L’Ins(1,4,5)P3 joue un rôle évident dans la signalisation cellulaire : il permet la libération du Ca 2+ des stocks intracellulaires par son action au niveau de récepteurs spécifiques. Pour mettre fin à son action, l’Ins(1,4,5)P3 peut être dégradé par une Ins(1,4,5)P3 5-phosphatase en Ins(1,4)P2, un métabolite inactif. L’Ins(1,4,5)P3 peut aussi être transformé en Ins(1,3,4,5)P4 par une Ins(1,4,5)P3 3-kinase. L’Ins(1,3,4,5)P4 semble posséder des capacités de signalisation propres ou au contraire liées à celles de l’Ins(1,4,5)P3. L’Ins(1,3,4,5)P4 est aussi le point de départ de toute une série d’inositol hautement phosphorylés, dont les rôles ne sont pas clairs. Trois isoformes de l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase existent (A, B et C). Ces isoformes possèdent un domaine catalytique carboxy-terminal bien conservé. Par contre, les domaines amino-terminaux sont spécifiques et leur permettraient d’établir des interactions ou de subir des régulations propres. Pour tenter d’élucider le rôle fonctionnel de l’Ins(1,3,4,5)P4, nous avons généré et analysé des souris déficientes pour les isoformes B et C de cette enzyme. Les souris déficientes pour l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase C ne présentent pas de phénotype évident, ce qui suggère que son rôle n’est pas crucial ou que son absence peut être compensée par une autre enzyme. Les souris déficientes pour l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase B, par contre, présentent une immunodéficience caractérisée par une absence spécifique des lymphocytes T αβ périphériques. Cette absence fait suite à un blocage dans la différenciation du précurseur du lymphocyte, le thymocyte. Les caractéristiques de la signalisation induite par le récepteur de surface (TCR) permettent la sélection des thymocytes, de manière à constituer un pool de lymphocytes T restreints pour le MHC et tolérants pour le soi. Nous avons montré que ces phénomènes de sélection étaient défectueux dans les thymocytes mutants, du fait de leur hyporéactivité à la stimulation par le TCR. Le mécanisme responsable de cette hyporéactivité n’est pas encore élucidé. A première vue, la mobilisation de Ca 2+ ne semble pas altérée dans ces thymocytes mutants en réponse à des stimulations classiques. Cependant, d’autres types de stimulation, se rapprochant plus de celles réellement rencontrées par le thymocyte in vivo, doivent encore être investigués. L’intégrité d’autres voies de signalisation cruciales du lymphocyte T doit aussi être vérifiée. En conclusion, l’isoforme B de l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase et l’Ins(1,3,4,5)P4 qu’il produit jouent un rôle crucial dans la différenciation du thymocyte, par un mécanisme qui reste encore à déterminer.

OBJECTIVE: The aryl hydrocarbon receptor (AhR) translocates to the nucleus and binds to the aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT) to regulate biological responses upon ligand activation. The aim of this study was to measure the effects of activation or inhibition of AhR activity on basal and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) from clonal pancreatic β-cells (INS-1) cultured under normal and glucolipotoxic (GLT) conditions (high glucose and fatty acid). METHODS: Insulin content and secretion were measured utilizing homogenous time-resolved fluorescence (HTRF) insulin assay kit (cisbio). Cells cultured in RPMI media containing 5 mM and 11 mM glucose were pre-incubated with the receptor agonist FICZ or antagonist CH223191 for 96 hours. Insulin secretion over 2 hours was reported as ng/million cells. Intracellular lipid was measured by fluorescence after Nile red staining. RESULTS: Incubation of INS-1 cells with 11 mM glucose and fatty acid increased lipid droplets, basal insulin secretion and inhibited GSIS compared to cells cultured in 4 mM glucose, characteristic of GLT. Incubation of INS-1 cells with 11 mM glucose alone also exhibited GLT characteristics. INS-1 cells cultured at 11 mM glucose and treated with antagonist (1.25 - 10 μM) had decreased lipid content and improved insulin secretion compared to cells cultured in 11 mM glucose alone. INS-1 cells cultured in 5 mM glucose and treated with the AhR agonist (1.25 - 10 μM) exhibited increased intracellular lipid and impaired insulin secretion. CONCLUSION: The AhR may play a mediatory role in the development of GLT in pancreatic β-cells cultured in excess nutrients and β-cell specific activator or inhibitor ligands of this receptor could potentially be a targeted therapeutic treatment of diabetes.

