A anemia falciforme (AF) é uma doença monogênica de elevada mortalidade e morbidade, que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. Não há tratamento definitivo que seja amplo, eficaz e seguro para a AF, de forma que os tratamentos paliativos são os mais utilizados. O tratamento definitivo disponível é transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas, porém com várias complicações envolvidas. O estabelecimento de um modelo in vitro permite uma melhor compreensão de como a doença ocorre, além de permitir o desenvolvimento de novos testes e tratamentos mais eficazes contra a doença. Neste contexto, a tecnologia das células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), que surgiu em 2006, é uma ferramenta poderosa na pesquisa básica, na pesquisa da diferenciação de tecidos e no modelamento de doenças, e uma promessa para futuras aplicações clínicas, na descoberta e triagem de novas drogas mais eficazes e seguras, além da possibilidade de utilização na medicina regenerativa, na produção de células paciente-específicas para terapia celular. Este trabalho teve como objetivo obter um modelo de estudo e tratamento da AF utilizando iPSC. Para isso, vetores epissomais foram utilizados para a reprogramação de células mononucleares de sangue periférico para obter iPSC livres de integração. Estas células foram coletadas de pacientes tratados com o medicamento hidroxiureia e sem tratamento, para avaliação do impacto da droga na reprogramação. As linhagens de iPSC PBscd geradas foram caracterizadas quanto ao potencial pluripotente e de diferenciação. Todas as linhagens geradas se mostraram pluripotentes com potencial de auto renovação e potencial de formar células e tecidos dos 3 folhetos germinativos. O rastreamento dos vetores utilizados na reprogramação mostrou que as células estão livres após cerca de 10 passagens em média, e que eles não se integram espontaneamente nas células. As linhagens de iPSC foram diferenciadas em progenitores hematopoiéticos através da agregação forçada associada à indução com citocinas específicas e um cultivo em suspensão. Dessa forma, nós obtivemos um protocolo dinâmico e eficiente de produção de células CD34+CD45+ com poucos dias de indução. Foram realizados experimentos iniciais de padronização da metodologia de CRISPR, para que essa metodologia possa ser utilizada no futuro para a correção da mutação da AF no gene da ?- globin. Além disso, a reação padronizada para o rastreamento da mutação no gene da ?-globin poderá ser usado em experimentos futuros de edição gênica para avaliar a correção da mutação. Em resumo, oferecemos uma ferramenta valiosa para uma melhor compreensão de como a AF ocorre, além de tornar possível o desenvolvimento de drogas e tratamentos mais eficazes e de fornecer um melhor entendimento dos tratamentos amplamente utilizados, como a hidroxiurea / Sickle cell anemia (SCA) is a monogenic disease of high mortality and morbidity, that affects millions of people worldwide. There is no definitive treatment that is broad, effective and safe for SCA, so the palliative treatments are the most used. The definitive treatment available is the allogeneic transplantation of hematopoietic stem cells, but with several complications involved. The establishment of an in vitro model allows better understanding of how the disease occurs, besides allowing the development of more effective new tests and treatments against the disease. In this context, the induced pluripotent stem cell (iPSC) technology, that emerged in 2006, is a powerful tool for basic research, tissue differentiation research and disease modeling, and a promise for future clinical applications, to find and screen new, more effective and safe drugs, besides the possibility of use in regenerative medicine, in the production of patient-specific cells for cell therapy. This work aimed to obtain a model for study and treatment of SCA using iPSC. For this, episomal vectors were used for reprogramming peripheral blood mononuclear cells to obtain integration-free iPSC. This cells were collected from patients treated with hydroxyurea and without treatment, for evaluation of the impact of the drug in reprogramming. The generated iPSC