Les cancers du sein hormono-indépendants et HER2 non amplifiés, dites triples négatives (TN), représentent 30 % des tumeurs du sein. Elles sont de mauvais pronostic et ne bénéficient pas actuellement de thérapeutiques ciblées.Les tumeurs du sein apocrine moléculaire (AM) sont des tumeurs qui se caractérisent par l’absence de récepteurs hormonaux et la présence du récepteur aux androgènes (RA) dont la voie de signalisation est activée. Dans 50 % des cas elles sont HER2 négatives, et entrent alors dans la catégorie des TN.Le rôle de cette signalisation androgénique est mal connu. Cependant elle apparait comme une cible thérapeutique intéressante dans ce groupe de tumeur ne bénéficiant pas des thérapies ciblées. De plus peu de modèles précliniques représentatifs des tumeurs AM ont été publiés.Dans ce projet nous avons exploré le RA et sa signalisation à partir de modèles de lignées cellulaires.Nous avons d’abord caractérisé ces modèles sur le plan mutationnel en séquençant le RA et en recherchant des altérations moléculaires dans les voies de signalisation des récepteurs hormonaux et des facteurs de croissance puis sur le plan transcritpomique en vérifiant la présence d’une signature AM moléculaire et en recherchant des variants d’épissage du RA.Nous avons ensuite pu mettre en évidence une régulation de la prolifération et de la clonogénicité de ces lignées après blocage du RA et de sa voie de signalisation par invalidation de son expression par siRNA.Nous avons finalement pu vérifier dans plusieurs de ces modèles qu’un traitement par différents agonistes et antagonistes ciblant le RA permettait de moduler la prolifération et l’expression des gènes cibles du RA. / Hormone-independent and non-amplified HER2 breast cancers, or triple negative (TN), represent 30% of breast tumors. They have a poor prognosis and do not currently benefit from targeted therapies.Molecular apocrine (MA) breast cancers are characterized by the absence of hormone receptors and the presence of the androgen receptor (AR) which signaling pathway is activated. In 50% of cases they are HER2 negative, and then fall into the category of TN.The role of the androgen signaling is poorly understood. However the AR appears as an attractive therapeutic target in this group of tumors without targeted therapies. Moreover few preclinical models of MA have been published.In this project we explored the AR and its signaling in cell lines models.We first characterized these models on the mutational level by sequencing the AR and seeking molecular alterations in the signaling pathways of hormone receptors and growth factors. Then on the transcritpomique level by checking the presence of a molecular MA signature and seeking the AR splice variants.We then could highlight a regulation of cell proliferation and clonogenicity in these cell lines by blocking the AR and its signaling pathway with siRNAs.We were finally able to check in several of these models that treatment with different agonists and antagonists targeting the AR allowed to modulate cell proliferation and the expression of AR target genes.

Η Δικαλουταμίδη είναι γνωστό φάρμακο για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη και κυκλοφορεί στην ελληνική αγορά με το εμπορικό όνομα casodex. Η διακαλουταμίδη υπάρχει σε δύο κρυσταλλικές μορφές (πολύμορφα) εκ των οποίων το πολύμορφο που εξετάζουμε (Ι) είναι αυτό που χρησιμοποιείται από τη βιομηχανία για την παραγωγή των δισκίων. Στην παρούσα εργασία αναπτύσσονται μεθοδολογίες ποσοτικού προσδιορισμού της δικαλουταμίδης Ι σε δισκία βασιζόμενες στις τεχνικές XRD (Χ Ray Diffraction), Raman και ATR (Attenuated Total Reflectance). Οι τεχνικές αυτές είναι οι πλέον κατάλληλες για τον ποσοτικό προσδιορισμό πολυμόρφων αφού οι ευρέως