A via de amplificação da secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) é um fenômeno discutido na literatura, cujos componentes são amplamente debatidos. Evidências sugerem que a condutância a Cl- compõe parte desta via. Porém, o mecanismo pelo qual essa condutância desempenharia papel na via de amplificação ainda é debatido, e, além disso, as ferramentas farmacológicas para estudo dessas afeta o transporte de outros ânions, como bicarbonato (HCO3-). Buscamos neste trabalho compreender a contribuição do transporte desses ânions para a via de amplificação da GSIS levando em consideração a distribuição de Cl- e HCO3- extracelular em células INS-1E. Concluímos que o transporte de ânions nas células INS-1E não contribui para a via de amplificação da GSIS, porém essas células não expressaram os canais CFTR e Anoctamina 1 que foram relacionados com esse fenômeno. Acreditamos que em células secretoras de insulina que expressem esses canais, o transporte de ânions possua alguma relevância funcional. / The amplification pathway of glucose stimulated insulin secretion (GSIS) is a phenomenon discussed in the literature, which components are broadly debated. Evidence suggests that Cl- conductance composes part of this pathway. However, the mechanism that this conductance would play role on the amplification pathway still is debated, and, besides that, the pharmacological tools to study these affects transport of other anions, such as bicarbonate (HCO3-). We aimed in this study to understand the contribuition of anion transport for the amplification of GSIS considering the Cl- and HCO3- extracellular distribuition in INS-1E cells. We concluded that anion transport in INS-1E cell line do not contribute for the amplification pathway of GSIS, however those cells do not express CFTR and Anoctamin 1 channels which were related with this phenomenon. We believe that in insulin secretin cells that express those channels, the anion transport may have a functional relevance.

A via de amplificação da secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) é um fenômeno discutido na literatura, cujos componentes são amplamente debatidos. Evidências sugerem que a condutância a Cl- compõe parte desta via. Porém, o mecanismo pelo qual essa condutância desempenharia papel na via de amplificação ainda é debatido, e, além disso, as ferramentas farmacológicas para estudo dessas afeta o transporte de outros ânions, como bicarbonato (HCO3-). Buscamos neste trabalho compreender a contribuição do transporte desses ânions para a via de amplificação da GSIS levando em consideração a distribuição de Cl- e HCO3- extracelular em células INS-1E. Concluímos que o transporte de ânions nas células INS-1E não contribui para a via de amplificação da GSIS, porém essas células não expressaram os canais CFTR e Anoctamina 1 que foram relacionados com esse fenômeno. Acreditamos que em células secretoras de insulina que expressem esses canais, o transporte de ânions possua alguma relevância funcional. / The amplification pathway of glucose stimulated insulin secretion (GSIS) is a phenomenon discussed in the literature, which components are broadly debated. Evidence suggests that Cl- conductance composes part of this pathway. However, the mechanism that this conductance would play role on the amplification pathway still is debated, and, besides that, the pharmacological tools to study these affects transport of other anions, such as bicarbonate (HCO3-). We aimed in this study to understand the contribuition of anion transport for the amplification of GSIS considering the Cl- and HCO3- extracellular distribuition in INS-1E cells. We concluded that anion transport in INS-1E cell line do not contribute for the amplification pathway of GSIS, however those cells do not express CFTR and Anoctamin 1 channels which were related with this phenomenon. We believe that in insulin secretin cells that express those channels, the anion transport may have a functional relevance.