PBscd lines were characterized for pluripotent and differentiation potential. All the generated lines were shown to be pluripotent with potential for self-renewal and to form cells and tissues of the 3 germ layers. Screening of the vectors used for reprogramming showed that they are absent after about 10 passages, and that they do not integrate spontaneously into the cells. The iPSC lines were differentiated into hematopoietic progenitors through forced aggregation associated with induction with specific cytokines and culture in cell suspension. Thus, we obtained a dynamic and efficient protocol of CD34+CD45+ cells production with a few days of induction. Initial standardization experiments of CRISPR methodology was performed, so that this methodology can be used in the future to correct the ?-globin chain mutation of SCA. Also, the standardized reaction for the screening of ?-globin chain mutation can be used in future gene-editing experiments to evaluate the mutation correction. In summary, we offer a valuable tool for a better understanding of how SCA occurs, in addition to make possible the development of more effective drugs and treatments and providing better understanding of widely used treatments, such hydroxyrea

A demanda por transfusões sanguíneas tem aumentado no Brasil e o número de doações de sangue permanecem insuficientes. Há escassez de componentes de sangue para transfusão, principalmente de concentrados de células vermelhas do sangue. As células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) possuem um grande potencial para se tornar uma fonte de CÉLULAS VERMELHAS DO SANGUE, pois podem se diferenciar em qualquer tipo celular, incluindo CÉLULAS VERMELHAS DO SANGUE de fenótipo específico. O objetivo deste trabalho é a geração de hiPSCs para partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de candidatos a doação de sangue que possuem fenótipo eritrocitário de baixa imunogenicidade, bem como a diferenciação eritroide das hiPSCs geradas. As amostras de sangue periférico (PB) de 11 indivíduos foram coletadas e caracterizadas quanto ao genótipo para os seguintes antígenos eritrocitários: Sistema Rh (RHCE*01/RHCE*02/RHCE*03/RHCE*04/RHCE*05), Kell (KEL*01/KEL*02), Duffy (FY*01/FY*02 and FY*02N.01), Kidd (JK*01/JK*02) e MNS (GYPB*03/GYPB*04). Outros antígenos de grupos sanguíneos distintos foram determinados por meio de fenotipagem. Duas amostras (PBMCs PB02 e PB12) foram selecionadas para a reprogramação devido ausência de múltiplos antígenos eritrocitários e, portanto, considerados de baixa imunogenicidade. Os PBMCs foram enriquecidos em eritroblastos e em seguida, as células foram transfectadas com os vetores episomais pEB-C5 e pEB-Tg e então, co-cultivados sobre fibroblastos de embriões murinos (MEFs) até o surgimento de colônias semelhantes a hiPSCs (hiPSC PB02 e hiPSC PB12). Estas colônias foram transferidas para condições de cultivo próprias e posteriormente caracterizadas quanto à sua pluripotência. A expressão dos genes de pluripotência OCT4, SOX2 e NANOG demonstrou níveis de expressão maior em comparação às linhagens não pluripotentes. As análises de imunofenotipagem por citometria de fluxo revelaram que em torno de 86% das células expressaram Nanog, 88% Oct4 e 88% Sox2. Os níveis de expressão de genes de pluripotência e marcadores foram consistentes com o estado indiferenciado encontrado em células pluripotentes conhecidas. A análise funcional para avaliação da pluripotência foi realizado pela injeção das hiPScs em camundongos imunodeficientes, demonstrando a formação de teratoma nas linhagens geradas. A metodologia para diferenciação hematopoética das hiPSCs geradas a partir dos corpos embrioides estão em progresso. O potencial de diferenciação foi confirmado durante a padronização deste processo, utilizando ensaio de formação de colônias em metilcelulose. Uma média de 10,5 colônias de precursores eritroide foram obtidas a partir de 50x103 hiPSC PB02 em diferenciação e uma colônia mista (mieloide e linfoide) a partir de 15x103 hiPSC PB12 foram obtidas. Neste trabalho foi possível gerar duas linhagens de hiPSCs com fenótipos de antígenos eritrocitários de interesse que podem ser mantidas em cultura por um longo período (26 passagens) e demonstram um potencial de diferenciação hematopoética. / The demand for blood transfusion has increased in Brazil and the number of blood donations remains insufficient. Therefore, there is a shortage of blood components for transfusion, mainly concentrates of red blood cells (RBCs). Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have great potential to become a source of RBCs, because they can differentiate into every cellular type, including RBCs of a particular phenotype. The objective of this work was to generate hiPSC from mononuclear cells of peripheral blood (PBMCs) from blood donors who presented low immunogenic phenotype for transfusion, and erythroid differentiation of the generated hiPSCs. Peripheral blood samples from 11 individuals were collected and characterized for the following erythrocyte antigens: Rh system (RHCE*01/RHCE*02/RHCE*03/RHCE*04/RHCE*05), Kell (KEL*01/KEL*02), Duffy (FY*01/FY*02 and FY*02N.01), Kidd (JK*01/JK*02), MNS (GYPB*03/GYPB*04). Additionally, other antigens of different blood groups were determined by phenotyping. The samples PBMC PB02 and PBMC PB12 were chosen for iPS generation due to their multiple negative erythrocyte antigens. They were isolated, expanded into erythroblasts, and transfected using the reprogramming episomal vectors PEB-C5 and PEB-Tg. This population was co-cultured on mouse embryonic fibroblasts (MEFs) until the appearance of hiPSC like colonies (hiPSC PB02 and hiPSC PB12). These colonies were transferred to human embryonic stem cells (hESCs) culture conditions and characterized regarding their pluripotency. The expression of OCT4, SOX2 and NANOG pluripotency genes demonstrated that the expression of both lineages was higher in comparison with non-pluripotent lineages. Immunophenotyping performed by flow cytometry revealed that 86% of cells expressed Nanog, 88% Oct4 and 88% Sox2. Expression levels of pluripotency genes and markers were consistent with undifferentiated state found in known pluripotent cells. Functional analysis for pluripotency was achieved by the hiPSC injection in immunodeficient mice showing that both hiPSC cell lines were able to induce teratoma tumor. The hematopoietic differentiation potential was confirmed using methylcellulose assay, with an average of 10.5 erythroid colonies from 50x103 single cells and a mixed colonies of myeloid and lymphoid cells) and finally a colony composed of white cells from 15x103 PB12 hiPSC. In conclusion, it was possible to generate a hiPSC from a red blood cell phenotype that are negative for multiple antigens, and this cell line can be maintained for a long period in culture (26 passages) and show potential for hematopoietic differentiation.

A demanda por transfusões sanguíneas tem aumentado no Brasil e o número de doações de sangue permanecem insuficientes. Há escassez de componentes de sangue para transfusão, principalmente de concentrados de células vermelhas do sangue. As células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) possuem um grande potencial para se tornar uma fonte de CÉLULAS VERMELHAS DO SANGUE, pois podem se diferenciar em qualquer tipo celular, incluindo CÉLULAS VERMELHAS DO SANGUE de fenótipo específico. O objetivo deste trabalho é a geração de hiPSCs para partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de candidatos a doação de sangue que possuem fenótipo eritrocitário de baixa imunogenicidade, bem como a diferenciação eritroide das hiPSCs geradas. As amostras de sangue periférico (PB) de 11 indivíduos foram coletadas e caracterizadas quanto ao genótipo para os seguintes antígenos eritrocitários: Sistema Rh (RHCE*01/RHCE*02/RHCE*03/RHCE*04/RHCE*05), Kell (KEL*01/KEL*02), Duffy (FY*01/FY*02 and FY*02N.01), Kidd (JK*01/JK*02) e MNS (GYPB*03/GYPB*04). Outros antígenos de grupos sanguíneos distintos foram determinados por meio de fenotipagem. Duas amostras (PBMCs PB02 e PB12) foram selecionadas para a reprogramação devido ausência de múltiplos antígenos eritrocitários e, portanto, considerados de baixa imunogenicidade. Os PBMCs foram enriquecidos em eritroblastos e em seguida, as células foram transfectadas com os vetores episomais pEB-C5 e pEB-Tg e então, co-cultivados