Purpose To evaluate the effectiveness and safety of Selective Laser Trabeculoplasty (SLT) with the SLT mode of the VISULAS ® green laser in patients with primary open-angle glaucoma (POAG). Methods This prospective, interventional multicenter clinical investigation included patients with POAG who either needed a treatment escalation because the individual intraocular pressure (IOP) target was not met or treatment initiation and had an IOP ≥ 17 mmHg at baseline in the study eye. The study was conducted in five research centers across Germany. Approximately 100 laser applications were delivered to 360° of the trabecular meshwork. Glaucoma medications were not modified during the 3-month follow-up to allow evaluation of the sole effect of VISULAS ® green with SLT. Efficacy outcomes were postoperatively absolute and relative IOP changes at 1 and 3 months. Safety outcomes analyzed the rate of intra- and postoperative adverse events. Results Thirty-four eyes of 34 POAG patients were included. The overall mean number of preoperative glaucoma medications was 2.2 ± 1.4 in 29 treated eyes, 5 eyes were treatment naïve. Mean baseline IOP (mmHg) was 21.0 ± 2.69 and was reduced by − 3.53 ± 3.34 [95% CI − 4.61; − 2.45] and − 3.59 ± 3.41 [95% CI − 4.64; − 2.53] at the 1- and 3-month follow-up, respectively (p < 0.0001), with 48.5% of cases achieving a ≥ 20% IOP reduction at 3 months [95% CI = 30.8%; 66.5%]. The mean relative IOP reduction was − 16.4% and − 16.3% at 1 and 3 months, respectively (p < 0.0001). Potentially device- or procedure-related adverse events were mild to moderate and included 3 postoperative IOP-spikes and 6 reports regarding eye pain and discomfort. All were resolved without sequelae. Conclusions SLT performed with the VISULAS ® green laser achieved clinically significant additional IOP reductions in medically treated as well as in treatment naïve eyes with POAG and there were no relevant safety issues. The results are comparable to other reported SLT studies.

Krebserkrankungen stellen in Deutschland die zweithäufigste Todesursache dar und die Anzahl der Neuerkrankungen nimmt stetig zu. Frühzeitige Diagnosen und Therapiemöglichkeiten sind daher dringend erforderlich. Cyklinabhängige Proteinkinasen (Cdk) spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Zellzyklus. Viele Tumore zeigen eine deregulierte Cdk4‑Aktivität und/oder ‑Expression. Insgesamt zeigen ca. 80% aller Tumore eine Fehlregulation der für den Zellzyklus zentralen Cdk4/CykD1/INK4/pRb/E2F Signalkaskade. Somit besitzen Cdks ein enormes therapeutisches Potential im Kampf gegen Krebs. Die spezifische Inhibierung der Cdks verhindert die Zellproliferation und damit das Tumorwachstum. In den letzten Jahren wurden verschiedenste Strukturklassen vorgestellt, die als Cdk4-Inhibitor wirken. Im Rahmen der Promotion sollen die Möglichkeiten einer funktionellen Tumordiagnose mittels cyklinabhängiger Kinasen untersucht werden. Die Entwicklung von radioaktiv markierten Inhibitoren der Cdk4/6 als Radiotracer und ihre radiopharmakologische Charakterisierung stellt dabei einen neuen Ansatz dar. Um die Rolle der Cdk4/6 im Zellzyklus von gesunden und deregulierten (z.B. Tumor-) Zellen aufzuklären, sollten mit Iod-124 und Fluor-18 markierte Inhibitoren eingesetzt werden, die hochselektiv diese Cdks blockieren. Zunächst wurden verschiedene Inhibitoren der Cdk4/6 und deren Vorstufen für die Radiomarkierung dargestellt. Die bereits aus den Vorarbeiten von VanderWel et al., 2005 und Toogood et al., 2001 bekannten Syntheserouten mussten dazu optimiert werden und für neue Verbindungen, wie die fluorethylierten Substanzen, wurden neue Reaktionswege gefunden. Die dargestellten Referenzverbindungen CKIA-E wurden anschließend mittels Durchflusszytometrie an den Zelllinien HT-29 und FaDu auf ihre inhibitorischen Wirkung untersucht. Die Untersuchungen der Verbindungen CKIA/B/E zeigte, dass ein Zellzyklusarrest unter Einwirkung der Inhibitoren erreichbar ist. Die weiteren Untersuchungen zur Radiomarkierbarkeit sowie die radiopharmakologische Evaluation sollten daher an den Verbindungen CKIA, CKIB und CKIE stattfinden. Die Darstellung der Verbindungen [124I]CKIA und [124I]CKIB erfolgte in zwei Schritten über die elektrophile Substitution durch regioselektive Destannylierung mit anschließender Entschützung der Seitenkette. Die Darstellung der fluorethylierten Verbindung erfolgte ebenfalls über eine Zweischrittsynthese beginnend mit der Synthese der prosthetischen Gruppe [18F]BFE aus der Tosylmarkierungsvorstufe. Die zur Markierung des sekundären Amins zur Auswahl stehenden prosthetischen