Major depressive disorder (MDD) is one of the most common psychiatric illnesses worldwide, with pharmacotherapy as a first-line option for the management of this illness. The National Center for Health Statistics found that the use of antidepressants has increased by more than 4 fold in the last 20 years. While SSRI’s act centrally to treat MDD, their peripheral effects are often overlooked. Interestingly, components of the serotonergic system including the serotonin transporter (SERT), serotonin receptors, and enzymes important for serotonin synthesis (tryptophan hydroxylase 1 and 2; Tph1 and Tph2) are affected by SSRI treatment both centrally and peripherally. This disruption of serotonin signaling in the pancreas is of particular interest as there is a considerable link between the serotonin and hedgehog signaling pathways, both of which are important for pancreatic beta cell function. I hypothesize that pancreatic beta cell exposure to the SSRI fluoxetine in vitro will lead to altered hedgehog signaling ultimately resulting in a disruption in insulin secretion. / Thesis / Master of Science in Medical Sciences (MSMS)

Recent studies show that angiotensin II can act within the cell, possibly via intracellular receptors pharmacologically different from typical plasma membrane angiotensin II receptors. The signal transduction of intracellular angiotensin II is unclear. Therefore, we investigated the effects of intracellular angiotensin II in cells devoid of physiological responses to extracellular angiotensin II (A7r5 vascular smooth muscle cells). Intracellular delivery of angiotensin II was obtained by using liposomes or cell permeabilisation. Intracellular angiotensin II stimulated Ca2+ influx, as measured by 45Ca2+ uptake and single-cell fluorimetry. This effect was insensitive to extracellular or intracellular addition of losartan (angiotensin AT1 receptor antagonist) or PD123319 ((s)-1-(4-[dimethylamino]-3-methylphenyl)methyl-5-(diphenylacetyl)-4,5,6,7- tetrahydro-1H-imidazo[4,5-c]pyridine-6-carboxylate) (angiotensin AT2 receptor antagonist). Intracellular angiotensin II stimulated inositol-1,4,5-trisphosphate (Ins(1,4,5,)P3) production and increased the size of the Ins(1,4,5,)P3 releasable 45Ca2+ pool in permeabilised cells, independent of losartan and PD123319. Small G-proteins did not participate in this process, as assessed by using GDPβS. Intracellular delivery of angiotensin I was unable to elicit any of the effects elicited by intracellular angiotensin II. We conclude from our intracellular angiotensin application experiments that angiotensin II modulates Ca2+ homeostasis even in the absence of extracellular actions. Pharmacological properties suggest the involvement of putative angiotensin non-AT1-/non-AT2 receptors.

Implication du PTP dans la mort cellulaire β pancréatique L'hyperglycémie, l'hyperfructosémie et l'ischémie-reperfusion sont délétères pour la viabilité cellulaire β pancréatique, jouant un rôle majeur dans la perte de la masse cellulaire β. Le pore de transition de perméabilité mitochondriale (PTP) est un canal mitochondrial impliqué dans le déclenchement de la mort cellulaire. Des données récentes montrent l'implication du PTP et du stress oxydant dans la toxicité induite par l'ischémie-reperfusion sur cardiomyocytes et également dans la glucotoxicité induite sur cellules endothéliales. La première partie de notre étude a visé à étudier l'implication de l'ouverture du PTP dans la mort cellulaire des cellules INS-1 et des îlots pancréatiques humains soumis à de fortes concentrations de glucose et de fructose. Nous démontrons que l'incubation des cellules INS-1 et des îlots pancréatiques humains en présence de 30 mM de glucose ou 2,5 mM de fructose déclenche une ouverture du PTP et induit la mort cellulaire. La metformine et la Cyclosporine A (CsA) préviennent l'ouverture du PTP et la mort cellulaire induite par le glucose et le fructose. La deuxième partie de notre travail montre que l'exposition des INS-1 à une heure de carence en substrat concomitante d'une hypoxie, suivie d'une restauration des conditions basales conduit à l'ouverture du PTP et à une majoration drastique de la mort cellulaire. Ces deux évènements sont totalement prévenus par l'incubation préalable par la CsA et la metformine mais aussi par la N-Acétyl-Cystéine (NAC) ou par l'exposition à une anoxie, soulignant ainsi le rôle fondamental du stress oxydant dans le déclenchement de l'ouverture du PTP et de la mort cellulaire. Nous montrons qu'au cours de l'ischémie-reperfusion simulée, la