sobre fibroblastos de embriões murinos (MEFs) até o surgimento de colônias semelhantes a hiPSCs (hiPSC PB02 e hiPSC PB12). Estas colônias foram transferidas para condições de cultivo próprias e posteriormente caracterizadas quanto à sua pluripotência. A expressão dos genes de pluripotência OCT4, SOX2 e NANOG demonstrou níveis de expressão maior em comparação às linhagens não pluripotentes. As análises de imunofenotipagem por citometria de fluxo revelaram que em torno de 86% das células expressaram Nanog, 88% Oct4 e 88% Sox2. Os níveis de expressão de genes de pluripotência e marcadores foram consistentes com o estado indiferenciado encontrado em células pluripotentes conhecidas. A análise funcional para avaliação da pluripotência foi realizado pela injeção das hiPScs em camundongos imunodeficientes, demonstrando a formação de teratoma nas linhagens geradas. A metodologia para diferenciação hematopoética das hiPSCs geradas a partir dos corpos embrioides estão em progresso. O potencial de diferenciação foi confirmado durante a padronização deste processo, utilizando ensaio de formação de colônias em metilcelulose. Uma média de 10,5 colônias de precursores eritroide foram obtidas a partir de 50x103 hiPSC PB02 em diferenciação e uma colônia mista (mieloide e linfoide) a partir de 15x103 hiPSC PB12 foram obtidas. Neste trabalho foi possível gerar duas linhagens de hiPSCs com fenótipos de antígenos eritrocitários de interesse que podem ser mantidas em cultura por um longo período (26 passagens) e demonstram um potencial de diferenciação hematopoética. / The demand for blood transfusion has increased in Brazil and the number of blood donations remains insufficient. Therefore, there is a shortage of blood components for transfusion, mainly concentrates of red blood cells (RBCs). Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have great potential to become a source of RBCs, because they can differentiate into every cellular type, including RBCs of a particular phenotype. The objective of this work was to generate hiPSC from mononuclear cells of peripheral blood (PBMCs) from blood donors who presented low immunogenic phenotype for transfusion, and erythroid differentiation of the generated hiPSCs. Peripheral blood samples from 11 individuals were collected and characterized for the following erythrocyte antigens: Rh system (RHCE*01/RHCE*02/RHCE*03/RHCE*04/RHCE*05), Kell (KEL*01/KEL*02), Duffy (FY*01/FY*02 and FY*02N.01), Kidd (JK*01/JK*02), MNS (GYPB*03/GYPB*04). Additionally, other antigens of different blood groups were determined by phenotyping. The samples PBMC PB02 and PBMC PB12 were chosen for iPS generation due to their multiple negative erythrocyte antigens. They were isolated, expanded into erythroblasts, and transfected using the reprogramming episomal vectors PEB-C5 and PEB-Tg. This population was co-cultured on mouse embryonic fibroblasts (MEFs) until the appearance of hiPSC like colonies (hiPSC PB02 and hiPSC PB12). These colonies were transferred to human embryonic stem cells (hESCs) culture conditions and characterized regarding their pluripotency. The expression of OCT4, SOX2 and NANOG pluripotency genes demonstrated that the expression of both lineages was higher in comparison with non-pluripotent lineages. Immunophenotyping performed by flow cytometry revealed that 86% of cells expressed Nanog, 88% Oct4 and 88% Sox2. Expression levels of pluripotency genes and markers were consistent with undifferentiated state found in known pluripotent cells. Functional analysis for pluripotency was achieved by the hiPSC injection in immunodeficient mice showing that both hiPSC cell lines were able to induce teratoma tumor. The hematopoietic differentiation potential was confirmed using methylcellulose assay, with an average of 10.5 erythroid colonies from 50x103 single cells and a mixed colonies of myeloid and lymphoid cells) and finally a colony composed of white cells from 15x103 PB12 hiPSC. In conclusion, it was possible to generate a hiPSC from a red blood cell phenotype that are negative for multiple antigens, and this cell line can be maintained for a long period in culture (26 passages) and show potential for hematopoietic differentiation.

