La thrombasthénie de Glanzmann (TG) est une maladie autosomique récessive liée à undéficit quantitatif et/ou qualitatif de l’intégrine αIIbβ3, principale glycoprotéine présente à la surfacedes plaquettes. Ce complexe sert de récepteur au fibrinogène plasmatique, permettant ainsi auxplaquettes de s’agréger entre-elles. Notre étude visait à caractériser les anomalies génétiquesresponsables de TG chez 76 familles d’origine différente. Les signes hémorragiques présentés parles patients étaient principalement des épistaxis, des pétéchies, des saignements gastro-intestinauxou des ménorragies. Les mutations présentes dans les gènes ITGA2B ou ITGB3 ont été identifiéespar séquençage direct. Tous les exons, ainsi que les régions introniques flanquantes, ont étéétudiées, permettant ainsi d’identifier 78 variations génétiques, dont 57 n’avaient jamais étérapportées. Des mutations tronquantes ou de l’épissage étaient présentes dans près de la moitié descas. Les mutations faux-sens représentaient également une forte proportion des anomaliesmoléculaires retrouvées (50% environ). Le caractère délétère de ces mutations a été confirmé parl’utilisation de méthodes in silico et/ou in vitro, permettant de caractériser les domaines essentiels àla structure et à la fonction des sous-unités αIIb et β3. En termes de corrélation génotype-phénotype,notre étude n’a pas permis de mettre en évidence d’association claire entre certaines mutations et lesyndrome hémorragique présenté par les patients. Cependant, ce travail permet de mieuxcomprendre les mécanismes impliqués dans la structure et le fonctionnement de la principaleintégrine plaquettaire. / Glanzmann thrombasthenia (GT) is a rare autosomal recessive disorder characterized byquantitative and/or qualitative defect of the platelet αIIbβ3 integrin. Naturally occurring mutations inITGA2B or ITGB3 genes are responsible for the disease. Sanger sequencing analysis was applied tomutation screening of 83 diagnosed GT patients. 78 different sequence variations were identified ofwhich 57 had never been previously described. Among the novel identified mutations, truncative,missense and splice site mutations were observed. Therefore, we have identified a spectrum ofunreported mutations that may be of value to decipher the role of specific regions within αIIbβ3.

Vetores lentivirais são ferramentas fundamentais para modificação celular. Sua utilização ganhou destaque devido à capacidade desses em integrar ao genoma de células que estão ou não em divisão. Grande parte dos vetores desenvolvidos são derivados do genoma do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV-1), portanto, modificações foram necessárias a fim de evitar a formação de Partículas Competentes em Replicação (RCLs) e garantir uma utilização segura. Com as modificações, foram produzidos os vetores lentivirais de terceira geração utilizados atualmente. Esses vetores podem ser usados para expressão constitutiva de genes, produção de proteínas recombinantes, produção de animais transgênicos e terapia gênica. Com isso, torna-se necessário o desenvolvimento de vetores lentivirais para aplicação em pesquisa básica e ensaios clínicos. Dessa forma, o presente estudo teve por objetivo a construção de vetores de expressão lentivirais aplicáveis à: 1- expressão constitutiva de genes de interesse e 2-vetores com promotores específicos para expressão de proteínas em megacariócitos. Esse trabalho descreve a construção desses vetores, sua importância e discute suas possíveis aplicações. As sequências selecionadas para produção dos vetores foram: os genes Runx1C e VkorC1 e os promotores proPF4 e proITGA2b. Todas as sequências encontram-se clonadas em vetor de clonagem e estoques de bactérias com esses vetores congeladas em glicerol foram confeccionados. Para a confecção dos vetores lentivirais, o gene Runx1C foi subclonado no vetor lentiviral base p1054-CIGWS sob controle do promotor forte CMV, enquanto o promotor proITGA2b foi subclonado no vetor base p1054-FVIII, em substituição ao promotor CMV, de forma a controlar a expressão de FVIII. Os dois vetores produzidos apresentam ainda o gene para proteína verde GFP precedida do sítio de ligação do ribossomo IRES, com expressão controlada pelo mesmo promotor interno do vetor. O trabalho possibilitou, portanto, a produção de dois vetores lentivirais bi-cistrônicos: p1054-Runx1C e pL-proITGA2b-FVIII. A construção p1054-Runx1C