzyme B, une protéase à sérine secrétée par les cellules NKs dont l’internalisation par les cellules tumorales cibles est nécessaire pour induire leur mort. Les expériences d’imagerie cellulaire combinées à des approches biochimiques ont confirmé que le niveau de granzyme B dans les cellules tumorales hypoxiques était significativement mois élevé par rapport à celui des cellules tumorales normoxiques. Ces résultats suggèrent fortement que le granzyme B est destiné à être dégradé par autophagie dans les cellules tumorales hypoxiques. En effet, l’inhibition génétique et pharmacologique de l’autophagie dans les cellules tumorales hypoxiques était suffisante pour contrecarrer la dégradation de granzyme B et ainsi restaurer la sensibilité des cellules tumorales hypoxiques à la lyse par les cellules NKs. Nos résultats ont clairement établi que l’inhibition de l’autophagie pouvait améliorer la réponse immunitaire antitumorale dépendante des cellules NK. Nous avons validé ce concept in vivo chez la souris en utilisant deux modèles syngéniques de cancer du sein et de mélanome. L’ensemble de nos travaux indiquent clairement que le stress hypoxique, qui est une caractéristique majeure du microenvironnement tumoral, peut favoriser l’établissement d’un microenvironnement immunosuppressif par plusieurs mécanismes qui ne s’excluent pas mutuellement. En effet, le stress hypoxique modifie les caractéristiques des cellules tumorales et active des mécanismes de résistance à la surveillance immunitaire. De plus, les cellules tumorales modifiées peuvent éduquer et exporter leur phénotype hypoxique aux cellules immunitaires présentes dans le microenvironnement afin d’affaiblir leur pouvoir cytotoxique. Nos résultats ouvrent ainsi la voie à la mise en place de nouvelles applications cliniques en immunothérapie anticancéreuse basées sur la réactivation des lymphocytes cytotoxiques et l’inhibition simultanée de l’autophagie. / The tumor microenvironment, including hypoxic stress plays an immunosuppressive role in tumor cell escape from immune surveillance. Recent studies have shown that the exchange of microvesicles (MVs) between tumor cells and cells of the immune system could be responsible for the establishment of an immunosuppressive microenvironment. In this context, we investigated the effect of MVs derived from hypoxic tumor cells on the cytotoxicity of Natural Killer (NK) cells. Our results clearly demonstrated that NK cells are able to internalize MVs derived from both normoxic and hypoxic tumor cells. However, only hypoxic MVs are able to significantly reduce the cytotoxicity of NK cells. Thus, we revealed that MVs derived from hypoxic tumor cells sequester two immunomodulators, TGF- and miR-23a. We have shown that the transfer of TGF- and miR-23a to NK cells was responsible for the respective reduction of the expression of NKG2D activating receptor on their surface and lysosomal-associated membrane protein (LAMP-1 / CD107a) involved in degranulation of cytotoxic granules.In the second part of this thesis we have shown that tumor cells subjected to hypoxic stress were able to outmaneuver a functional immune system and thus escape NK-mediated immune surveillance. Indeed, our results clearly demonstrated that the resistance of hypoxic tumor cells to NK-mediated lysis was not related to the impairment of recognition by NK cells, but rather to the activation of an intrinsic resistance mechanism in tumor cells. We showed that the resistance mechanism involves the activation of the autophagy which operates in the tumor cells to degrade the granzyme B, a serine protease secreted by NK cells and internalized by target tumor cells to induce cell death. Cell imaging experiments combined to biochemical approaches have confirmed that the level of granzyme B in hypoxic tumor cells was significantly higher compared to normoxic tumor cells. The analysis of the subcellular distribution of granzyme B reveals that it is predominantly present in the endosomes and autophagosomes of hypoxic tumor cells. These results strongly suggest that granzyme B is subjected to be degraded by autophagy in hypoxic tumor cells. Genetic and pharmacological inhibition of autophagy in hypoxic tumor cells was sufficient to block the degradation of granzyme B and thus restore the sensitivity of hypoxic tumor cells to NK-mediated lysis. Our results clearly demonstrated that inhibition of autophagy could improve NK-mediated antitumor immune response. We validated this concept in vivo using two syngeneic mice model of breast cancer and melanoma.Taken together, our work clearly shows that hypoxic stress, which is a major feature of the tumor microenvironment, can promote the establishment of an immunosuppressive microenvironment by several mechanisms which are not mutually exclusive. Thus, hypoxic stress changes the characteristics of tumor cells and activates the mechanisms of resistance to immune surveillance. In addition, tumor cells can educate and export their hypoxic phenotype to the immune cells in the microenvironment in order to impair their cytotoxicity. Our findings pave the way for the development of new clinical applications in cancer immunotherapy based on the reactivation of cytotoxic lymphocytes and simultaneous inhibition of autophagy.