PROX1 étant un facteur de susceptibilité au diabète de type 2 (DT2), nousavons réalisé des études génétiques et moléculaires afin de comprendre son rôledans l’étiologie du DT2.Nous avons analysé l’impact de 80 SNPs de PROX1 sur des phénotypescliniques associés au DT2 dans l’étude HELENA (n=1155 adolescents) et montréque trois SNPs (rs340838, rs340837 et rs340836) sont associés à l’insulinémie àjeun. Nous avons évalué la fonctionnalité de 9 SNPs (les 3 SNPs associés et 6 SNPsen déséquilibre de liaison) en utilisant un gène rapporteur Luciférase dans descellules HepG2 et MIN6. Les allèles associés à la diminution de l’insulinémie desSNPs rs340874, rs340873 et rs340835 sont associés à une diminution del’expression du gène rapporteur Luciférase, suggérant que l’expression de PROX1est diminuée chez les individus porteurs des allèles à risque.Nous avons aussi montré que l’inhibition de l’expression de Prox1 par siRNAsdans les cellules INS-1E engendrait une diminution de 1,7 fois de la sécrétiond’insuline en réponse au glucose et qu’une concentration élevée en glucose modulaitpositivement l’expression de la protéine Prox1.Des analyses transcriptomiques réalisées dans les cellules INS-1E ont permisde montrer que certains des gènes cibles de PROX1 dans les cellules bêta sont desgènes impliqués dans des voies de sécrétion d’insuline.Enfin, nous avons également observé que l’agoniste de PPARgamma, latroglitazone, diminuait l’expression de Prox1 dans les cellules INS-1E.Ces résultats suggèrent qu’une altération de l’expression de Prox1 par desvariants cis-régulateurs pourrait conduire à une sécrétion d’insuline en réponse auglucose altérée des cellules bêta, conférant ainsi une susceptibilité au DT2. / As PROX1 is a susceptibility factor for type 2 diabetes (T2D), we conductedgenetic and molecular studies to better understand the role of PROX1 in the etiology of T2D. We assessed the impact of 80 PROX1 SNPs on T2D-related biochemical traits in the HELENA study (n=1155 adolescents) and showed that 3 SNPs (rs340838, rs340837 and rs340836) were significantly associated with fasting plasma insulin levels. We evaluated the functional impact of 9 SNPs (the 3 insulin-associated SNPs plus 6 SNPs in linkage disequilibrium) using a Luciferase reporter gene expression in HepG2 and MIN6 cells. The insulin-lowering alleles of the rs340874, rs340873 and rs340835 SNPs were associated with lower Luciferase gene expression, suggesting that PROX1 expression may be lower in individuals carrying the insulin-lowering alleles. We also showed that the knock-down of Prox1 expression by siRNA in INS-1E cells resulted in a 1.7 fold reduced glucose-stimulated insulin secretion and that high concentrations of glucose positively modulated Prox1 protein expression. Then, microarray analyses performed in INS-1E cells showed that some PROX1 target genes in the _cells are implicated in insulin secretion pathways. Finally, we observed that the PPARgamma agonist, the troglitazone, decreased Prox1 expression in INS-1E cells. Altogether, these results suggest that an altered expression of Prox1 bys cisregulators variants results in an altered -cell glucose-stimulated insulin secretion andthereby confers susceptibility to T2D.