Gruppen [18F]Fluorethyltosylat ([18F]FETos) und [18F]Bromfluorethan ([18F]BFE) wurden auf ihre Eignung untersucht, ebenso wie die Auswahl einer geeigneten Markierungsvorstufe für die Darstellung der prosthetischen Gruppe. Die optimierten Syntheserouten ermöglichten die Isolierung von ausreichenden Mengen an Produktaktivität für die radiopharmakologischen Untersuchungen. Es fanden, neben der Bestimmung der spezifischen Aktivität und der Lipophilie der Verbindungen, Zellaufnahmeuntersuchungen und Bestimmungen zur Stabilität der Verbindungen in vitro, ex vivo und in vivo statt. Die radioiodierten Verbindungen konnten des Weiteren zur Untersuchungen der Bioverteilung in normalen männlichen Wistar-Ratten eingesetzt werden. Für alle drei Verbindungen konnte eine sehr hohe in vitro-Stabilität festgestellt werden. Die Zellaufnahmeuntersuchungen zeigten vor allem für die Verbindungen [124I]CKIA und [124I]CKIB eine beträchtliche Zellaufnahme von über 1000% ID/mg Protein nach 2 h. Die Zellaufnahme der Verbindung CKIE ist geringer, sollte allerdings für eine in vivo-Anwendung ausreichend sein. Die Untersuchung der in vivo‑Stabilität der Verbindungen [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE im Blut von Wistar Ratten ergab allerdings, dass alle Verbindungen schnell metabolisiert werden. Die Untersuchung der Bioverteilung der radioiodierten Verbindungen belegen eine in vivo Radiodeiodierung sowie eine hohe hepatobliliäre Auscheidungsrate. Im Hinblick auf eine Anwendung als Radiotracer konnten im Rahmen dieser Arbeit neue Erkenntnisse gewonnen werden. Die dargestellten Inhibitoren sind in der Lage am Zellmodell den Zellzyklusarrest in der G1-Phase zu induzieren. Eine Radiomarkierung der ausgewählten Strukturen liefert das Produkt mit reproduzierbarer Ausbeute in hoher radiochemischer Reinheit und ausreichender spezifischer Aktivität, allerdings ist eine Herstellung der fluorethylierten Verbindung unter GMP-Bedingungen nur schwer realisierbar. Die radiomarkierten Verbindungen zeigen eine hohe in vitro-Stabilität und werden energieabhängig in die Zelle aufgenommen. Anhand der Stabilitätsuntersuchungen in vivo wurde gezeigt, dass alle drei Verbindungen in vivo instabil sind und sehr schnell hepatobiliär eliminiert.

Die Cyclin-abhängigen Kinasen 4 und 6 (Cdk4/6) wurden als essentielle Enzyme für die Regulation des Zellzyklus mit kritischem Beitrag zur gestörten Zellproliferation während der Kanzerogenese identifiziert. Als Konsequenz davon erwiesen sich die Cdk4/6 als attraktive Zielproteine für die Entwicklung neuer therapeutischer Konzepte zur pharmakologischen Tumorbehandlung. Verbindungen aus der Substanzklasse der Pyrido[2,3-d]pyrimidine zeigten vielversprechende inhibitorische Wirkungen auf die Aktivität der Cdk4/6 bei gleichzeitiger herausragender Selektivität gegenüber anderen Cdk. Anschließende Untersuchungen in vitro und in vivo verdeutlichten das Potential einiger Pyrido[2,3 d]pyrimidine zur Inhibierung des Tumorzellwachstums. Die Weiterentwicklung und Nutzung selektiver Cdk4/6-Inhibitoren zur funktionellen Charakterisierung der Cdk4/6 in Tumoren in vivo mit Hilfe der nicht-invasiven Bildgebungstechnik Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ist ein neuer vielversprechender Forschungsansatz und von großem Interesse für die Evaluierung neuer Strategien zur Diagnose und Therapie maligner Erkrankungen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die biochemische und radiopharmakologische Charakterisierung neuer potentieller Cdk4/6-Inhibitoren aus der Verbindungsklasse der Pyrido[2,3-d]pyrimidine und deren Bewertung hinsichtlich ihrer therapeutischen Wirksamkeit zur gezielten Cdk4/6-Inhibierung in ausgewählten Tumorzelllinien sowie ihres Potentials zur funktionellen Bildgebung der Cdk4/6 in Tumoren mittels PET am Tiermodell. Die biochemische Charakterisierung der Pyrido[2,3 d]pyrimidine CKIA, CKIB, CKIC, CKID und CKIE hinsichtlich ihrer zellulären und molekularen Wirkung erfolgte in den kontinuierlich proliferierenden humanen Tumorzelllinien HT-29, FaDu und THP 1 und in differenzierten THP-1-Makrophagen. Die Zweckmäßigkeit der untersuchten Zelllinien zur Charakterisierung potentieller Cdk4/6-Inhibitoren wurde anhand von Studien zur mRNA-Expression und Proteinbiosynthese der Kinasen Cdk4/6 nachgewiesen. Des Weiteren wurde das Vorkommen der Cdk4/6 in den humanen Xenograft-Tumoren HT-29 und FaDu, sowie in ausgewählten Organen und Geweben von nu/nu-NMRI-Mäusen charakterisiert. In vitro wurden für alle untersuchten Pyrido[2,3-d]pyrimidine signifikante, konzentrations- und zeitabhängige inhibitorische Effekte auf die