χρησιμοποιούμενες χρωματογραφικές τεχνικές δεν μπορούν να διακρίνουν μεταξύ των διαφορετικών κρυσταλλικών φάσεων. Για τον προσδιορισμό αυτό παρασκευάστηκαν μείγματα γνωστών αναλογιών κατά βάρος, της δραστικής και των εκδόχων, και χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία πρότυπης καμπύλης βαθμονόμησης για κάθε μία τεχνική. Οι καμπύλες βαθμονόμησης ήταν της μορφής y= a + b x. Το όριο ανίχνευσης για την ATR είναι 0,048 % wt, για την XRD είναι 0.14% wt και για τη μέθοδο FT-Raman 0.053% wt. Η εφαρμογή των εξισώσεων βαθμονόμησης σε εμπορικά δισκία των 50mg έδωσε τα ακόλουθα αποτελέσματα. Στη μέθοδο της περίθλασης ακτινών Χ η δραστική ουσία βρέθηκε να είναι 51,2 mg. Αυτή η τιμή αντιστοιχεί σε σφάλμα επί της ονομαστικής τιμής ίσο με 2,4% ενώ αντίστοιχα στη φασματοσκοπία Raman το σφάλμα της ονομαστικής τιμής βρέθηκε ίσο με 0,96% αφού η δραστική στο δισκίο μετρήθηκε και βρέθηκε να αντιστοιχεί σε 50,48 mg. Είναι ενδιαφέρον ότι ενώ η τεχνική της Attenuated Total Reflectance έδωσε ικανοποιητική καμπύλη βαθμονόμησης εντούτοις η εφαρμογή της στο εμπορικό σκεύασμα ήταν απογοητευτική και το σφάλμα βρέθηκε να είναι μεγαλύτερο του 67%. Πιθανώς η αποτυχία να οφείλεται στο μέγεθος των σωματιδίων στα κονιοποιημένα εμπορικά δισκία το οποίο μπορεί να ήταν αρκετά διαφορετικό από το αντίστοιχο μέγεθος στα πρότυπα μείγματα του εργαστηρίου.. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα συνιστάται η εφαρμογή της φασματοσκοπίας Raman για τον ποσοτικό προσδιορισμό της δραστικής γιατί συνδυάζει μικρό όριο ανίχνευσης και πολύ μικρή απόκλιση των ποσοτικών αποτελεσμάτων των εμπορικών δισκίων από την ονομαστική τιμή του σκευάσματος. / Bicalutamide is a well known drug for prostat cancer. Bicalutamide presents two crystalline polymorphs (form I and form II) which have the same chemical composition but different internal crystal structures due to different molecular conformation and, therefore, possess different physico-chemical properties. Form I is more stable than form II, and is already used as active pharmaceutical ingredient (API) in the form of tablets, such as Caxodex, produced by AstraZeneca. Form I is the polymorph that we used in this work. X-Ray Diffraction, Raman Spectroscopy and Attenuated Total Reflectance were used for the quantitative analysis of bicalutamide I in tablets and, their results were compared to each other. These techniques are the most suitable for determination of polymorphs as opposed to the widely used chromatographic techniques that cannot differentiate between the crystalline phases. Mixtures of different ratio of API (bicalutamide I) and excipients were prepared in order to construct a calibration curve for every technique. The detection limits for all suggested methods were determined as follows: a) ATR: 0,048 % wt, b) XRD: 0.14% wt and c) FT-Raman: 0.053% wt. The constructed calibrations lines were applied in commercial tablets of 50mg strength. The API strength in the commercial tablets using the ΧRD method was found to be 51,2 mg. This corresponds to an error of 2,4% with respect to the nominal value. FT-Raman method has yielded an error of 0,96% since the API strength of the commercial tablet was found to be 50,48mg. Application of ATR’s calibration curve has yielded an error of more than 67%. Probably the failure was due to the different particle size of mixtures used for the construction of the calibration curve and those of the grounded commercial tablets Based on the obtained data it can be concluded that the most suitable technique for the quantitative determination of the API strength in bicalutamide tablets is FT-Raman since it exhibits the minimum detection limit while the error from the nominal value of the API strength in the 50mg tablets was found to be less than 1%.