L’acide valproïque (VPA) est un inhibiteur des histones désacétylases (HDACi), qui présente des propriétés anti-tumorales nsur différents types de cancers. Son utilisation depuis plusieurs décennies comme médicament antiépileptique a révélé des effets secondaires, notamment sur le système hématopoïétique. Dans la présente étude, nous nous sommes intéressés à l’effet du VPA sur les réseaux microARN (miR)/Facteurs de transcription (FT) spécifiquement impliqués dans la régulation des voies de différenciation érythro-mégacaryocytaires. Nous montrons que le VPA est capable d’inhiber la différenciation érythroïde dans les cellules érythroleucémiques humaines TF1 et K562 et dans les cellules souches hématopoïétiques (CSH) CD34+, stimulées par l’érythropoïétine recombinante (Epo) ou par l’aclacinomycine A. Cette inhibition se traduit par une diminution de l’expression de la glycophorine A, de la γ-globine, des miR-144/451 et du FT GATA-1. L’inhibition du pré-miR-144 suggère que le VPA est capable de réguler l’expression du gène miR-144/451 au niveau transcriptionnel, via GATA-1. Dans les cellules Epo/CD34+, le VPA induit l’augmentation du FT PU.1 en accord avec l’inhibition du miR-155 et favorise son interaction avec GATA-1 pour inhiber son activité. L’utilisation d’un analogue du VPA, sans activité HDACi (Valpromide) et d’un inhibiteur d’HDAC de classe I, le MS-275, a montré que l’activité HDACi du VPA n’est pas requise pour l’inhibition de la différenciation érythroïde. Le VPA affecte également la voie mégacaryocytaire issue d’un progéniteur commun aux cellules érythroïdes. Dans la lignée mégacaryoblastique Meg-01, le VPA induit des modifications morphologiques du type mégacaryocytaire, une augmentation du marqueur CD61, du FT GATA-2 et du miR-27a. En revanche, l’expression du FT GATA-1 et des miR-144/451 diminuent. L’augmentation du miR-27a coïncide avec la diminution de l’expression de l’ARNm du FT RUNX1, en accord avec l’induction de la voie mégacaryocytaire. En conclusion, le VPA est capable de moduler le programme de différenciation érythro-mégacaryocytaire, à travers un micro réseau de régulation miR/FT / Valproic acid (VPA), a histone deacetylase inhibitor (HDACi), exhibits anti-cancer properties against several tumor types. Its use as an anti-epileptic drug for several decades reveled side effects at the hematological level. In this study, we analyzed the effect of VPA on an erythro-megakaryocyte-specific miR/transcription factors network. VPA inhibited erythroid differentiation in the erythroleukemia cell lines TF1 and K562 as well as in CD34+/hematopoietic stem cells (HSCs), induced by the recombinant erythropoietin (Epo) or aclacinomycin. This inhibition was characterized by glycophorin-A, γ-globin and GATA-1/miR-144/451 down-regulation. Inhibition of pre-miR-144 expression suggested that VPA regulates transcription of the miR-144/451 gene through GATA-1. In Epo-stimulated HSCs, VPA induced PU.1 expression in correlation with miR-155 inhibition and promoted GATA-1/PU.1 interaction. The use of valpromide, a VPA analogue without HDACi activity and the class-I HDACi MS-275, showed that HDAC inhibition by VPA was not required for its inhibitory activity on erythropoiesis. VPA also induced megakaryocyte features in Meg-01 cells, at both cellular and molecular levels. Notably, CD61, GATA-2 and miR-27a were over-expressed. RUNX1 mRNA expression and GATA-1/miR-144/451 axis decreased in accordance with megakaryocyte differentiation. In conclusion, VPA is able to modulate erythro-megakaryocytic differentiation program, through a regulatory micro-network involving miRs and TFs

As células-tronco de pluripotência induzida (iPSC) são células geradas a partir da reprogramação de células somáticas e têm potencial para diferenciação em todos os tipos celulares do organismo adulto. A indução da diferenciação de iPSC pacienteespecífico em células hematopoéticas é uma forma de estudo da hematopoese em modelos de doenças, como a anemia falciforme, e também essencial para o desenvolvimento de terapias. O presente estudo propôs a geração de célulastronco/progenitoras hematopoéticas e progenitores eritroides in vitro a partir de iPSC derivadas de pacientes com anemia falciforme através da formação de corpos embrioides. Ao longo da diferenciação, os desenvolvimentos hematopoético e eritroide foram monitorados através de ensaios de formação de colônia e imunofenotipagem por citometria de fluxo. Neste estudo, demonstramos a presença de células com fenótipo de células endoteliais no início da diferenciação hematopoética por formação de corpos embrioides, possivelmente indicando que as células progenitoras hematopoéticas são provenientes de um endotélio hemogênico. Também