L’angiogenèse, indispensable à la mise en place d’un réseau vasculaire fonctionnel, est au cœur des stratégies thérapeutiques des pathologies ischémiques. L’hypoxie, caractérisant ces tissus ischémiques, est un stimulus majeur de l’angiogenèse, en induisant l’expression de facteurs de croissance tels que le VEGF et de protéines de la matrice extracellulaire endothéliale. Nous avons identifié la protéine ANGPTL4, comme une cible majeure de l’hypoxie et ayant des effets opposés au VEGF sur la perméabilité vasculaire. Le but de cette thèse a consisté en l’analyse du rôle d’ANGPTL4 sur la formation de capillaire et l’organisation des jonctions adhérentes dans un contexte dépendant du VEGF. J’ai démontré que le VEGF stimule la formation d’un dense réseau capillaire 3D alors qu’ANGPTL4 induit la formation de capillaires étroits et peu ramifiés. ANGPTL4 réduit la taille du réseau de capillaire induit par le VEGF en limitant le nombre de bourgeons, de branchements et la largeur des capillaires. ANGPTL4 renforce l’intégrité des capillaires formés en présence de VEGF en préservant des jonctions adhérentes stables. J’ai démontré qu’ANGPTL4 limite les processus de migration 3D et de prolifération induits par le VEGF. L’analyse de la voie de signalisation VEGF/ANGPTL4 a montré une potentialisation par ANGPTL4 de la phosphorylation Y1175 du VEGFR2, impliqué dans l’internalisation de VEGFR2. En conclusion, ce modèle révèle un effet d’ANGPTL4 dépendant du contexte 3D, qui stimule les processus d’angiogenèse en absence de VEGF et qui contrecarre la morphogenèse induite par le VEGF en renforçant l’intégrité des jonctions adhérentes et en régulant la signalisation en aval du VEGFR2. / Angiogenesis, by promoting new functional capillaries, is a main target of therapeutic strategies of ischemic pathologies. Ischemic tissues are characterized by hypoxic environment, which stimulates angiogenesis by inducing expression and secretion of growth factors such as VEGF and by remodeling endothelial extracellular matrix. Our team identified ANGPTL4 as a hypoxia-induced target and characterized its counteracting effect on VEGF-induced vascular permeability. This PhD study therefore aimed to decipher the role of ANGPTL4 on angiogenesis, capillary architecture and adherens junction (VE-cadherin) organization in a VEGF-dependent context. I demonstrated that VEGF induced formation of branched capillaries forming a dense 3D network while ANGPTL4 enhanced the formation of unbranched and tight capillaries. Remarkably, ANGPTL4 reduces VEGF-induced angiogenesis, by limiting branching and widening of the capillaries. Furthermore, ANGPTL4 regulates the local VE-cadherin patterning during the sprouting process by maintaining lateral linear structures and limiting the VEGF-induced formations involved in the migratory capacities. I demonstrated that ANGPTL4 limited VEGF-induced 3D endothelial cell migration and proliferation. Analysis of VEGF/ANGPTL4 signaling pathway pointed out that ANGPTL4 enhanced phosphorylation of Y1175 VEGFR2, known to enhance internalization of VEGFR2. In conclusion, this study modeled the 3D context-dependent effect of ANGPTL4 that stimulates angiogenesis in absence of VEGF whereas it counteracts VEGF-induced endothelial morphogenesis by regulating VEGFR2 trafficking and strengthening adherens junctions.