Tumorzellproliferation beobachtet. Durchflusszytometrische Zellzyklusanalysen 24 Stunden nach Inkubation mit den Pyrido[2,3 d]pyrimidinen zeigten eine konzentrationsabhängige Zunahme des Anteils der HT-29-, FaDu- und THP-1-Zellen in der G1-Phase bis auf 90%. Für die nicht-proliferierenden THP 1-Makrophagen wurden bei Inkubation mit den Pyrido[2,3 d]pyrimidinen geringe Veränderungen ihrer Zellzahl und Zellzyklusphasen-verteilung detektiert. Die zellulären Studien identifizierten deutliche qualitative und quantitative Unterschiede der untersuchten Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Derivate. Nanomolare Konzentrationen von CKIA, CKIB bzw. CKIE erzielten bereits 24 Stunden nach Inkubation deutliche Effekte, während für CKIC und CKID die 10- bis 100-fache Konzentration eingesetzt werden musste, um eine ähnliche Wirkung zu erhalten. Die molekularen Ursachen der Wachstumshemmung und des Zellzyklusarrests wurden durch Untersuchungen zur Pyrido[2,3 d]pyrimidin-abhängigen Beeinflussung des Cdk4/6-Cyclin D-Retinoblastom-E2F-Signalwegs geklärt. In allen Zelllinien wurde eine deutliche Inhibierung der Cdk4/6-spezifischen Phosphorylierung der Aminosäure Serin-780 des Retinoblastom-Proteins (pRb) beobachtet. Als Konsequenz dieser Inhibierung wurde für CKIA, CKIB und CKIE die signifikante konzentrationsabhängige Unterbrechung der Genexpression von E2F-1 und PCNA nachgewiesen. Die Radiomarkierung der Cdk4/6-Inhibitoren CKIA und CKIB mit 124I bzw. von CKIE mit 18F ermöglichte erstmals die Charakterisierung von in vivo-Interaktionen und des Metabolismus im Blut zirkulierender Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Derivate. Die radiopharmako-logischen Eigenschaften von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE wurden in Untersuchungen zur zellulären Radiotracer-Aufnahme, der metabolischen Stabilität und der Bioverteilung bei Ratten sowie abschließend in Kleintier-PET-Untersuchungen bei FaDu-Tumor-tragenden nu/nu-NMRI-Mäusen analysiert. In vitro-Experimente mit [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE verdeutlichten eine hohe Stabilität und schnelle Aufnahme der Radiotracer in humane Tumorzellen bei 37°C. Allerdings deutet die Zelltyp-unabhängige Anreicherung auf eine geringe Abhängigkeit der Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Akkumulation vom Cdk4/6-Status der Zellen hin. Die signifikant geringeren Aufnahmewerte aller untersuchten Pyrido[2,3-d]pyrimidine bei 4°C und die Blockierung der Aufnahme von [18F]CKIE mit nichtradioaktivem CKIE unterstützen die Vermutung spezifischer Transportmechanismen für die Aufnahme der Pyrido[2,3 d]pyrimidine. Untersuchungen von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE in vivo identifizierten eine schnelle, innerhalb weniger Minuten stattfindende Eliminierung aus dem Blut und die primäre Aufnahme in die Leber als grundlegende Stoffwechseleigenschaft aller drei Radiotracer. Aus den PET-Untersuchungen mit [124I]CKIA und [124I]CKIB bei FaDu-Tumor-tragenden Mäusen wurden nur marginale Anreicherungen der radioaktiven Substanzen im Bereich des Tumors festgestellt. Für [18F]CKIE wurde eine Akkumulation im proliferierenden Randbereich des Tumors beobachtet. Die schnelle Metabolisierung von [18F]CKIE im Blut sowie das konstante, geringe Verhältnis der Aktivität im Tumor zur Aktivität im Skelettmuskel wiesen allerdings auf eine unspezifische Anreicherung hin. Schlussfolgernd aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit wurde die Effektivität der Pyrido[2,3 d]pyrimidine CKIA, CKIB und CKIE hinsichtlich der Inhibierung der Cdk4/6-vermittelten Zellzyklusprogression gezeigt. Die antiproliferative Aktivität der Substanzen unterstützt eine weiterführende Evaluierung dieser Cdk4/6-Inhibitoren zur pharmakologischen Tumortherapie. Auf der Basis der erhaltenen radiopharmakologischen Ergebnisse werden die kurze biologische Halbwertszeit und unspezifische Tumoranreicherung von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE als limitierende Faktoren für die Eignung dieser Verbindungen als Radiotracer zur nicht-invasiven Bildgebung der Cdk4/6 im Zielgewebe mittels PET angesehen. Es bleibt zu klären, ob eine längere Verweildauer und höhere Stabilität radiomarkierter Pyrido[2,3-d]pyrimidine im Blut die Chance der Cdk4/6-spezifischen Gewebeanreicherung erhöhen oder Transport-mechanistische Effekte allein ausschlaggebend für die Anreicherung in Zellen und Geweben sind. Die Untersuchung optimierter Cdk4/6-selektiver Inhibitoren für die Charakterisierung und Therapie von Tumoren bleibt weiterhin ein interessanter Aspekt in der Tumorforschung.