verificamos a presença de células endoteliais sem potencial de endotélio hemogênico. Geramos células com características de células-tronco/progenitoras hematopoéticas, de fenótipos CD34+CD45+ e CD45+CD43+, progenitores eritroides (CD36+, CD71+ e CD235a+), bem como a formação de colônias hematopoéticas em cultura em meio semi-sólido. A linhagem de iPSC PBscd08 demonstrou maior potencial para diferenciação em células hematopoéticas e eritroide que as demais linhagens celulares avaliadas. A linhagem PBscd01, também gerada a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de paciente com anemia falciforme, não demonstrou o mesmo potencial para a diferenciação hematopoética, gerando apenas células CD34+ e baixa porcentagem de células CD45+ e CD43+. A linhagem de iPSC PB12, gerada a partir de PBMC de indivíduo saudável, promoveu a geração de populações de células CD34+, CD45+ e CD43+, mas não duplo-positivas, e a geração de células com morfologia de células mieloides após a maturação. As linhagens celulares de iPSC demonstraram variabilidade quanto ao potencial de diferenciação hematopoética. Isto monstra a necessidade de estudos futuros para uma investigação mais detalhada. / Induced pluripotent stem cells (iPSC) are cells generated by reprogramming somatic cells, they have the potential for differentiation into all types of cells in the adult organism. The differentiation of patient-specific iPSC into hematopoietic cells is a way of studying hematopoiesis in disease models, such as sickle cell anemia, and is also essential for the development of therapies. The present study proposed the generation of hematopoietic stem/progenitor cells and erythroid progenitors from iPSC derived from patients with sickle cell anemia. Throughout the differentiation, hematopoietic and erythroid developments were monitored by colony forming cell assay and immunophenotypic analysis. In this study, we demonstrated the presence of cells with endothelial phenotype at the beginning of hematopoietic differentiation by formation of embryoid bodies, possibly showing that hematopoietic progenitor cells originate from a hemogenic endothelium. We generated cells with characteristics of hematopoietic stem/progenitor cells, of CD34+CD45+ and CD45+CD43+ phenotypes, erythroid progenitors (CD36+, CD71+ and CD235a+), as well as the formation of hematopoietic colonies in culture in semi-solid medium. The iPSC line PBscd08 demonstrated greater potential for differentiation into hematopoietic and erythroid cells than the other cell lines evaluated. The iPSC line PBscd01, also generated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients with sickle cell anemia, did not demonstrate the same potential for hematopoietic differentiation, generating only CD34+ cells and a low percentage of CD45+ and CD43+ cells. The iPSC line PB12, generated from healthy individual PBMC, promoted the generation of CD34+, CD45+ and CD43+ cell populations, but not double-positives, and the generation of cells with myeloid cell morphology after maturation. The iPSC cell lines demonstrated variability in the potential for hematopoietic differentiation. This shows the need for future studies for a more detailed investigation.

As células-tronco de pluripotência induzida (iPSC) são células geradas a partir da reprogramação de células somáticas e têm potencial para diferenciação em todos os tipos celulares do organismo adulto. A indução da diferenciação de iPSC pacienteespecífico em células hematopoéticas é uma forma de estudo da hematopoese em modelos de doenças, como a anemia falciforme, e também essencial para o desenvolvimento de terapias. O presente estudo propôs a geração de célulastronco/progenitoras hematopoéticas e progenitores eritroides in vitro a partir de iPSC derivadas de pacientes com anemia falciforme através da formação de corpos embrioides. Ao longo da diferenciação, os desenvolvimentos hematopoético e eritroide foram monitorados através de ensaios de formação de colônia e imunofenotipagem por citometria de fluxo. Neste estudo, demonstramos a presença de células com fenótipo de células endoteliais no início da diferenciação hematopoética por formação de corpos embrioides, possivelmente indicando que as células progenitoras hematopoéticas são provenientes de um endotélio hemogênico. Também verificamos a presença de células endoteliais sem potencial de endotélio hemogênico. Geramos células com características de células-tronco/progenitoras hematopoéticas, de fenótipos CD34+CD45+ e CD45+CD43+, progenitores eritroides (CD36+, CD71+ e CD235a+), bem como a formação de colônias hematopoéticas em cultura em meio semi-sólido. A linhagem de iPSC PBscd08 demonstrou maior potencial para diferenciação