En raison d’une abondante matrice extracellulaire chondrogénique, peu vascularisée et hypoxique, le chondrosarcome, cancer du cartilage, est une tumeur chimio et radiorésistante. Une stratégie bispécifique s’appuyant sur deux caractéristiques spécifiques du chondrosarcome, une forte densité de charges négatives, ainsi qu’une hypoxie chronique sévère de la matrice extracellulaire, est actuellement développée au laboratoire et consiste à fonctionnaliser une prodrogue activée en hypoxie avec un ammonium quaternaire (AQ). Sur la base de résultats précliniques, une prodrogue, ICF05016, a été identifiée et fait actuellement l’objet d’une étude d’optimisation.Ce projet vise à identifier des relations structure-activité dans une série de moutardes phosphorodiamidates vectorisées par une fonction AQ. Dans une première partie, nous nous sommes intéressés à faire varier la nature des substituants de la fonction ammonium quaternaire ainsi que la longueur du bras espaceur séparant cette dernière de la moutarde. Ainsi, 27 dérivés ont été synthétisés par une séquence commune multi-étapes impliquant la phosphorylation d’un dérivé 2-nitro-5-hydroxyméthylimidazole.Un screening par résonance plasmonique de surface a permis de mettre en évidence 12 composés plus affins envers l’aggrécane que le composé de référence ICF05016. Cette étude a révélé une dépendance importante entre l’affinité à l’aggrécane et la nature de l’ammonium quaternaire, les composés benzyléspossédant tous des affinités supérieures. In vitrosur cultures cellulaires HEMC-SS, les composés ont affichés des ratios de cytotoxicité normoxie vs hypoxie (HCR)supérieurs à celui du lead ICF05016, et notamment le composé benzylé31f.Avec une constante de dissociation à l’aggrécane de 2,10 µM et un différentiel de cytotoxicité normoxie/hypoxie équivalent à celui de l’évosfosfamide en étude clinique, la composé 31f a été évalué en termes de stabilité et de clivage en conditions réductrices, mimant l’hypoxie tumorale. Démontrant une excellente stabilité sur 24 heures dans un tampon phosphate, le composé 31f s’est révélé être réduit par réduction chimique ou enzymatique via une nitroréductase, et ce avec une cinétique rapide. Ce dernier a été ainsi identifié au terme de l’évaluation in vitro et de cet axe de recherche comme un nouveau « lead ».Dans une seconde partie, nous avons choisi de moduler l’halogène et la position des bras alkylants portés par la moutarde phosphorodiamidate. Compte tenu de l’instabilité des composés de la série bromée, par rapport à la série chlorée, les analogues bromés des composés ICF05016 et 31f n’ont pu faire l’objet d’une évaluation in vitro. Pour les isomères de type moutarde ifosfamide, l’instabilité des précurseurs phosphoramidiques et les difficultés de synthèse inhérentes à l’introduction d’une fonction amine secondaire sur un chlorure de phosphoryle préalablement fonctionnalisé, nous ont contraints à réorienter nos travaux vers des structures issues d’une étape de chimie de click, permettant d’introduire le bras vecteur portant la fonction amine tertiaire indépendamment de l’étape de phosphorylation. Cette séquence réactionnelle pourrait être étendue à la synthèse de nouveaux analogues du composé 31f, identifié lors de ces travaux. / Due to an abundant chondrogenic, poorly vascularized and particularly hypoxic extracellular matrix, chondrosarcoma, a malignant cartilaginous tumour, is chemo- and radio-resistant. A dual targeted therapy leveraging specific chondrosarcoma hallmarks, an extensive cartilaginous extracellular matrix, namely the high negative fixed charge density and severe chronic hypoxia,was investigatedby conjugation of a hypoxia-activated prodrug (HAP) to quaternary ammonium (QA) functions. Based on preclinical results, animidazole prodrug, ICF05016, was identified and provided the basis for a lead optimization study.This project was designed to identify structure-activity relationships in a series of QA-targeted phosphorodiamidate mustard conjugates. In a first part, a series of 27 conjugates, with different QA function and length of the alkyl linker, was synthesizedvia a common multi-step sequence involvingphosphorylation of a key 2-nitroimidazole alcohol intermediate. Then, biomolecular interactions between these QA derivatives and aggrecan were assessed using thesurface plasmon resonance technology. This screeningrevealed that the affinity depends more on the natureof the QA function, rather than on the linker length. The most promising results were obtainedwith QA bearing a benzyle group. Twelves compounds were then evaluated in terms of hypoxia selective cytotoxicityonthe HEMC-SS cell line. For all prodrugs, an overall improvement in hypoxic selectivity compared with the ICF05016 was obtained and the positive impact of thebenzyle QA function was again highlighted. With a dissociation constant of 2.10 µM in the SPR experiment and an attractive hypoxic selectivity, compound 31fwas further selected for a stability and reductive activation study. Activation of the prodrug and phosphoramide mustard release under reductive chemical conditions, and nitroreductase-based activation were demonstrated. From this study, compound 31f emerged as the most effective PG-targeted HAPs. In a second part, the nature of the halogen and the position of the alkylating arms carried by the phosphorodiamidic mustard were modified. Given the high instability of the final compounds of the brominated series, compared to the chlorinated series, brominated analogs of the compounds ICF05016 and 31fcould not be obtained with sufficient purity to be evaluated in vitro.For ifosfamide-like isomers, the design of the prodrugs was modified due to the instability of the phosphoramidic precursors or difficulties of introducing a secondary amine function on a phosphoryl chloride previously functionalized.A click chemistry approach was developed to tether the spacer arm carrying the tertiary amine function independently of the phosphorylation step and could be extended to the synthesis of triazoleanalogues of the new lead 31f.