ainda não foi sequenciada, mas foi confirmada por restrição enzimática e apresenta potencial para aplicação em estudos de diferenciação hematopoética. Já a construção pL-proITGA2b-FVIII foi sequenciada, porém sem confirmação da região de ligação do proITGA2b ao vetor. Reações de PCR e de restrição enzimática confirmaram a ligação e sequenciamento mostrou 67% de similaridade entre a região sequenciada e o promotor ITGA2b depositado no banco de dados. Análise funcional foi realizada através da transfecção desse vetor em células HEK-293T. As células transfectadas apresentaram expressão positiva para GFP e secreção de FVIII no sobrenadante celular, evidenciando que o promotor proITGA2b clonado no vetor encontra-se ativo. Esse vetor apresenta potencial para aplicação em terapia gênica para hemofilias, pois apresenta expressão do fator de coagulação direcionado a megacariócitos e plaquetas, células que estão diretamente relacionadas ao processo de coagulação, representando grandes veículos para secreção desses fatores. Ainda, os dois vetores lentivirais gerados apresentam segurança e eficiência elevadas, pois são vetores de terceira geração auto-inativantes (SIN) e apresentam elementos regulatórios que melhoram o transporte e integração do DNA ao genoma hospedeiro. / Lentiviral vectors are fundamental tools for cell modification that gained prominence due to their ability to integrate the genome of non-dividing cells. Most of developed lentiviral vectors are derived from the genome of Human Immunodeficiency Virus (HIV-1), so modifications were necessary in order to avoid the formation of Competent Replication Particles (RCLs) and ensure safer operations. The modifications led to development of third generation lentiviral vectors currently used. These vectors can be used for constitutive gene expression, production of recombinant protein, production of transgenic animals and gene therapy. It\'s evident the need to develop lentiviral vectors for application in basic research and clinical trials. Thus this study aimed to construct lentiviral expression vectors applicable to: 1- constitutive expression of genes of interest and 2-vectors with specific promoters for expression of proteins in megakaryocytes and platelets. This paper describes the construction of these vectors, their importance and discuss their possible applications. Sequences were selected for production of the vectors: genes Runx1C and VkorC1 and proPF4 and proITGA2b promoters. All four sequences are cloned into cloning vectors and stocks of bacteria with these vectors frozen in glycerol were prepared. Lentiviral vectors were engineered from subcloning the sequence Runx1C into the basic lentiviral vector p1054- CIGWS under control of the strong CMV promoter, and from subcloning proITGA2b promoter into p1054-FVIII basic vector, replacing the CMV promoter in order to control the expression of FVIII. Both vectors exhibit the green fluorescence protein GFP gene preceded by a ribosome binding site IRES under control of vector\'s internal promoter. Therefore, this work resulted in the production of two bi-cistronic lentiviral vectors: p1054-Runx1C and pLproITGA2b-FVIII. The p1054-Runx1C construction has not yet been sequenced, but it was confirmed by digestion and has potential for use in hematopoietic differentiation studies. Though, pL-proITGA2b-FVIII construct was sequenced, but the technique didn\'t allow to confirm the binding region between proITGA2b and the vector. Although PCR reaction and digestion confirmed the construction. Sequence analysis showed 67% similarity between the sequenced region and ITGA2b promoter deposited in the database. Functional analysis was performed by transfection of this vector in HEK-293T cells. The transfected cells showed positive expression of GFP and FVIII secretion in cell supernatant, indicating that the proITGA2b promoter cloned into the vector is active. This vector has potential usage in gene therapy for hemophilia, since it can be used to express coagulation factors in megakaryocytes and platelets and these cells are directly related to the clotting process, representing great vehicles for secretion of these factors. Even more, the two lentiviral vectors generated have higher safety and efficiency, as they are self-inactivating (SIN) third-generation vectors and have regulatory elements that enhance transport and integration of DNA into the host genome.