production de superoxide est bi-phasique : nous décrivons un premier pic de production au cours de la carence en substrat, lié à un flux reverse d'électrons au sein du complexe I de la chaîne respiratoire. Ce premier pic est suivi d'un deuxième pic de production après la restauration du niveau de substrats et d'O2, lié à l'ouverture du PTP. La NAC, l'anoxie ou la metformine préviennent les deux pics de production de superoxide tandis que la CsA prévient seulement le second pic. Enfin, nous montrons que l'hypoxie seule n'induit ni stress oxydant, ni ouverture du PTP ni mortalité cellulaire. L'ensemble de notre travail démontre le rôle central du PTP dans la gluco-fructotoxicité et dans la toxicité induite par l'ischémie-reperfusion sur la cellule β pancréatique. Ainsi, prévenir l'ouverture du PTP peut-être une approche intéressante pour préserver la viabilité cellulaire β. / PTP involvement in β pancreatic cell death Hyperglycemia, hyperfructosemia and ischemia-reperfusion play a major role in the progression of β cell loss in diabetes mellitus. The permeability transition pore (PTP) is a mitochondrial channel involved in cell death. PTP opening and oxidative stress have been shown to be involved in ischemia-reperfusion injury on cardiomyocytes and in hyperglycemia-induced cell death in endothelial cells. In the first part of this work, we have examined the involvement of PTP opening in INS-1 cells and human pancreatic islets cell death induced by high levels of glucose or fructose. We first reported that Metformin and Cyclosporin A (CsA) prevented Ca2+-induced PTP opening in permeabilized and intact INS-1 cells. We then shown that incubation of INS-1 cells and human islets in the presence of 30 mM glucose or 2.5 mM fructose induced PTP opening and led to cell death. Because both Metformin and CsA prevented glucose and fructose induced PTP opening, and hampered glucose and fructose induced cell death, we conclude that PTP opening is involved in high glucose and high fructose induced INS-1 and human islets cell death. We therefore suggest that preventing PTP opening might be a new approach to preserve β cell viability. In the second part of the work, we demonstrate that the incubation of INS-1 cells in the absence of energy substrates in hypoxic condition for 1 hour followed by incubation in normal condition led to PTP opening and to a dramatic increase in cell death. Both events were totally prevented when PTP opening was inhibited by either Cyclosporin A (CsA) or Metformin or when the cells were incubated in the presence of the antioxidant N-acetyl-cystein (NAC), in anoxia, highlighting the implication of oxidative stress is the commitment of PTP opening. Superoxide production increased during the removal of energy substrates, due to reverse electron flux through complex I and again increased when normal energy substrate and O2 were restored, due to PTP opening. NAC, anoxia or Metformin prevented the two phases of oxidative stress, while CsA prevented only the second one. Hypoxia alone did not induce oxidative stress, PTP opening or cell death. Our work demonstrates the implication of PTP opening in ischemia-reperfusion injury and gluco- fructotoxicty in β pancreatic cells. We therefore suggest that preventing PTP opening might be a new approach to preserve β cell viability.

Implication du PTP dans la mort cellulaire β pancréatique L'hyperglycémie, l'hyperfructosémie et l'ischémie-reperfusion sont délétères pour la viabilité cellulaire β pancréatique, jouant un rôle majeur dans la perte de la masse cellulaire β. Le pore de transition de perméabilité mitochondriale (PTP) est un canal mitochondrial impliqué dans le déclenchement de la mort cellulaire. Des données récentes montrent l'implication du PTP et du stress oxydant dans la toxicité induite par l'ischémie-reperfusion sur cardiomyocytes et également dans la glucotoxicité induite sur cellules endothéliales. La première partie de notre étude a visé à étudier l'implication de l'ouverture du PTP dans la mort cellulaire des cellules INS-1 et des îlots pancréatiques humains soumis à de fortes concentrations de glucose et de fructose. Nous démontrons que l'incubation des cellules INS-1 et des îlots pancréatiques humains en présence de 30 mM de glucose ou 2,5 mM de fructose déclenche une ouverture du PTP et induit la mort cellulaire. La metformine et la Cyclosporine A (CsA) préviennent l'ouverture du PTP et la mort cellulaire induite par le glucose et le fructose. La deuxième partie de notre travail montre que l'exposition des INS-1 à une heure