Die Mitglieder der Insulinrezeptorfamilie spielen eine wichtige Rolle in der Funktion von Zellen. Die Hauptangriffspunkte liegen hierbei im Bereich der Glucosehomöostase, sowie weiterhin bei der Proteinbiosynthese, dem Fettstoffwechsel, Elektrolyttransport, Zellwachstum, Differenzierung und Apoptose. Die beiden Hauptvertreter der Insulinrezeptorfamilie, Insulinrezeptor (InsR) und Insulin-like Growth Factor 1 Rezeptor (IGF1R) sind am besten untersucht und viele ihrer Funktionen aufgeklärt. Ein weiteres Mitglied der Familie stellt hier noch eine Ausnahme dar, der Insulin receptor-related receptor (IRR). Obwohl er hohe Sequenzhomologien zum InsR und IGF1R aufweist und in Untersuchungen gezeigt werden konnte, dass er die Möglichkeit besitzt wichtige Punkte der Insulinsignalkaskade zu aktivieren, bleibt seine Funktion unverstanden. Auch ein Ligand wurde bisher nicht identifiziert. Untersuchungen an aktivierbaren IRR-Rezeptorkonstrukten zeigten einen möglichen Einfluss auf Differenzierung, Proliferation und Apoptose von Zellen. Der IRR wird gewebespezifisch exprimiert und v.a. in neuronalen Zellen und β-Zellen des Pankreas nachgewiesen. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde der mögliche Einfluss eines stimulierbaren IRR-Rezeptorkonstruktes auf die Proliferation und Apoptose von β-Zellen untersucht. Weiterhin wurde ermittelt, in wie fern dabei zwei Hauptsignalwege der Insulinrezeptorkaskade, der AKT/PKB und der MAPK/ERK Signalweg, aktiviert werden. Hierzu wurde ein bereits beschriebenes Colony stimulating factor 1 receptor/Insulin receptor-related receptor- (CSF1R/IRR-) Konstrukt (Dandekar et al.1998) in INS-1E Zellen überexprimiert und anschließend mit Macrophage colony stimulating factor (MCSF), dem Liganden des CSF1R, stimuliert. Dieses CSF1R/IRR-Konstrukt besteht aus dem extrazellulären Teil des CSF1R, der Transmembrandomäne des InsR und dem intrazellulären Teil des IRR. Es zeigte sich, dass das Konstrukt zu einer transienten Aktivierung des ERK-Signalweges fähig ist, ein Einfluss auf den AKT-Weg allerdings ausblieb. Ferner konnte kein Einfluss auf Proliferation oder Apoptose gezeigt werden. Dies lässt vermuten, dass die mögliche Funktion über alternative Wege verwirklicht wird, wie z.Bsp. eine Hybridrezeptorbildung zwischen IRR und IGF1R. Die angefertigte Arbeit liefert somit einen weiteren Beitrag zum Verständnis der Rolle des IRR in der Zelle.

Zahlreiche genomweite Assoziationsstudien konnten CDK5 regulatory subunit associated protein 1-like 1 (CDKAL1) als ein Suszeptibilitätsgen für Diabetes mellitus Typ 2 identifizieren. Da die Funktion des Gens noch nicht gänzlich bekannt ist, wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von CDKAL1 auf die endokrine Funktion pankreatischer Betazellen untersucht. Dazu wurde in einem Zellkulturmodell mit Ratten-Insulinomzellen (INS-1E), welche zur glukoseabhängigen Insulinausschüttung befähigt sind, CDKAL1 mRNA mittels RNA-Interferenz supprimiert und anschließend eine quantitative Messung des intra- und extrazellulären Insulinproteins und der Insulin mRNA vorgenommen, um eine Aussage über die Sekretion und Expression von Insulin treffen zu können. Die dabei gewonnenen Resultate zeigten, dass CDKAL1 bei Insulinomzellen keinen Einfluss auf die Insulintranskription hat.

Die Mitglieder der Insulinrezeptorfamilie spielen eine wichtige Rolle in der Funktion von Zellen. Die Hauptangriffspunkte liegen hierbei im Bereich der Glucosehomöostase, sowie weiterhin bei der Proteinbiosynthese, dem Fettstoffwechsel, Elektrolyttransport, Zellwachstum, Differenzierung und Apoptose. Die beiden Hauptvertreter der Insulinrezeptorfamilie, Insulinrezeptor (InsR) und Insulin-like Growth Factor 1 Rezeptor (IGF1R) sind am besten untersucht und viele ihrer Funktionen aufgeklärt. Ein weiteres Mitglied der Familie stellt hier noch eine Ausnahme dar, der Insulin receptor-related receptor (IRR). Obwohl er hohe Sequenzhomologien zum InsR und IGF1R aufweist und in Untersuchungen gezeigt werden konnte, dass er die Möglichkeit besitzt wichtige Punkte der Insulinsignalkaskade zu aktivieren, bleibt seine Funktion unverstanden. Auch ein Ligand wurde bisher nicht identifiziert. Untersuchungen an aktivierbaren IRR-Rezeptorkonstrukten zeigten einen möglichen Einfluss auf Differenzierung, Proliferation und Apoptose von Zellen. Der IRR wird gewebespezifisch exprimiert und v.a. in neuronalen Zellen und β-Zellen des Pankreas nachgewiesen. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde der mögliche Einfluss eines stimulierbaren IRR-Rezeptorkonstruktes auf die Proliferation und Apoptose von β-Zellen untersucht. Weiterhin wurde ermittelt, in wie fern dabei zwei Hauptsignalwege der Insulinrezeptorkaskade, der AKT/PKB und der MAPK/ERK Signalweg, aktiviert werden. Hierzu wurde ein bereits beschriebenes Colony stimulating factor 1 receptor/Insulin receptor-related receptor- (CSF1R/IRR-) Konstrukt (Dandekar et al.1998) in INS-1E Zellen überexprimiert und anschließend mit Macrophage colony stimulating factor (MCSF), dem Liganden des CSF1R, stimuliert. Dieses CSF1R/IRR-Konstrukt besteht aus dem extrazellulären Teil des CSF1R, der Transmembrandomäne des InsR und dem intrazellulären Teil des IRR. Es zeigte sich, dass das Konstrukt zu einer transienten Aktivierung des ERK-Signalweges fähig ist, ein Einfluss auf den AKT-Weg allerdings ausblieb. Ferner konnte kein Einfluss auf Proliferation oder Apoptose gezeigt werden. Dies lässt vermuten, dass die mögliche Funktion über alternative Wege verwirklicht wird, wie z.Bsp. eine Hybridrezeptorbildung zwischen IRR und IGF1R. Die angefertigte Arbeit liefert somit einen weiteren Beitrag zum Verständnis der Rolle des IRR in der Zelle.:Bibliographische Beschreibung I. Abkürzungen i 1. Einleitung 1 1.1. Beschreibung von Rezeptor Tyrosin Kinasen 1 1.2. Die Insulinsignalkaskade 2 1.2.1. Der Rezeptor und die Insulinrezeptorsubstrate 3 1.2.2. Die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) 3 1.2.3. Die Proteinkinase B/AKT 4 1.2.4. Der MAPK/ERK Signalweg 5 1.3. Der Insulin-receptor related receptor 6 1.3.1. Vorkommen 7 1.3.2. Mögliche Funktionen 8 2. Das Promotionsprojekt 10 2.1. Hintergrund und Fragestellung 10 2.2. Methoden 11 2.3. Ergebnisse 12 3. Publikation – Druckversion 15 4. Zusammenfassung und Diskussion 25 5. Literatur 28 II. Erklärung über die Eigenständigkeit der Arbeit iv III. Lebenslauf v IV. Danksagung vi

PROX1 étant un facteur de susceptibilité au diabète de type 2 (DT2), nousavons réalisé des études génétiques et moléculaires afin de comprendre son rôledans l'étiologie du DT2.Nous avons analysé l'impact de 80 SNPs de PROX1 sur des phénotypescliniques associés au DT2 dans l'étude HELENA (n=1155 adolescents) et montréque trois SNPs (rs340838, rs340837 et rs340836) sont associés à l'insulinémie àjeun. Nous avons évalué la fonctionnalité de 9 SNPs (les 3 SNPs associés et 6 SNPsen déséquilibre de liaison) en utilisant un gène rapporteur Luciférase dans descellules HepG2 et MIN6. Les allèles associés à la diminution de l'insulinémie desSNPs rs340874, rs340873 et rs340835 sont associés à une diminution del'expression du gène rapporteur Luciférase, suggérant que l'expression de PROX1est diminuée chez les individus porteurs des allèles à risque.Nous avons aussi montré que l'inhibition de l'expression de Prox1 par siRNAsdans les cellules INS-1E engendrait une diminution de 1,7 fois de la sécrétiond'insuline en réponse au glucose et qu'une concentration élevée en glucose modulaitpositivement l'expression de la protéine Prox1.Des analyses transcriptomiques réalisées dans les cellules INS-1E ont permisde montrer que certains des gènes cibles de PROX1 dans les cellules bêta sont desgènes impliqués dans des voies de sécrétion d'insuline.Enfin, nous avons également observé que l'agoniste de PPARgamma, latroglitazone, diminuait l'expression de Prox1 dans les cellules INS-1E.Ces résultats suggèrent qu'une altération de l'expression de Prox1 par desvariants cis-régulateurs pourrait conduire à une sécrétion d'insuline en réponse auglucose altérée des cellules bêta, conférant ainsi une susceptibilité au DT2.