L'ennoyage est un phénomène courant qui se répercute sur les végétaux en diminuant leur croissance, leur développement et leur régénération. Il entraîne une forte diminution du taux d'oxygène (hypoxie) dans le compartiment racinaire résultat de l'excès d'eau dans le sol. Face à ce stress, certaines plantes sont capables intensifier leur métabolisme anaérobie et développer des adaptations morphologiques (lenticelles hypertrophiées, aérenchymes, racines adventives). Le chêne sessile (Quercus petraea Matt L.) et le chêne pédonculé (Quercus robur L.) présentent une différence de tolérance à l'ennoyage du sol mais sont génétiquement proches. Cependant, il existe peu de connaissances sur les processus physiologiques mis en place par ces deux espèces durant ce stress. La croissance ainsi que certains changements morphologiques, anatomiques et physiologiques étudiés chez les deux espèces en réponse à un ennoyage, ont confirmé que le chêne sessile était davantage sensible à ce stress. Le chêne pédonculé, espèce plus tolérante, parvient à maintenir son statut hydrique de même que son activité photosynthétique plus longtemps et à des niveaux moins critiques que le sessile. L'hémoglobine non-symbiotique améliore la survie des plantes en conditions d'hypoxie en interagissant avec le monoxyde d'azote (NO). Le clonage d'une hémoglobine non-symbiotique chez le chêne sessile a permis d'isoler le gène QpHb1 codant pour une protéine de 161 acides aminés et présentant toutes les caractéristiques communes aux hémoglobines non-symbiotiques de classe 1. Chez les deux espèces, QpHb1 est davantage exprimé dans les racines que dans la tige ou les feuilles, suggérant un rôle particulier dans ce tissu. L'expression de QpHb1 analysée par Northern blotting a montré une chute d'expression dans les racines dès les premières heures de stress chez le chêne sessile qui se poursuit durant toute la durée de l'expérience (28 jours). Alors que chez le chêne pédonculé, l'expression de QpHb1 suit un schéma plus complexe : on observe un pic d'expression après 1h d'ennoyage suivi d'une forte inhibition après 3h. Cette régulation pourrait être synonyme d'une implication de l'hémoglobine non-symbiotique dans la signalisation rapide du stress et par conséquent dans la mise en place de la tolérance. D'ailleurs sa localisation par hybridation in situ au niveau racinaire a montré que QpHb1 se situait au niveau des cellules du protoderme, pouvant suggérer un rôle dans la détection des modifications de la rhizosphère mais aussi au niveau du protoxylème qui pourrait lui permettre de participer à la signalisation entre l'appareil racinaire et l'appareil aérien via la S-nitrosylation. Dans la réponse à un ennoyage de plusieurs semaines, le chêne pédonculé met en place des adaptations (aérenchymes, lenticelles hypertrophiées et racines adventives) et exprime davantage QpHb1 que le chêne sessile notamment dans les racines adventives. La régulation spatio-temporelle de QpHb1 pourrait être impliquée dans la capacité de tolérance ainsi que dans la cascade de signalisation menant au développement de ces adaptations.