de carence en substrat concomitante d'une hypoxie, suivie d'une restauration des conditions basales conduit à l'ouverture du PTP et à une majoration drastique de la mort cellulaire. Ces deux évènements sont totalement prévenus par l'incubation préalable par la CsA et la metformine mais aussi par la N-Acétyl-Cystéine (NAC) ou par l'exposition à une anoxie, soulignant ainsi le rôle fondamental du stress oxydant dans le déclenchement de l'ouverture du PTP et de la mort cellulaire. Nous montrons qu'au cours de l'ischémie-reperfusion simulée, la production de superoxide est bi-phasique : nous décrivons un premier pic de production au cours de la carence en substrat, lié à un flux reverse d'électrons au sein du complexe I de la chaîne respiratoire. Ce premier pic est suivi d'un deuxième pic de production après la restauration du niveau de substrats et d'O2, lié à l'ouverture du PTP. La NAC, l'anoxie ou la metformine préviennent les deux pics de production de superoxide tandis que la CsA prévient seulement le second pic. Enfin, nous montrons que l'hypoxie seule n'induit ni stress oxydant, ni ouverture du PTP ni mortalité cellulaire. L'ensemble de notre travail démontre le rôle central du PTP dans la gluco-fructotoxicité et dans la toxicité induite par l'ischémie-reperfusion sur la cellule β pancréatique. Ainsi, prévenir l'ouverture du PTP peut-être une approche intéressante pour préserver la viabilité cellulaire β.

The trafficking of insulin secretory granules(SGs) of pancreatic b-cells is a tightly controlled complex network. Increasing evidence indicates that the cortical actin cytoskeleton modulates the mobility and exocytosis of SGs,yet the mechanisms anchoring SGs to the cytoskeleton is not completely understood.It has been shown by Ort et al.(2000,2001) that the cytoplasmic tail of an intrinsic membrane protein of the SGs named ICA512/IA-2 binds the PDZ domain of b2-syntrophin,which in turn binds to the F-actin-binding protein utrophin. These data also indicate that stimulation of SG exocytosis affects the phosphorylation of b2-syntrophin,hence altering its binding to ICA512.Therefore a model was proposed whereby SGs are anchored to the actin cytoskeleton through the ICA512/b2-syntrophin complex, whose dynamics are regulated by phosphorylation.To test this model GFP-b2-syntrophin stable INS-1 cell clones were generated.GFP-b2-syntrophin expression and localization pattern were similar to those of the endogenous protein. Electron microscopy showed that in GFP-b2-syntrophin INS-1 cells the number of SGs with a pear-like shape was increased relative to control cells. Insulin content and stimulated secretion were increased in three GFP-â2-syntrophin INS-1 cell clones,compared to non-transfected INS-1 cells and INS-1 cells expressing GFP. These increments correlated with the different expression levels of GFP-b2-syntrophin in the three GFP-b2-syntrophin INS-1 cell clones. These findings support the hypothesis that b2-syntrophin regulates the trafficking and exocytosis of SGs by modulating their tethering to the actin cytoskeleton.In order to confirm the proposed model, the phosphorylation of b2-syntrophin was investigated in more detail. Similar to endogenous b2-syntrophin,GFP-b2-syntrophin underwent Ca2+-dependent and okadaic acid-sensitive dephosphorylation upon stimulation of insulin secretion. Stimulation-dependent dephosphorylation was confirmed by immunoprecipitation of 32P-labeled GFP-b2-syntrophin.Mass spectrometry of immunoprecipitated GFP-b2-syntrophin allowed the identification of four serine-phosphorylation sites (S75,S90,S213,S373) that could affect the binding to ICA512.Mutants,in which all four phosphoserines, were replaced by either asp or ala to mimic(S/D) or prevent(S/A) phosphorylation were expressed in INS-1 cells. All S/D mutants retained a cortical localization,but by immunoblotting the pattern of the S75D allele differed from wild type and all other S/D alleles.Conversely, all S/A alleles were diffused cytosolically, except S213A,which was still restricted to the cortex. Finally, pull down assays showed increased binding of ICA512 to the S75A and S90D alleles compared to wild type b2-syntrophin,while the opposite was observed with the S75D and S90A mutants.Additionally,both the S75 and the S213 allele conform a consensus for phosphorylation by Cdk5,which is known to modulate insulin secretion. The phosphorylation of GFP-b2-syntrophin and particularly the S75 allele by Cdk5 was exhibited with pharmacological inhibitors,by in vitro phosphorylation and by RNAi. Taken