Krebserkrankungen stellen in Deutschland die zweithäufigste Todesursache dar und die Anzahl der Neuerkrankungen nimmt stetig zu. Frühzeitige Diagnosen und Therapiemöglichkeiten sind daher dringend erforderlich. Cyklinabhängige Proteinkinasen (Cdk) spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Zellzyklus. Viele Tumore zeigen eine deregulierte Cdk4‑Aktivität und/oder ‑Expression. Insgesamt zeigen ca. 80% aller Tumore eine Fehlregulation der für den Zellzyklus zentralen Cdk4/CykD1/INK4/pRb/E2F Signalkaskade. Somit besitzen Cdks ein enormes therapeutisches Potential im Kampf gegen Krebs. Die spezifische Inhibierung der Cdks verhindert die Zellproliferation und damit das Tumorwachstum. In den letzten Jahren wurden verschiedenste Strukturklassen vorgestellt, die als Cdk4-Inhibitor wirken. Im Rahmen der Promotion sollen die Möglichkeiten einer funktionellen Tumordiagnose mittels cyklinabhängiger Kinasen untersucht werden. Die Entwicklung von radioaktiv markierten Inhibitoren der Cdk4/6 als Radiotracer und ihre radiopharmakologische Charakterisierung stellt dabei einen neuen Ansatz dar. Um die Rolle der Cdk4/6 im Zellzyklus von gesunden und deregulierten (z.B. Tumor-) Zellen aufzuklären, sollten mit Iod-124 und Fluor-18 markierte Inhibitoren eingesetzt werden, die hochselektiv diese Cdks blockieren. Zunächst wurden verschiedene Inhibitoren der Cdk4/6 und deren Vorstufen für die Radiomarkierung dargestellt. Die bereits aus den Vorarbeiten von VanderWel et al., 2005 und Toogood et al., 2001 bekannten Syntheserouten mussten dazu optimiert werden und für neue Verbindungen, wie die fluorethylierten Substanzen, wurden neue Reaktionswege gefunden. Die dargestellten Referenzverbindungen CKIA-E wurden anschließend mittels Durchflusszytometrie an den Zelllinien HT-29 und FaDu auf ihre inhibitorischen Wirkung untersucht. Die Untersuchungen der Verbindungen CKIA/B/E zeigte, dass ein Zellzyklusarrest unter Einwirkung der Inhibitoren erreichbar ist. Die weiteren Untersuchungen zur Radiomarkierbarkeit sowie die radiopharmakologische Evaluation sollten daher an den Verbindungen CKIA, CKIB und CKIE stattfinden. Die Darstellung der Verbindungen [124I]CKIA und [124I]CKIB erfolgte in zwei Schritten über die elektrophile Substitution durch regioselektive Destannylierung mit anschließender Entschützung der Seitenkette. Die Darstellung der fluorethylierten Verbindung erfolgte ebenfalls über eine Zweischrittsynthese beginnend mit der Synthese der prosthetischen Gruppe [18F]BFE aus der Tosylmarkierungsvorstufe. Die zur Markierung des sekundären Amins zur Auswahl stehenden prosthetischen Gruppen [18F]Fluorethyltosylat ([18F]FETos) und [18F]Bromfluorethan ([18F]BFE) wurden auf ihre Eignung untersucht, ebenso wie die Auswahl einer geeigneten Markierungsvorstufe für die Darstellung der prosthetischen Gruppe. Die optimierten Syntheserouten ermöglichten die Isolierung von ausreichenden Mengen an Produktaktivität für die radiopharmakologischen Untersuchungen. Es fanden, neben der Bestimmung der spezifischen Aktivität und der Lipophilie der Verbindungen, Zellaufnahmeuntersuchungen und Bestimmungen zur Stabilität der Verbindungen in vitro, ex vivo und in vivo statt. Die radioiodierten Verbindungen konnten des Weiteren zur Untersuchungen der Bioverteilung in normalen männlichen Wistar-Ratten eingesetzt werden. Für alle drei Verbindungen konnte eine sehr hohe in vitro-Stabilität festgestellt werden. Die Zellaufnahmeuntersuchungen zeigten vor allem für die Verbindungen [124I]CKIA und [124I]CKIB eine beträchtliche Zellaufnahme von über 1000% ID/mg Protein nach 2 h. Die Zellaufnahme der Verbindung CKIE ist geringer, sollte allerdings für eine in vivo-Anwendung ausreichend sein. Die Untersuchung der in vivo‑Stabilität der Verbindungen [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE im Blut von Wistar Ratten ergab allerdings, dass alle Verbindungen schnell metabolisiert werden. Die Untersuchung der Bioverteilung der radioiodierten Verbindungen belegen eine in vivo Radiodeiodierung sowie eine hohe hepatobliliäre Auscheidungsrate. Im Hinblick auf eine Anwendung als Radiotracer konnten im Rahmen dieser Arbeit neue Erkenntnisse gewonnen werden. Die dargestellten Inhibitoren sind in der Lage am Zellmodell den Zellzyklusarrest in der G1-Phase zu induzieren. Eine Radiomarkierung der ausgewählten Strukturen liefert das Produkt mit reproduzierbarer Ausbeute in hoher radiochemischer Reinheit und ausreichender spezifischer Aktivität, allerdings ist eine Herstellung der fluorethylierten Verbindung unter GMP-Bedingungen nur schwer realisierbar. Die radiomarkierten Verbindungen zeigen eine hohe in vitro-Stabilität und werden energieabhängig in die Zelle aufgenommen. Anhand der Stabilitätsuntersuchungen in vivo wurde gezeigt, dass alle drei Verbindungen in vivo instabil sind und sehr schnell hepatobiliär eliminiert.