Notre étude a porté, d'une part sur l'effet du bicalutamide, un inhibiteur du récepteur aux androgènes, sur la réponse de trois lignées de cancer de prostate en association avec les rayonnements ionisants, d'autre part sur la recherche d'une corrélation entre l'expression des microARN miR-210 et miR-373 sur la tolérance à l'hypoxie et la réponse au rayonnement.Nous montrons que le bicalutamide induit un effet cytostatique et cytotoxique dans la lignée LNCaP, qui exprime le récepteur aux androgènes. Les lignées DU145 et PC3, qui n'expriment pas ou peu le récepteur, sont sensiblement plus résistantes mais sont cependant affectées par les concentrations élevées de bicalutamide. Cette sensibilité résiduelle suggère l'existence d'un mécanisme secondaire, indépendant de la voie de signalisation du récepteur aux androgènes. L'inhibition de la prolifération produite par le bicalutamide s'accompagne d'un blocage du cycle cellulaire en phase G1 avec une augmentation de l'expression de la protéine p27 et une diminution de l'expression de la protéine HER2. L'association concomitante au bicalutamide se traduit par un effet radioprotecteur dans la lignée LNCaP. Cette observation nous conduit à déconseiller l'association concomitante du bicalutamide avec la radiothérapie, notamment en cas d'irradiation hypofractionnée.Facteur bien connu de radiorésistance dans les tumeurs solides, l'hypoxie est associée à un mauvais pronostic dans les cancers de la prostate. Nos données montrent qu'en sus de l'induction de marqueurs classiques comme HIF-1α, CA9 et VEGF, l'hypoxie promeut l'expression du microARN miR-210, (mais non de miR-373) indépendamment de l'expression du récepteur aux androgènes. Les données suggèrent que miR-210, dont l'expression apparaît corrélée à la résistance à l'hypoxie, pourrait constituer un bon biomarqueur pronostique dans le cancer de la prostate. En revanche, l'inhibition de l'expression de miR-210 n'a aucun effet sur la radiosensibilité des cellules en condition d'hypoxie.

La plasticité mitochondriale à l'égard de l'oxydation de substrats, et sa participation à la transition métabolique ont été étudiées dans deux conditions: l'exposition chronique à l'hypoxie et l'entraînement en endurance, connues comme modulatrices de la préférence de substrats. Ainsi l'affinité pour le palmitoyl carnitine est augmentée par l'hypoxie et la restriction calorique alors qu'au contraire le flux maximal de palmitoyl CoA (PCoA) semble freiné par l'hypoxie. Quant aux effets de l'entraînement, malgré une amélioration du temps limite de course à intensité sous-maximale et une augmentation des capacités oxydatives globales, nous ne retrouvons pas de facilitation de l'oxydation du PCoA. Par ailleurs, on observe une augmentation des messagers PPAR-delta et d'UCP-3 en réponse à une exposition aigue à l'hypoxie. Le rôle de PPAR-delta sur la modulation de l'utilisation de substrats par la mitochondrie a aussi été envisagé en utilisant un agoniste pharmacologique de PPAR-delta, le GW 742. Celui-ci, permet d'améliorer l'efficacité catalytique du complexe enzymatique CPT-1 tout en limitant l'oxydation du pyruvate, également diminuée dans les muscles oxydatifs au cours de la restriction calorique. Le traitement par GW 742, s'il limite l'altération de l'efficacité catalytique de CPT-1 observée en hypoxie, ne permet pas de rétablir, un niveau d'oxydation en PCoA similaire à celui observé en situation contrôle. Le GW 742 s'est aussi montré capable de restaurer le flux en PCoA altéré par l'entraînement, même si la fonction du transport CPT-1 reste limitante devant l'augmentation du potentiel oxydatif induit par l'entraînement. Par ailleurs, nous n'avons pas retrouvé de relation étroite entre les variations d'affinité en PCoA et la performance aérobie sous-maximale, pourtant influencée par la capacité à oxyder préférentiellement les lipides. Enfin, la diminution du flux en pyruvate associée à l'augmentation de l'utilisation des acides gras à longue chaîne observée lors du traitement par GW 742 ou au cours de la restriction calorique pose la question du rôle joué par une cible particulière de PPAR-delta sur la mitochondrie, la protéine découplante UCP-3.

Patients with epilepsy often suffer debilitating cognitive and psycho-affective disorders.In some cases, epilepsy is associated to neurodegenerative processes that are the targetof certain therapeutical agents. Today, erythropoietin is considered as one of the most promising neuroprotective agents. In addition, an increased body of studies provides evidence that enrichment (or complexity) of housing decreases the cerebral vulnerabilityin the context of diverse brain insults. In this thesis, we demonstrate: 1) in a model ofepilepsy with large neuronal lesions, that erythropoietin protects the most vulnerable neuronal populations to excitotoxic injury, at the only condition that neuronal expression of its receptor is optimized prior to the primary insult causing epilepsy; 2) in a model of epilepsy associated with faint neuronal lesions that: i) erythropoietin prevents anxietyand impaired spatial learning and memory, ii) enriched housing in Marlau™ cages is moreefficient than erythropoietin, and iii) erythropoietin treatment abolishes beneficial effectsof enriched housing. These results, obtained in animal models of epilepsies associatedwith cognitive disorders establish that beneficial effects of a potential therapeutic agentmay rely on quality of life