together, these findings are consistent with the model by which phosphorylation of b2-syntrophin modulates the tethering of SGs to the cytoskeleton, and thereby their mobility and exocytosis. Specifically, the data of this thesis suggest that Cdk5-dependent phosphorylation of the S75 site of GFP-b2-syntrophin facilitates insulin secretion by reducing the interaction of b2-syntrophin with ICA512,thereby decreasing the actin cytoskeleton constrain on SG mobility. This process could occur in combination with the phosphatase-dependent dephosphorylation of b2-syntrophin at phosphosites other than S75. / Der Transport Insulin-gefüllter sekretorische Granula(SG) ist ein streng kontrollierter komplexer Prozess.Es gibt vermehrt Beweise,dass das kortikale Actinzytoskelett die Ausschüttung der SGs beeinflusst.Bisher ist der Mechanismus der Verankerung von SGs am Zytoskelett noch nicht vollständig aufgeklärt.Ort et al.(2000,2001) haben gezeigt,daß der zytosoplasmatische Teil des trans-membranen SG-Proteins ICA512 mit der PDZ-Domäne von b2-Syntrophin interagiert.Dieses Protein bindet das F-Actin-Bindeprotein Utrophin.Die Ergebnisse zeigen außerdem,daß durch Stimulation der SG-Exozytose der Phosphorilierungsstatus von b2-Syntrophin beeinflusst wird,woraus ein verändertes Bindungsvermögen zu ICA512 resultiert.Es wurde ein Funktionsmodel vorgestellt,in dem sich SGs durch die Interaktion des ICA512/b2-Syntrophin Komplexes an das Actinzytoskelett binden.Dabei wird die Bindedynamik durch Phosphorilierung reguliert.Um dieses Model zu etablieren,wurden stabile GFP-b2-Syntrophin produzierende INS-1-Zellklone erzeugt.Die zelluläre Lokalisation und das Expressionsmuster von GFP-b2-Syntrophin stimmen mit dem des endogenen Proteins überein.Elektronenmikroskopie zeigte eine größe Anzahl oval-verformter SGs in GFP-b2-Syntrophin INS-1-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen.Verglichen mit nicht-transfizierten INS-1 Zellen waren in drei GFP-b2-Syntrophin INS-1-Zellklonen der Insulingehalt der Zellen und die stimulierte Insulinsekretion erhöht.Die Werte korrelierten mit den unterschiedlichen GFP-b2-Syntrophin Expressionsmengen der Klone.Diese Ergebnisse untermauern die Hypothese,daß b2-Syntrophin den Transport und die Sekretion der SGs durch Modulation ihres Bindevermögens an Actin reguliert.Um das postulierte Model genauer zu prüfen,wurde die Phosphorilierung von b2-Syntrophin detaillierter untersucht.Das GFP-Protein wurde,ähnlich dem endogenen b2-Syntrophin,durch Stimulation der Insulinausschüttung dephosphoriliert.Diese Dephosphorilierung ist Ca2+-abhängig und Okadeinsäuresensitiv.Die stimulationsabhängige Dephosphorilierung wurde durch Immunoprezipitation von 32P-markiertem GFP-b2-Syntrophin bestätigt.Massenspektrometrie des präzipitierten Proteins ermöglichte die Identifikation von vier Serin-Phosphorilierungsstellen(S75,S90,S213,S373),welche die Bindung zu ICA512 beeinflussen könnten.Mutanten,in denen die vier Phosphoserine durch Asp beziehungsweise Ala ersetzt wurden,um entweder eine Phosphorilierung(S/D) oder Dephosphorilierung(S/A) nachzuahmen,wurden in INS-1-Zellen exprimiert.Alle S/D Mutanten blieben kortikal lokalisiert.Das Expressionsmuster des S75D Allels unterschied sich jedoch von denen des Wild-Typs(wt).Im Gegensatz dazu waren alle S/A Allele zytosolisch verteilt.Eine Ausnahme bildete S213A,das an der Zellkortex lokalisiert blieb.Im Vergleich zu wt b2-Syntrophin zeigten PullDown-Assays eine erhöhte Bindung von ICA512 zu den S75A und S90D Allelen.Das Gegenteil konnte für die S75D und S90A Mutanten nachgewiesen werden.S75,S90 und S213 sind in einer Konsensussequenz für Cdk5-Phosphorilierung enthalten.Diese Kinase kann die Insulinsekretion regulieren.Die Phosphorilierung von b2-Syntrophin,insbesondere des S75 Allels durch Cdk5 wurde durch pharmakologische Inhibitoren,in vitro-Phosphorilierung und RNAi demonstriert.Zusammenfassend stimmen diese Erkenntnisse mit dem Model überein,daß die Phosphorilierung von b2-Syntrophin die Vernetzung von SGs mit Actin und dadurch deren Mobilität und Exozytose moduliert.Im Speziellen postulieren die Ergebnisse dieser Arbeit eine Cdk5-abhängige Phosphorilierung der S75 Stelle des b2-Syntrophins.Durch eine verminderte Interaktion von b2-Syntrophin und ICA512 erleichtert diese Mutante vermutlich die Insulinsekretion,da der Einfluss des Actinzytoskeletts auf die Granulamobilität vermindert ist.Dieser Prozess ereignet sich möglicherweise in Kombination mit einer Dephosphorilierung des b2-Syntrophins.in Kombination mit einer Dephosphorilierung des b2-Syntrophins.