Die Cyclin-abhängigen Kinasen 4 und 6 (Cdk4/6) wurden als essentielle Enzyme für die Regulation des Zellzyklus mit kritischem Beitrag zur gestörten Zellproliferation während der Kanzerogenese identifiziert. Als Konsequenz davon erwiesen sich die Cdk4/6 als attraktive Zielproteine für die Entwicklung neuer therapeutischer Konzepte zur pharmakologischen Tumorbehandlung. Verbindungen aus der Substanzklasse der Pyrido[2,3-d]pyrimidine zeigten vielversprechende inhibitorische Wirkungen auf die Aktivität der Cdk4/6 bei gleichzeitiger herausragender Selektivität gegenüber anderen Cdk. Anschließende Untersuchungen in vitro und in vivo verdeutlichten das Potential einiger Pyrido[2,3 d]pyrimidine zur Inhibierung des Tumorzellwachstums. Die Weiterentwicklung und Nutzung selektiver Cdk4/6-Inhibitoren zur funktionellen Charakterisierung der Cdk4/6 in Tumoren in vivo mit Hilfe der nicht-invasiven Bildgebungstechnik Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ist ein neuer vielversprechender Forschungsansatz und von großem Interesse für die Evaluierung neuer Strategien zur Diagnose und Therapie maligner Erkrankungen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die biochemische und radiopharmakologische Charakterisierung neuer potentieller Cdk4/6-Inhibitoren aus der Verbindungsklasse der Pyrido[2,3-d]pyrimidine und deren Bewertung hinsichtlich ihrer therapeutischen Wirksamkeit zur gezielten Cdk4/6-Inhibierung in ausgewählten Tumorzelllinien sowie ihres Potentials zur funktionellen Bildgebung der Cdk4/6 in Tumoren mittels PET am Tiermodell. Die biochemische Charakterisierung der Pyrido[2,3 d]pyrimidine CKIA, CKIB, CKIC, CKID und CKIE hinsichtlich ihrer zellulären und molekularen Wirkung erfolgte in den kontinuierlich proliferierenden humanen Tumorzelllinien HT-29, FaDu und THP 1 und in differenzierten THP-1-Makrophagen. Die Zweckmäßigkeit der untersuchten Zelllinien zur Charakterisierung potentieller Cdk4/6-Inhibitoren wurde anhand von Studien zur mRNA-Expression und Proteinbiosynthese der Kinasen Cdk4/6 nachgewiesen. Des Weiteren wurde das Vorkommen der Cdk4/6 in den humanen Xenograft-Tumoren HT-29 und FaDu, sowie in ausgewählten Organen und Geweben von nu/nu-NMRI-Mäusen charakterisiert. In vitro wurden für alle untersuchten Pyrido[2,3-d]pyrimidine signifikante, konzentrations- und zeitabhängige inhibitorische Effekte auf die Tumorzellproliferation beobachtet. Durchflusszytometrische Zellzyklusanalysen 24 Stunden nach Inkubation mit den Pyrido[2,3 d]pyrimidinen zeigten eine konzentrationsabhängige Zunahme des Anteils der HT-29-, FaDu- und THP-1-Zellen in der G1-Phase bis auf 90%. Für die nicht-proliferierenden THP 1-Makrophagen wurden bei Inkubation mit den Pyrido[2,3 d]pyrimidinen geringe Veränderungen ihrer Zellzahl und Zellzyklusphasen-verteilung detektiert. Die zellulären Studien identifizierten deutliche qualitative und quantitative Unterschiede der untersuchten Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Derivate. Nanomolare Konzentrationen von CKIA, CKIB bzw. CKIE erzielten bereits 24 Stunden nach Inkubation deutliche Effekte, während für CKIC und CKID die 10- bis 100-fache Konzentration eingesetzt werden musste, um eine ähnliche Wirkung zu erhalten. Die molekularen Ursachen der Wachstumshemmung und des Zellzyklusarrests wurden durch Untersuchungen zur Pyrido[2,3 d]pyrimidin-abhängigen Beeinflussung des Cdk4/6-Cyclin D-Retinoblastom-E2F-Signalwegs geklärt. In allen Zelllinien wurde eine deutliche Inhibierung der Cdk4/6-spezifischen Phosphorylierung der Aminosäure Serin-780 des Retinoblastom-Proteins (pRb) beobachtet. Als Konsequenz dieser Inhibierung wurde für CKIA, CKIB und CKIE die signifikante konzentrationsabhängige Unterbrechung der Genexpression von E2F-1 und PCNA nachgewiesen. Die Radiomarkierung der Cdk4/6-Inhibitoren CKIA und CKIB mit 124I bzw. von CKIE mit 18F ermöglichte erstmals die Charakterisierung von in vivo-Interaktionen und des Metabolismus im Blut zirkulierender Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Derivate. Die radiopharmako-logischen Eigenschaften von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE wurden in Untersuchungen zur zellulären Radiotracer-Aufnahme, der metabolischen Stabilität und der Bioverteilung bei Ratten sowie abschließend in Kleintier-PET-Untersuchungen bei FaDu-Tumor-tragenden nu/nu-NMRI-Mäusen analysiert. In vitro-Experimente mit [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE verdeutlichten eine hohe Stabilität und schnelle Aufnahme der Radiotracer in humane Tumorzellen bei 37°C. Allerdings deutet die Zelltyp-unabhängige Anreicherung auf eine geringe Abhängigkeit der Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Akkumulation vom Cdk4/6-Status der Zellen hin. Die signifikant geringeren Aufnahmewerte aller untersuchten Pyrido[2,3-d]pyrimidine bei 4°C und die Blockierung der Aufnahme von [18F]CKIE mit nichtradioaktivem CKIE unterstützen die Vermutung spezifischer Transportmechanismen für die Aufnahme der Pyrido[2,3 d]pyrimidine. Untersuchungen von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE in vivo identifizierten eine schnelle, innerhalb weniger Minuten stattfindende Eliminierung aus dem Blut und die primäre Aufnahme in die Leber als grundlegende Stoffwechseleigenschaft aller drei