Vetores lentivirais são ferramentas fundamentais para modificação celular. Sua utilização ganhou destaque devido à capacidade desses em integrar ao genoma de células que estão ou não em divisão. Grande parte dos vetores desenvolvidos são derivados do genoma do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV-1), portanto, modificações foram necessárias a fim de evitar a formação de Partículas Competentes em Replicação (RCLs) e garantir uma utilização segura. Com as modificações, foram produzidos os vetores lentivirais de terceira geração utilizados atualmente. Esses vetores podem ser usados para expressão constitutiva de genes, produção de proteínas recombinantes, produção de animais transgênicos e terapia gênica. Com isso, torna-se necessário o desenvolvimento de vetores lentivirais para aplicação em pesquisa básica e ensaios clínicos. Dessa forma, o presente estudo teve por objetivo a construção de vetores de expressão lentivirais aplicáveis à: 1- expressão constitutiva de genes de interesse e 2-vetores com promotores específicos para expressão de proteínas em megacariócitos. Esse trabalho descreve a construção desses vetores, sua importância e discute suas possíveis aplicações. As sequências selecionadas para produção dos vetores foram: os genes Runx1C e VkorC1 e os promotores proPF4 e proITGA2b. Todas as sequências encontram-se clonadas em vetor de clonagem e estoques de bactérias com esses vetores congeladas em glicerol foram confeccionados. Para a confecção dos vetores lentivirais, o gene Runx1C foi subclonado no vetor lentiviral base p1054-CIGWS sob controle do promotor forte CMV, enquanto o promotor proITGA2b foi subclonado no vetor base p1054-FVIII, em substituição ao promotor CMV, de forma a controlar a expressão de FVIII. Os dois vetores produzidos apresentam ainda o gene para proteína verde GFP precedida do sítio de ligação do ribossomo IRES, com expressão controlada pelo mesmo promotor interno do vetor. O trabalho possibilitou, portanto, a produção de dois vetores lentivirais bi-cistrônicos: p1054-Runx1C e pL-proITGA2b-FVIII. A construção p1054-Runx1C ainda não foi sequenciada, mas foi confirmada por restrição enzimática e apresenta potencial para aplicação em estudos de diferenciação hematopoética. Já a construção pL-proITGA2b-FVIII foi sequenciada, porém sem confirmação da região de ligação do proITGA2b ao vetor. Reações de PCR e de restrição enzimática confirmaram a ligação e sequenciamento mostrou 67% de similaridade entre a região sequenciada e o promotor ITGA2b depositado no banco de dados. Análise funcional foi realizada através da transfecção desse vetor em células HEK-293T. As células transfectadas apresentaram expressão positiva para GFP e secreção de FVIII no sobrenadante celular, evidenciando que o promotor proITGA2b clonado no vetor encontra-se ativo. Esse vetor apresenta potencial para aplicação em terapia gênica para hemofilias, pois apresenta expressão do fator de coagulação direcionado a megacariócitos e plaquetas, células que estão diretamente relacionadas ao processo de coagulação, representando grandes veículos para secreção desses fatores. Ainda, os dois vetores lentivirais gerados apresentam segurança e eficiência elevadas, pois são vetores de terceira geração auto-inativantes (SIN) e apresentam elementos regulatórios que melhoram o transporte e integração do DNA ao genoma hospedeiro. / Lentiviral vectors are fundamental tools for cell modification that gained prominence due to their ability to integrate the genome of non-dividing cells. Most of developed lentiviral vectors are derived from the genome of Human Immunodeficiency Virus (HIV-1), so modifications were necessary in order to avoid the formation of Competent Replication Particles (RCLs) and ensure safer operations. The modifications led to development of third generation lentiviral vectors currently used. These vectors can be used for constitutive gene expression, production of recombinant protein, production of transgenic animals and gene therapy. It\'s evident the need to develop lentiviral vectors for application in basic research and clinical trials. Thus this study aimed to construct lentiviral expression vectors applicable to: 1- constitutive expression of genes of interest and 2-vectors with specific promoters for expression of proteins in megakaryocytes and platelets. This paper describes the construction of these vectors, their importance and discuss their possible applications. Sequences were selected for production of the vectors: genes Runx1C and VkorC1 and proPF4 and proITGA2b promoters. All four sequences are cloned into cloning vectors and stocks of bacteria with these vectors frozen in glycerol were prepared. Lentiviral vectors were engineered from subcloning the sequence Runx1C into the basic lentiviral vector p1054- CIGWS under control of the strong CMV promoter, and from subcloning proITGA2b promoter into p1054-FVIII basic vector, replacing the CMV promoter in order to control the expression of FVIII. Both vectors exhibit the green fluorescence protein GFP gene preceded by a ribosome binding site IRES under control of vector\'s internal promoter. Therefore, this work resulted in the production of two bi-cistronic lentiviral vectors: p1054-Runx1C and pLproITGA2b-FVIII. The p1054-Runx1C construction has not yet been sequenced, but it was confirmed by digestion and has potential for use in hematopoietic differentiation studies. Though, pL-proITGA2b-FVIII construct was sequenced, but the technique didn\'t allow to confirm the binding region between proITGA2b and the vector. Although PCR reaction and digestion confirmed the construction. Sequence analysis showed 67% similarity between the sequenced region and ITGA2b promoter deposited in the database. Functional analysis was performed by transfection of this vector in HEK-293T cells. The transfected cells showed positive expression of GFP and FVIII secretion in cell supernatant, indicating that the proITGA2b promoter cloned into the vector is active. This vector has potential usage in gene therapy for hemophilia, since it can be used to express coagulation factors in megakaryocytes and platelets and these cells are directly related to the clotting process, representing great vehicles for secretion of these factors. Even more, the two lentiviral vectors generated have higher safety and efficiency, as they are self-inactivating (SIN) third-generation vectors and have regulatory elements that enhance transport and integration of DNA into the host genome.