L’Ins(1,4,5)P3 joue un rôle évident dans la signalisation cellulaire :il permet la libération du Ca 2+ des stocks intracellulaires par son action au niveau de récepteurs spécifiques. Pour mettre fin à son action, l’Ins(1,4,5)P3 peut être dégradé par une Ins(1,4,5)P3 5-phosphatase en Ins(1,4)P2, un métabolite inactif. L’Ins(1,4,5)P3 peut aussi être transformé en Ins(1,3,4,5)P4 par une Ins(1,4,5)P3 3-kinase. L’Ins(1,3,4,5)P4 semble posséder des capacités de signalisation propres ou au contraire liées à celles de l’Ins(1,4,5)P3.<p>L’Ins(1,3,4,5)P4 est aussi le point de départ de toute une série d’inositol hautement phosphorylés, dont les rôles ne sont pas clairs. Trois isoformes de l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase existent (A, B et C). Ces isoformes possèdent un domaine catalytique carboxy-terminal bien conservé. Par contre, les domaines amino-terminaux sont spécifiques et leur permettraient d’établir des interactions ou de subir des régulations propres. Pour tenter d’élucider le rôle fonctionnel de l’Ins(1,3,4,5)P4, nous avons généré et analysé des souris déficientes pour les isoformes B et C de cette enzyme.<p>Les souris déficientes pour l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase C ne présentent pas de phénotype évident, ce qui suggère que son rôle n’est pas crucial ou que son absence peut être compensée par une autre enzyme.<p>Les souris déficientes pour l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase B, par contre, présentent une immunodéficience caractérisée par une absence spécifique des lymphocytes T αβ périphériques. Cette absence fait suite à un blocage dans la différenciation du précurseur du lymphocyte, le thymocyte. Les caractéristiques de la signalisation induite par le récepteur de surface (TCR) permettent la sélection des thymocytes, de manière à constituer un pool de lymphocytes T restreints pour le MHC et tolérants pour le soi. Nous avons montré que ces phénomènes de sélection étaient défectueux dans les thymocytes mutants, du fait de leur hyporéactivité à la stimulation par le TCR. Le mécanisme responsable de cette hyporéactivité n’est pas encore élucidé. A première vue, la mobilisation de Ca 2+ ne semble pas altérée dans ces thymocytes mutants en réponse à des stimulations classiques. Cependant, d’autres types de stimulation, se rapprochant plus de celles réellement rencontrées par le thymocyte in vivo, doivent encore être investigués. L’intégrité d’autres voies de signalisation cruciales du lymphocyte T doit aussi être vérifiée.<p>En conclusion, l’isoforme B de l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase et l’Ins(1,3,4,5)P4 qu’il produit jouent un rôle crucial dans la différenciation du thymocyte, par un mécanisme qui reste encore à déterminer. / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

The trafficking of insulin secretory granules(SGs) of pancreatic b-cells is a tightly controlled complex network. Increasing evidence indicates that the cortical actin cytoskeleton modulates the mobility and exocytosis of SGs,yet the mechanisms anchoring SGs to the cytoskeleton is not completely understood.It has been shown by Ort et al.(2000,2001) that the cytoplasmic tail of an intrinsic membrane protein of the SGs named ICA512/IA-2 binds the PDZ domain of b2-syntrophin,which in turn binds to the F-actin-binding protein utrophin. These data also indicate that stimulation of SG exocytosis affects the phosphorylation of b2-syntrophin,hence altering its binding to ICA512.Therefore a model was proposed whereby SGs are anchored to the actin cytoskeleton through the ICA512/b2-syntrophin complex, whose dynamics are regulated by phosphorylation.To test this model GFP-b2-syntrophin stable INS-1 cell clones were generated.GFP-b2-syntrophin expression and localization pattern were similar to those of the endogenous protein. Electron