Notre étude a porté, d'une part sur l'effet du bicalutamide, un inhibiteur du récepteur aux androgènes, sur la réponse de trois lignées de cancer de prostate en association avec les rayonnements ionisants, d'autre part sur la recherche d'une corrélation entre l'expression des microARN miR-210 et miR-373 sur la tolérance à l'hypoxie et la réponse au rayonnement.Nous montrons que le bicalutamide induit un effet cytostatique et cytotoxique dans la lignée LNCaP, qui exprime le récepteur aux androgènes. Les lignées DU145 et PC3, qui n’expriment pas ou peu le récepteur, sont sensiblement plus résistantes mais sont cependant affectées par les concentrations élevées de bicalutamide. Cette sensibilité résiduelle suggère l'existence d'un mécanisme secondaire, indépendant de la voie de signalisation du récepteur aux androgènes. L'inhibition de la prolifération produite par le bicalutamide s'accompagne d'un blocage du cycle cellulaire en phase G1 avec une augmentation de l’expression de la protéine p27 et une diminution de l’expression de la protéine HER2. L'association concomitante au bicalutamide se traduit par un effet radioprotecteur dans la lignée LNCaP. Cette observation nous conduit à déconseiller l’association concomitante du bicalutamide avec la radiothérapie, notamment en cas d’irradiation hypofractionnée.Facteur bien connu de radiorésistance dans les tumeurs solides, l'hypoxie est associée à un mauvais pronostic dans les cancers de la prostate. Nos données montrent qu'en sus de l'induction de marqueurs classiques comme HIF-1α, CA9 et VEGF, l'hypoxie promeut l’expression du microARN miR-210, (mais non de miR-373) indépendamment de l’expression du récepteur aux androgènes. Les données suggèrent que miR-210, dont l'expression apparaît corrélée à la résistance à l'hypoxie, pourrait constituer un bon biomarqueur pronostique dans le cancer de la prostate. En revanche, l’inhibition de l’expression de miR-210 n'a aucun effet sur la radiosensibilité des cellules en condition d’hypoxie. / The first aim of our study was to evaluate the effect of the association between bicalutamide, an androgen receptor inhibitor, and ionizing radiation in three prostate cancer cell lines. The second aim was to examine a possible a correlation between the expression of miR-210 or miR-373, the tolerance to hypoxia tolerance and the responses to radiation.We found that bicalutamide produced cytostatic and cytotoxic effects in the androgen receptor- positive LNCaP cell line. The androgen receptor-negative DU145 and PC3 cell lines were more resistant to bicalutamide. However, these cell lines were affected by high bicalutamide concentration with the same endpoints as for LNCaP cells. The inhibition of proliferation by bicalutamide was associated with G1 cell cycle phase arrest, increased expression of p27KIP1 protein, and decreased expression of HER2 protein. Last but not least, bicalutamide elicited a marked radioprotective effect in LNCaP cells when associated with concomitant irradiation. This result suggests that bicalutamide and radiotherapy should not be delivered in close temporal proximity, especially in case of hypofractionated radiotherapy protocols.Hypoxia is a well known radioresistance factor in tumors and is associated with a bad prognosis in prostate cancer. In this study, we found that hypoxia promotes the expression of HIF-1α, CA9, VEGF and miR-210 but not miR-373 in prostate cancer cell lines irrespective of their androgen receptor status.Our findings suggest that miR-210 expression is correlated with resistance to hypoxia and could be used as a prognostic marker in prostate cancer. Conversely, miR-210 inhibition did not impact the radiation susceptibility of PC3 prostate cancer cell line under hypoxia.

The current standard treatment of prostate cancer by androgen deprivation therapy involves using drugs such as bicalutamide (Casodex) to antagonistically block androgen receptors that are normally present within prostate cells. Usually, the therapy is successful in the short run at limiting the growth of prostate cancer. However, in virtually all cases tumors begin to grow aggressively again after several months of treatment and new therapies must be started. The mechanism by which these prostate cells transform from androgen sensitive to androgen independent and anti-androgen resistant is unclear. In this study, we investigated the role of microRNAs, small 15 to 18 nucleotide regulatory RNAs, in regulating the desensitization of prostate cancer cells to the androgen receptor antagonist drug bicalutamide. In order to identify significant microRNAs, quantitative PCR was used to obtain genome-wide microRNA expression levels of 885 human microRNAs at different timepoints for androgen sensitive LNCaP cancer cells treated with bicalutamide and for untreated control cells in tissue culture. Analysis of microRNA expression by clustering analysis and by statistical comparisons of treatment groups resulted in identification of 28 microRNAs that have altered expression in the progression process. In silico target prediction analysis was performed with the microRNAs shown to have altered expression, and a group of genes predicted to be under microRNA regulatory control during cancer progression to resistance was identified. A microRNA expression profile can be useful in developing more effective prognostic and therapeutic tools for prostate cancer.