Radiotracer. Aus den PET-Untersuchungen mit [124I]CKIA und [124I]CKIB bei FaDu-Tumor-tragenden Mäusen wurden nur marginale Anreicherungen der radioaktiven Substanzen im Bereich des Tumors festgestellt. Für [18F]CKIE wurde eine Akkumulation im proliferierenden Randbereich des Tumors beobachtet. Die schnelle Metabolisierung von [18F]CKIE im Blut sowie das konstante, geringe Verhältnis der Aktivität im Tumor zur Aktivität im Skelettmuskel wiesen allerdings auf eine unspezifische Anreicherung hin. Schlussfolgernd aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit wurde die Effektivität der Pyrido[2,3 d]pyrimidine CKIA, CKIB und CKIE hinsichtlich der Inhibierung der Cdk4/6-vermittelten Zellzyklusprogression gezeigt. Die antiproliferative Aktivität der Substanzen unterstützt eine weiterführende Evaluierung dieser Cdk4/6-Inhibitoren zur pharmakologischen Tumortherapie. Auf der Basis der erhaltenen radiopharmakologischen Ergebnisse werden die kurze biologische Halbwertszeit und unspezifische Tumoranreicherung von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE als limitierende Faktoren für die Eignung dieser Verbindungen als Radiotracer zur nicht-invasiven Bildgebung der Cdk4/6 im Zielgewebe mittels PET angesehen. Es bleibt zu klären, ob eine längere Verweildauer und höhere Stabilität radiomarkierter Pyrido[2,3-d]pyrimidine im Blut die Chance der Cdk4/6-spezifischen Gewebeanreicherung erhöhen oder Transport-mechanistische Effekte allein ausschlaggebend für die Anreicherung in Zellen und Geweben sind. Die Untersuchung optimierter Cdk4/6-selektiver Inhibitoren für die Charakterisierung und Therapie von Tumoren bleibt weiterhin ein interessanter Aspekt in der Tumorforschung.:1 EINLEITUNG UND LITERATURÜBERSICHT 1 1.1 Der Zellzyklus 1 1.2 Die Cyclin-abhängigen Kinasen 4 und 6 (Cdk4/6) 4 1.2.1 Entdeckung und Struktur der Cdk4/6 4 1.2.2 Funktion und Regulation der Cdk4/6 im Zellzyklus 5 1.2.3 Cdk4/6 und Embryogenese 8 1.2.4 Cdk4/6 und Homöostase 9 1.2.5 Cdk4/6 und Kanzerogenese 10 1.3 Die Cdk4/6 als Zielproteine für die Tumortherapie 11 1.4 Die Tumordiagnostik mittels Positronen-Emissions-Tomographie 16 1.5 Zielstellung 19 2 MATERIAL UND METHODEN 20 2.1 Materialien 20 2.1.1 Geräte 20 2.1.2 Verbrauchsmaterialien 21 2.1.3 Chemikalien, Medien und Enzyme 21 2.1.4 Antikörper und Immunchemikalien 25 2.1.5 Primer 25 2.1.6 Puffer und Lösungen 26 2.1.7 Biologisches Material 28 2.2 Zellbiologische Methoden 29 2.2.1 Rekultivierung und Kryokonservierung von Zellen 29 2.2.2 Kultivierung der Zelllinien 29 2.2.3 Arretierung von Zellen in der Zellzyklusphase G1 30 2.2.4 Bestimmung der Zellzahl 30 2.2.5 Untersuchung der Zellvitalität 30 2.2.6 Untersuchung des Wachstumsverhaltens 31 2.2.7 Durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse 31 2.2.8 Immunfluoreszenzfärbung von Zellen 32 2.3 Proteinbiochemische Methoden 32 2.3.1 Proteinextraktion 32 2.3.2 Trennung von Proteinen durch SDS-PAGE 33 2.3.3 Elektrotransfer der Proteine auf eine Membran 33 2.3.4 Immunchemischer Antigennachweis 34 2.4 Molekularbiologische Methoden 35 2.4.1 RNA Präparation 35 2.4.2 DNase-Behandlung der isolierten RNA 35 2.4.3 Reverse Transkription und Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) 35 2.4.4 Quantitative Echtzeit-RT-PCR 36 2.5 Histologische Methoden 38 2.5.1 Fixierung und Paraffineinbettung von Geweben 38 2.5.2 Immunfärbung der Paraffinschnitte 38 2.5.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung der Paraffinschnitte 39 2.6 Radiopharmakologische Methoden 39 2.6.1 Radiomarkierung der Pyrido[2,3-d]pyrimidine 39 2.6.2 Stabilitätsuntersuchungen 42 2.6.3 Zelluläre Radiotracer-Aufnahme 43 2.6.4 Bioverteilung 44 2.6.5 Positronen-Emissions-Tomographie 44 2.6.6 Autoradiographie 45 2.7 Statistische Methoden 45 3 ERGEBNISSE 47 3.1 Untersuchungen zum Vorkommen der Cdk4/6 in Zellen und Geweben 47 3.1.1 Vorkommen der Cdk4/6 in Zellen 47 3.1.2 Vorkommen der Cdk4/6 in Tumoren 52 3.1.3 Vorkommen der Cdk4/6 in Organen der Maus 54 3.2 Zelluläre und molekulare Effekte der Pyrido[2,3-d]pyrimidin-Derivate 57 3.2.1 Vitalität und Zellproliferation 57 3.2.2 Zellzyklusphasenverteilung 62 3.2.3 pRb-Phosphorylierung 67 3.2.4 mRNA-Expression 70 3.3 Radiopharmakologische Charakterisierung ausgewählter 124I- bzw. 18F- markierter Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Derivate 72 3.3.1 Radiomarkierung der Pyrido[2,3-d]pyrimidine 72 3.3.2 Stabilitätsuntersuchungen in vitro 72 3.3.3 Zelluläre Radiotracer-Aufnahme 72 3.3.4 Bioverteilung und in vivo-Stabilität in Ratten 78 3.3.5 PET-Untersuchungen und Autoradiographie 81 4 DISKUSSION 87 4.1 Nachweis und Lokalisierung der Cdk4/6 in Zellen und Geweben 87 4.2 Zelluläre und molekulare Wirksamkeit der Pyrido[2,3-d]pyrimidine 89 4.2.1 Hemmung der Zellproliferation 90 4.2.2 Hemmung der G1-Phasen-Progression 91 4.2.3 Hemmung des Cdk4/6-Cyclin D-pRb-E2F-Signalwegs 93 4.3 124I- und 18F-markierte Pyrido[2,3-d]pyrimidine als Radiotracer für die funktionelle Bildgebung der Cdk4/6 96 4.3.1 In vitro-Untersuchungen mit den radiomarkierten Pyrido[2,3-d]pyrimidinen 97 4.3.2 In vivo-Untersuchungen mit den radiomarkierten Pyrido[2,3-d]pyrimidinen 100 4.4 Schlussfolgerung und Ausblick 104 5 ZUSAMMENFASSUNG 106 6 LITERATURVERZEICHNIS 109 7 VERÖFFENTLICHUNGEN UND KONFERENZBEITRÄGE 118 8 DANKSAGUNG 120 9 VERSICHERUNG UND ERKLÄRUNG 121