microscopy showed that in GFP-b2-syntrophin INS-1 cells the number of SGs with a pear-like shape was increased relative to control cells. Insulin content and stimulated secretion were increased in three GFP-â2-syntrophin INS-1 cell clones,compared to non-transfected INS-1 cells and INS-1 cells expressing GFP. These increments correlated with the different expression levels of GFP-b2-syntrophin in the three GFP-b2-syntrophin INS-1 cell clones. These findings support the hypothesis that b2-syntrophin regulates the trafficking and exocytosis of SGs by modulating their tethering to the actin cytoskeleton.In order to confirm the proposed model, the phosphorylation of b2-syntrophin was investigated in more detail. Similar to endogenous b2-syntrophin,GFP-b2-syntrophin underwent Ca2+-dependent and okadaic acid-sensitive dephosphorylation upon stimulation of insulin secretion. Stimulation-dependent dephosphorylation was confirmed by immunoprecipitation of 32P-labeled GFP-b2-syntrophin.Mass spectrometry of immunoprecipitated GFP-b2-syntrophin allowed the identification of four serine-phosphorylation sites (S75,S90,S213,S373) that could affect the binding to ICA512.Mutants,in which all four phosphoserines, were replaced by either asp or ala to mimic(S/D) or prevent(S/A) phosphorylation were expressed in INS-1 cells. All S/D mutants retained a cortical localization,but by immunoblotting the pattern of the S75D allele differed from wild type and all other S/D alleles.Conversely, all S/A alleles were diffused cytosolically, except S213A,which was still restricted to the cortex. Finally, pull down assays showed increased binding of ICA512 to the S75A and S90D alleles compared to wild type b2-syntrophin,while the opposite was observed with the S75D and S90A mutants.Additionally,both the S75 and the S213 allele conform a consensus for phosphorylation by Cdk5,which is known to modulate insulin secretion. The phosphorylation of GFP-b2-syntrophin and particularly the S75 allele by Cdk5 was exhibited with pharmacological inhibitors,by in vitro phosphorylation and by RNAi. Taken together, these findings are consistent with the model by which phosphorylation of b2-syntrophin modulates the tethering of SGs to the cytoskeleton, and thereby their mobility and exocytosis. Specifically, the data of this thesis suggest that Cdk5-dependent phosphorylation of the S75 site of GFP-b2-syntrophin facilitates insulin secretion by reducing the interaction of b2-syntrophin with ICA512,thereby decreasing the actin cytoskeleton constrain on SG mobility. This process could occur in combination with the phosphatase-dependent dephosphorylation of b2-syntrophin at phosphosites other than S75. / Der Transport Insulin-gefüllter sekretorische Granula(SG) ist ein streng kontrollierter komplexer Prozess.Es gibt vermehrt Beweise,dass das kortikale Actinzytoskelett die Ausschüttung der SGs beeinflusst.Bisher ist der Mechanismus der Verankerung von SGs am Zytoskelett noch nicht vollständig aufgeklärt.Ort et al.(2000,2001) haben gezeigt,daß der zytosoplasmatische Teil des trans-membranen SG-Proteins ICA512 mit der PDZ-Domäne von b2-Syntrophin interagiert.Dieses Protein bindet das F-Actin-Bindeprotein Utrophin.Die Ergebnisse zeigen außerdem,daß durch Stimulation der SG-Exozytose der Phosphorilierungsstatus von b2-Syntrophin beeinflusst wird,woraus ein verändertes Bindungsvermögen zu ICA512 resultiert.Es wurde ein Funktionsmodel vorgestellt,in dem sich SGs durch die Interaktion des ICA512/b2-Syntrophin Komplexes an das Actinzytoskelett binden.Dabei wird die Bindedynamik durch Phosphorilierung reguliert.Um dieses Model zu etablieren,wurden stabile GFP-b2-Syntrophin produzierende INS-1-Zellklone erzeugt.Die zelluläre Lokalisation und das Expressionsmuster von GFP-b2-Syntrophin stimmen mit dem des endogenen Proteins überein.Elektronenmikroskopie