<p><b>Background and aims:</b> Type 2 diabetes mellitus is connected with elevated glucose levels, which cause impaired glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) and degeneration of β-cells. Mechanisms for such glucotoxic effects were explored in the present study.</p><p><b>Materials and methods:</b> INS-1E cells were cultured for 5 days in 5.5, 11, 20 or 27 mM glucose in the presence or absence of AMPK-agonist AICAR. GSIS was determined from INS-1E cells and islets obtained from type 2 diabetes and control donors. Human islets and INS-1E cells were functionally characterized (GSIS) and protein profiled (SELDI-TOF MS). Glucose-induced <i>de novo</i> synthesis of fatty acyls (HR-MAS NMR spectroscopy), fatty acid composition (GC-MS), triglyceride content and specific proteins (Western blotting) were determined in INS-1E cells.</p><p><b>Results:</b> Impaired GSIS was observed from INS-1E cells exposed to chronic hyperglycaemia and islets isolated from type 2 diabetics compared to INS-1E cells cultured at normal glucose levels and control islets, respectively. Several glucose-regulated proteins were found when type 2 diabetes and control islets or mitochondria from INS-1E cells cultured at different glucose concentrations were protein profiled. Glucose induced lipid <i>de novo</i> synthesis of both saturated and unsaturated fatty acids in specific proportions. Glucose-induced impairment of function and mass was reverted by inclusion of AICAR, which lowered levels of pro-apoptotic protein CHOP but left triglyceride content unaffected.</p><p><b>Conclusions:</b> Impaired GSIS and increased apoptosis observed in β-cells after prolonged exposure to elevated glucose concentrations involved accumulation of lipid species in specific proportions, AMPK-inactivation, ER-stress activation and complex, coordinated changes in expression patterns of mitochondrial and human islet proteins.</p>

<b>Background and aims:</b> Type 2 diabetes mellitus is connected with elevated glucose levels, which cause impaired glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) and degeneration of β-cells. Mechanisms for such glucotoxic effects were explored in the present study. <b>Materials and methods:</b> INS-1E cells were cultured for 5 days in 5.5, 11, 20 or 27 mM glucose in the presence or absence of AMPK-agonist AICAR. GSIS was determined from INS-1E cells and islets obtained from type 2 diabetes and control donors. Human islets and INS-1E cells were functionally characterized (GSIS) and protein profiled (SELDI-TOF MS). Glucose-induced de novo synthesis of fatty acyls (HR-MAS NMR spectroscopy), fatty acid composition (GC-MS), triglyceride content and specific proteins (Western blotting) were determined in INS-1E cells. <b>Results:</b> Impaired GSIS was observed from INS-1E cells exposed to chronic hyperglycaemia and islets isolated from type 2 diabetics compared to INS-1E cells cultured at normal glucose levels and control islets, respectively. Several glucose-regulated proteins were found when type 2 diabetes and control islets or mitochondria from INS-1E cells cultured at different glucose concentrations were protein profiled. Glucose induced lipid de novo synthesis of both saturated and unsaturated fatty acids in specific proportions. Glucose-induced impairment of function and mass was reverted by inclusion of AICAR, which lowered levels of pro-apoptotic protein CHOP but left triglyceride content unaffected. <b>Conclusions:</b> Impaired GSIS and increased apoptosis observed in β-cells after prolonged exposure to elevated glucose concentrations involved accumulation of lipid species in specific proportions, AMPK-inactivation, ER-stress activation and complex, coordinated changes in expression patterns of mitochondrial and human islet proteins.