This thesis analyzes the kinds of verbal and nonverbal signals elites manifest to show leadership qualities. Launching from Max Weber’s conceptual framework of charisma as a power term and Harold Lasswell’s study of propaganda, this study takes a multidisciplinary approach to studying political leadership with elements of communication methodology and an ontological basis in evolutionary psychology. The study’s goal is to offer a framework for defining and evaluating the diverse signal patterns employed by political elites in three real-life situations. These are the Malta Summit, the 1992 Virginia Presidential Debate, and the 2012 South Carolina Republican Presidential Primary. The cases were chosen because they display a diverse set of signal variations during different types of interactions. The three case studies are evaluated by measuring frequency and patterns of occurrence of the five different interaction constructs (indicator of interest, indicator of disinterest, demonstration of high value, demonstration of low value, and compliance testing) to explain different interaction patterns. A simple frequency distribution of the different signals during a given interaction is used to display the empirical findings and to compare patterns across the case studies. This study reveals that the presence of DLV (demonstration of low value) signals weaken an elite’s position in relation to other elites and the public while the presence of DHV (demonstration of high value) signals strengthen an elite’s position. It is largely the presence, absence, and frequency of these two signals that determines who conveys leadership qualities effectively regardless of leadership style. Studying the signaling patterns of political elites would allow scholars to understand better the kinds of signal patterns and signal frequencies that are used in different types of leadership styles and norm ranges for signals including for political elites belonging to different cultures and subcultures

Ionometallurgy is a new trend to utilise ionic liquids as alternative green solvents for oxidic and sulfidic copper minerals. It has broad potential for traditional pyrometallurgy and hydrometallurgy. Ionometallurgy utilises ionic liquids (ILs), highly potent complexing ligands (chloride), to process oxide and copper sulfide minerals. This work focused on using the deep eutectic solvents (DES) of ionic liquids, which and provide alternative options for processing various metals, alloys, and concentrates. For this job, various analytical methods were used to determine the copper concentrate and its residue after leaching (MLA-SEM and XRPD), quantify the elements in the solution (IC and ICP-OES/MS) and explain the oxidation behaviour (CV and UV-Vis spectroscopy). Combining the analytical and electrochemical methods to the leaching experiment provided the control to improve the results and understand its oxidation behaviour. Chosen DES, Oxaline (ChCl + oxalic acid, 1:1), and Ethaline (ChCl + ethylene glycol, 1:2) were tested and enhanced on the actual copper concentrates with and without oxidative additives (FeCl3 and I2). Those oxidative additives are selected for leaching experiments by their redox potential in Ethaline. However, there are many acceptable values; the most exciting result related to Ethaline plus iodine was the potential leaching system for chalcopyrite and copper-gold concentrates leaching. Because ion chromatography (IC) and UV-Vis’s analysis confirm iodine oxidizes the Cu+ species quickly in Ethaline. Whilst identical results and oxidation behaviour appeared in chalcocite (Cu2S), chalcopyrite (CuFeS2) and copper-gold concentrates leaching. During the iodine reduction to iodide in the system, IC proved that chalcopyrite releases the Fe3+, oxidizing the chalcopyrite particles. Also, iodine oxidized the natural gold in copper-gold concentrate successfully, and gold concentration quantified ICP-MS and MLA-SEM proved there is no visible gold in the leaching residue. Based on the optimal Ethaline + I2 leaching condition, the copper concentrate was carried out with the bottle roller leaching to represent the tank leaching. Thus, DES shows that it has a high potential to be continued to scale up the experiment. Also, water was given to the Ethaline leaching system, and water had a good influence on the leaching due to reducing the viscosity and saving the Ethaline amount. Hence Ethaline plus water is used for the copper ore leaching in the column, and it can be seen that Ethaline + I2 with water (up to 20%) has a high potential to process the low-grade copper sulfide ores.:Acknowledgements Abstract Abbreviations TABLE OF CONTENTS CHAPTER ONE – INTRODUCTION OF COPPER PROCESSING TECHNOLOGIES 1.1. Overview 1.2. Copper 1.3. Gold 1.4. Hydrometallurgy and pyrometallurgy of copper and gold 1.5. Current copper and gold concentrate processing methods 1.6. An alternative copper concentrate processing method Summary of chapter 1 CHAPTER TWO – FUNDAMENTALS FOR PROCESS DEVELOPING 2.1. Introduction 2.2. Effect of temperature and stirring in leaching 2.3. Analytical methods and experimental 2.4. Experimental for leaching 2.5. Discussion of experimental errors CHAPTER THREE: ANALYTICAL