Notre étude a porté, d'une part sur l'effet du bicalutamide, un inhibiteur du récepteur aux androgènes, sur la réponse de trois lignées de cancer de prostate en association avec les rayonnements ionisants, d'autre part sur la recherche d'une corrélation entre l'expression des microARN miR-210 et miR-373 sur la tolérance à l'hypoxie et la réponse au rayonnement.Nous montrons que le bicalutamide induit un effet cytostatique et cytotoxique dans la lignée LNCaP, qui exprime le récepteur aux androgènes. Les lignées DU145 et PC3, qui n'expriment pas ou peu le récepteur, sont sensiblement plus résistantes mais sont cependant affectées par les concentrations élevées de bicalutamide. Cette sensibilité résiduelle suggère l'existence d'un mécanisme secondaire, indépendant de la voie de signalisation du récepteur aux androgènes. L'inhibition de la prolifération produite par le bicalutamide s'accompagne d'un blocage du cycle cellulaire en phase G1 avec une augmentation de l'expression de la protéine p27 et une diminution de l'expression de la protéine HER2. L'association concomitante au bicalutamide se traduit par un effet radioprotecteur dans la lignée LNCaP. Cette observation nous conduit à déconseiller l'association concomitante du bicalutamide avec la radiothérapie, notamment en cas d'irradiation hypofractionnée.Facteur bien connu de radiorésistance dans les tumeurs solides, l'hypoxie est associée à un mauvais pronostic dans les cancers de la prostate. Nos données montrent qu'en sus de l'induction de marqueurs classiques comme HIF-1α, CA9 et VEGF, l'hypoxie promeut l'expression du microARN miR-210, (mais non de miR-373) indépendamment de l'expression du récepteur aux androgènes. Les données suggèrent que miR-210, dont l'expression apparaît corrélée à la résistance à l'hypoxie, pourrait constituer un bon biomarqueur pronostique dans le cancer de la prostate. En revanche, l'inhibition de l'expression de miR-210 n'a aucun effet sur la radiosensibilité des cellules en condition d'hypoxie.

Le cancer de la prostate est un problème de société majeur équivalent au cancer du sein chez la femme. La plupart de ces cancers sont hormono-dépendants et un des traitements utilisés est l'administration d'anti-androgènes non stéroïdiens. Ce sont des molécules qui inhibent de manière compétitive les effets des androgènes en se fixant sur le site de liaison du récepteur AR. Les anti-androgènes non stéroïdiens commerciaux sont la flutamide et son métabolite actif, le 2-hydroxyflutamide, la nilutamide et la bicalutamide. Néanmoins, à cause des phénomènes de résistance aux médicaments qui se manifestent après un traitement de longue durée, il devient impératif de concevoir de nouvelles molécules plus efficaces. Nous avons choisi d'incorporer un groupe ferrocène au niveau de la structure des anti-androgènes, car il possède des propriétés cytotoxiques intéressantes. Ce travail de recherche présente donc la synthèse d'analogues d'anti-androgènes non stéroïdiens commerciaux couplés avec des groupements ferrocène. Une fois synthétisés, ils sont soumis à une série de tests biologiques entrepris au sein du laboratoire. Ils comprennent, d'une part, des tests d'affinité relative de liaison (RBA) au récepteur à androgènes (AR) et, d'autre part, une série de tests anti-prolifératifs réalisés in vitro sur des lignées cellulaires tumorales prostatiques. Ces tests nous permettront de définir si ces molécules possèdent un intérêt particulier dans le cadre de la lutte contre le cancer de la prostate hormono-dépendant ou indépendant.