zeigte eine größe Anzahl oval-verformter SGs in GFP-b2-Syntrophin INS-1-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen.Verglichen mit nicht-transfizierten INS-1 Zellen waren in drei GFP-b2-Syntrophin INS-1-Zellklonen der Insulingehalt der Zellen und die stimulierte Insulinsekretion erhöht.Die Werte korrelierten mit den unterschiedlichen GFP-b2-Syntrophin Expressionsmengen der Klone.Diese Ergebnisse untermauern die Hypothese,daß b2-Syntrophin den Transport und die Sekretion der SGs durch Modulation ihres Bindevermögens an Actin reguliert.Um das postulierte Model genauer zu prüfen,wurde die Phosphorilierung von b2-Syntrophin detaillierter untersucht.Das GFP-Protein wurde,ähnlich dem endogenen b2-Syntrophin,durch Stimulation der Insulinausschüttung dephosphoriliert.Diese Dephosphorilierung ist Ca2+-abhängig und Okadeinsäuresensitiv.Die stimulationsabhängige Dephosphorilierung wurde durch Immunoprezipitation von 32P-markiertem GFP-b2-Syntrophin bestätigt.Massenspektrometrie des präzipitierten Proteins ermöglichte die Identifikation von vier Serin-Phosphorilierungsstellen(S75,S90,S213,S373),welche die Bindung zu ICA512 beeinflussen könnten.Mutanten,in denen die vier Phosphoserine durch Asp beziehungsweise Ala ersetzt wurden,um entweder eine Phosphorilierung(S/D) oder Dephosphorilierung(S/A) nachzuahmen,wurden in INS-1-Zellen exprimiert.Alle S/D Mutanten blieben kortikal lokalisiert.Das Expressionsmuster des S75D Allels unterschied sich jedoch von denen des Wild-Typs(wt).Im Gegensatz dazu waren alle S/A Allele zytosolisch verteilt.Eine Ausnahme bildete S213A,das an der Zellkortex lokalisiert blieb.Im Vergleich zu wt b2-Syntrophin zeigten PullDown-Assays eine erhöhte Bindung von ICA512 zu den S75A und S90D Allelen.Das Gegenteil konnte für die S75D und S90A Mutanten nachgewiesen werden.S75,S90 und S213 sind in einer Konsensussequenz für Cdk5-Phosphorilierung enthalten.Diese Kinase kann die Insulinsekretion regulieren.Die Phosphorilierung von b2-Syntrophin,insbesondere des S75 Allels durch Cdk5 wurde durch pharmakologische Inhibitoren,in vitro-Phosphorilierung und RNAi demonstriert.Zusammenfassend stimmen diese Erkenntnisse mit dem Model überein,daß die Phosphorilierung von b2-Syntrophin die Vernetzung von SGs mit Actin und dadurch deren Mobilität und Exozytose moduliert.Im Speziellen postulieren die Ergebnisse dieser Arbeit eine Cdk5-abhängige Phosphorilierung der S75 Stelle des b2-Syntrophins.Durch eine verminderte Interaktion von b2-Syntrophin und ICA512 erleichtert diese Mutante vermutlich die Insulinsekretion,da der Einfluss des Actinzytoskeletts auf die Granulamobilität vermindert ist.Dieser Prozess ereignet sich möglicherweise in Kombination mit einer Dephosphorilierung des b2-Syntrophins.in Kombination mit einer Dephosphorilierung des b2-Syntrophins.

Chronic hyperlipidemia (lipotoxicity) and hyperglycemia (glucotoxicity) have recently been shown to induce Endoplasmic Reticulum (ER) stress, which may contribute to pancreatic beta-cell dysfunction in type 2 diabetes. This thesis examined the involvement of ER stress in beta-cell lipotoxicity and glucotoxicity. Although chronic treatment with saturated free fatty acids (FFA) in vitro induced ER stress, altering ER stress by increasing or knocking-down GRP78 chaperone expression had no effect on apoptosis induction. Conversely, overexpression of ER chaperones rescued the reduction in proinsulin protein levels caused by chronic exposure to high glucose, although it had no effect on the decreased insulin mRNA levels and proinsulin translation rate. Thus, ER stress is likely not the main mechanism involved in saturated FFA-induced beta-cell apoptosis in vitro, but it may contribute to glucotoxic effects on proinsulin levels. These findings have increased our understanding of the link between ER stress and beta-cell dysfunction in type 2 diabetes.