EXPERIMENTS FOR LEACHING 3.1. Introduction 3.2. Analysis of copper concentrate 3.3. Cyclic voltammetry 3.4. UV-Vis spectroscopy analysis of target metals 3.5. Metals solubility in DES 3.6. Summary and conclusions CHAPTER FOUR: FUNDAMENTAL LEACHING EXPERIMENT AND INITIAL INVESTIGATION 4.1. Introduction 4.2. Initial study and fundamental leaching experiments 4.3. Study of mineral oxidation 4.4. Deep eutectic solvents leaching 4.5. Chapter summary and conclusion CHAPTER FIVE: LEACHING OF MODEL SYSTEMS IN ETHALINE WITH OXIDATIVE ADDITIVES 5.1. Introduction 5.2. Iodine effect on Cu2S and CuS leaching in Ethaline 5.3. Ferric chloride effect on CuS and Cu2S leaching 5.4. Leaching of natural gold in Ethaline with the presence of iodine 5.5. Cyclic voltammetry investigation of Cu+/2+ sulfides in DES 5.6. Chapter summary and conclusion CHAPTER SIX: LEACHING OF COPPER-GOLD CONCENTRATES IN DES AND WITH OXIDATIVE ADDITIVES 6.1. Introduction 6.2. Effect of ferric chloride (FeCl3) 6.3. Effect of iodine (I2) 6.4. Electrochemical and spectroscopic analysis of copper-gold concentrate leachates 6.6. Chapter summary and conclusion CHAPTER SEVEN: OVERALL CONCLUSION AND FUTURE WORK 7.1. Overall conclusions 7.2. Recommendations for future research CHAPTER EIGHT: APPENDIX 8.1. Chemicals and materials 8.2. Appendix References

Thyronamine (TAM) sind eine neue Molekülklasse, die endokrinologische und metabolische Prozesse miteinander vereinen. Der biologisch aktive Metabolit 3-Iod-L-Thyronamin (3-T1AM) wird durch eine kombinierte Deiodierung und Decarboxylierung von Schilddrüsenhormonen (TH) gebildet. Existierende Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung von 3-T1AM im menschlichen Serum sind immer noch umstritten. Auch die an der Biosynthese vermutlich beteiligte TH-Decarboxylase konnte noch nicht identifiziert werden. Für die Identifizierung und Quantifizierung von TH und TAM Profilen wurde die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) verwendet. In der bisherigen präanalytischen Aufarbeitung liefern weder Flüssig-Flüssig- noch Festphasenextraktionen reproduzierbare Ergebnisse des 3-T1AM-Gehalts im Serum. Mit der Entwicklung eines spezifischen Extraktionsverfahrens und nachfolgender Detektion mittels LC-MS/MS gelang der gleichzeitige Nachweis der häufigsten TH im humanen Serum. Parallel dazu wurden monoklonale Antikörper gegen 3-T1AM entwickelt, auf deren Basis ein quantitativer 3-T1AM Chemilumineszenz-Immunoassay entstand. Ergebnisse aus klinischen Kollektiven zeigen, dass 3-T1AM im Serum im nM Konzentrationsbereich vorkommt und dass 3-T1AM bei Patienten außerhalb der Schilddrüse produziert wird. Viele Forscher gehen davon aus, dass die aromatische L-Aminosäure Decarboxylase (AADC) die Synthese von TAM über Decarboxylierung von TH katalysiert. Diese Hypothese wurde durch Inkubation von rekombinanter humaner AADC mit TH getestet. In keinem der Experimente konnte AADC die Decarboxylierung von TH katalysieren. Zusammenfassend ist die Bestimmung von 3-T1AM im Serum mittels LC-MS/MS aufgrund der nicht reproduzierbaren präanalytischen Probenaufbereitung problematisch. In dieser Arbeit wird der erste MAb-basierte 3-T1AM assay vorgestellt, der 3-T1AM zuverlässig in humanem Serum quantifiziert. Die AADC ist wahrscheinlich nicht an der Biosynthese von TAM beteiligt. / Thyronamines (TAM) are a new class of molecules linking endocrinology and metabolism. Combined deiodination and decarboxylation of thyroid hormones (TH) generates a biologically active ‘cooling’ metabolite, 3-iodo-L-thyronamine (3-T1AM).. It remains controversial, which methods are able or not to reliably detect 3-T1AM in human serum, and the presumed TH decarboxylase is still elusive. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was used for the simultane-ous identification and quantification of TH and TAM profiles in biological samples. Several preanalytical methods were tested for complete extraction of 3-T1AM in human serum. Thus far, neither liquid-liquid nor solid-phase extraction methods allowed reproducible extraction of 3-T1AM from human serum samples in the preanalytical sample workup. Nevertheless, a rapid and sensitive extraction procedure was developed for detection of the major TH by LC-MS/MS in a single human serum sample. In parallel, monoclonal antibodies (MAb) targeting 3-T1AM were developed and characterized, and a highly specific quantitative 3-T1AM MAb-based chemiluminescence immunoassay was developed. Studies in clinical cohorts provide evidence that 3-T1AM is present in human serum in the nM concentration range and that 3-T1AM is produced extrathyroidally. Many researchers have reasoned that the aromatic L-amino acid decarboxylase (AADC) mediates TAM synthesis via decarboxylation of TH. This hypothesis was tested by incubating recombinant human AADC with several TH. In all tested conditions, AADC failed to catalyze the decarboxylation of TH. These in vitro observations are supported by the finding that 3-T1AM is also present in plasma samples of patients with AADC deficiency. In summary, 3-T1AM detection in serum using LC-MS/MS encounters preanalytical problems. The first MAb-based 3-T1AM CLIA is presented, which reliably quantifies 3-T1AM in human serum. AADC is likely not involved in TAM biosynthesis.