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The advent of prostate-specific antigen (PSA) testing and increased patient awareness has led to patients being diagnosed with prostate cancer at an earlier stage and a younger age than previously. Adjuvant hormonal therapy to radiotherapy or prostatectomy has been shown to reduce the risk of tumour progression, and in some studies survival benefits have been demonstrated. The non-steroidal antiandrogen bicalutamide (‘Casodex’) has undergone extensive evaluation and is currently undergoing clinical trials as immediate therapy, either alone or as adjuvant to treatment of curative intent in patients with localized or locally advanced disease. Data from the first analysis of one of the studies in the Early Prostate Cancer (EPC) programme involving 3,603 patients have shown that, after a median follow-up of 2.6 years, the risk of prostate cancer progression was significantly reduced (by 43%) in patients receiving bicalutamide 150 mg compared with those receiving standard care alone (HR 0.57; 95% CI 0.48, 0.69; p ≪ 0.0001). The risk of PSA progression was also significantly reduced (by 63%). At this stage the survival data are still immature. Side effects of bicalutamide were mostly gynaecomastia and breast pain, which is consistent with its pharmacology. Overall withdrawal rates were similar in the bicalutamide 150 mg and standard care alone groups. In the bicalutamide 150 mg group, withdrawals were mainly due to side effects, whereas in the group receiving standard care alone, withdrawals were mainly due to disease progression. The programme is ongoing, and survival data are awaited. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Introduction: Prostate cancer is the most common type of cancer in Sweden and is often treated using antiandrogenic drug therapy. Two substances belonging to this class of pharmaceuticals are bicalutamide and flutamide. After excretion from the human body, the drug molecules enter the wastewater treatment plant (WWTP). The WWTPs are not effective enough to completely remove pharmaceutical residues, why presence of both bicalutamide and flutamide can be detected in WWTP effluent water. Previous findings: Antiandrogens have been reported to affect reproduction in adult fish, but studies regarding possible effects on the embryonic development of fish are few. Aim: The present study sought to investigate if exposure to bicalutamide or flutamide cause toxicity in the early developmental stages of zebrafish embryos, and whether negative effects occur within concentrations relevant to measured environmental levels. Method: A modified OECD FET-test was used, where additional sublethal endpoints were included and the time period for assessment extended to 144 hours post fertilization (hpf). In addition, a locomotor activity assay was performed at 144 hpf in order to observe any sub-lethal swimming behavioral effects. Results: High doses (10 mg/L) of flutamide led to 100% lethality of the zebrafish embryos but the results suggest no acute toxic effects in the high dose treatment group of bicalutamide, or of either flutamide or bicalutamide within in the low (0.1 mg/L) or intermediate (1 mg/L) treatment groups. Neither did the locomotor activity assay result in statistically significant results, although the pattern of swimming activity in the low dose groups suggests that behavioral developmental effects could be present. Conclusions: High doses of flutamide caused mortality of the embryos, but no lethal or sublethal effects were present at environmentally relevant concentrations. The modest outcome of present study however suggests that further investigation of behavioral developmental effects of antiandrogens could be of future relevance. Analysis of the expression of genes related to neuronal growth, memory and other cognitive behaviors associated with behavioral changes, would then be of interest for further studies.

Adjuvant hormonal therapy has been demonstrated to be able to delay disease progression in nonmetastatic prostate cancer. To date, however, a favorable impact on survival has only been demonstrated in lymph-node-positive disease and in external-beam radiotherapy series with locally advanced and probably mainly micrometastatic tumors. The Bicalutamide Early Prostate Cancer Program is the largest study under way to define the role of adjuvant treatment in early prostate cancer and identify subgroups of patients likely to benefit from immediate hormonal therapy. At the time of the most recently published analysis, the risk of objective clinical progression was significantly reduced in the bicalutamide arm (hazards ratio 0.58, 95% confidence interval 0.51–0.66, p < 0.0001). However, further maturation of data is needed to see whether this difference will lead to a survival advantage. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.