em células hematopoéticas e eritroide que as demais linhagens celulares avaliadas. A linhagem PBscd01, também gerada a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de paciente com anemia falciforme, não demonstrou o mesmo potencial para a diferenciação hematopoética, gerando apenas células CD34+ e baixa porcentagem de células CD45+ e CD43+. A linhagem de iPSC PB12, gerada a partir de PBMC de indivíduo saudável, promoveu a geração de populações de células CD34+, CD45+ e CD43+, mas não duplo-positivas, e a geração de células com morfologia de células mieloides após a maturação. As linhagens celulares de iPSC demonstraram variabilidade quanto ao potencial de diferenciação hematopoética. Isto monstra a necessidade de estudos futuros para uma investigação mais detalhada. / Induced pluripotent stem cells (iPSC) are cells generated by reprogramming somatic cells, they have the potential for differentiation into all types of cells in the adult organism. The differentiation of patient-specific iPSC into hematopoietic cells is a way of studying hematopoiesis in disease models, such as sickle cell anemia, and is also essential for the development of therapies. The present study proposed the generation of hematopoietic stem/progenitor cells and erythroid progenitors from iPSC derived from patients with sickle cell anemia. Throughout the differentiation, hematopoietic and erythroid developments were monitored by colony forming cell assay and immunophenotypic analysis. In this study, we demonstrated the presence of cells with endothelial phenotype at the beginning of hematopoietic differentiation by formation of embryoid bodies, possibly showing that hematopoietic progenitor cells originate from a hemogenic endothelium. We generated cells with characteristics of hematopoietic stem/progenitor cells, of CD34+CD45+ and CD45+CD43+ phenotypes, erythroid progenitors (CD36+, CD71+ and CD235a+), as well as the formation of hematopoietic colonies in culture in semi-solid medium. The iPSC line PBscd08 demonstrated greater potential for differentiation into hematopoietic and erythroid cells than the other cell lines evaluated. The iPSC line PBscd01, also generated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients with sickle cell anemia, did not demonstrate the same potential for hematopoietic differentiation, generating only CD34+ cells and a low percentage of CD45+ and CD43+ cells. The iPSC line PB12, generated from healthy individual PBMC, promoted the generation of CD34+, CD45+ and CD43+ cell populations, but not double-positives, and the generation of cells with myeloid cell morphology after maturation. The iPSC cell lines demonstrated variability in the potential for hematopoietic differentiation. This shows the need for future studies for a more detailed investigation.

O transplante de células-tronco hematopoéticas (CTHs) é o tipo mais bem-sucedido de terapia celular realizado até os dias atuais. No entanto, apesar do sucesso e da relevância clínica das CTHs isoladas a partir de fontes adultas, o uso destas células tem algumas limitações em relação à sua disponibilidade, compatibilidade imunológica e risco de contaminação. Desse modo, busca-se o desenvolvimento de soluções para as dificuldades apontadas para suprir a demanda de transplantes. Uma abordagem emergente para superar este problema é baseada na cultura e diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (CTEhs). Estas são célulastronco pluripotentes e indiferenciadas com elevada capacidade de auto-renovação e diferenciação em todas as células derivadas dos três folhetos germinativos. No entanto, os métodos de diferenciação utilizados para a produção de CTHs a partir de células pluripotentes ainda não são eficientes. Os protocolos descritos até o momento têm gerado números variados e populações de células heterogêneas, e produz apenas CTHs muito primitivas e imaturas com baixa capacidade funcional in vivo. Parte desta dificuldade pode decorrer da ineficiência do microambiente de cultura para a diferenciação. Neste trabalho, nós demonstramos um eficiente protocolo de diferenciação hematopoética baseado em cocultivo de CTEhs com fibroblastos embrionários murinos com alto rendimento na geração de célulastronco/progenitoras hematopoéticas (CTPHs) que expressam os antígenos CD45, CD43, CD31 e CD34, e apresentam potencial clonogênico in vitro equivalente ao de células mononucleares isoladas de sangue de cordão umbilical. Nós fomos capazes de produzir todas as células das linhagens eritróide e mielóide em diferentes estágios de maturação, como também células positivas para marcadores linfóides. Demonstramos ainda que as células hematopoéticas surgem no sistema de cultura a partir de um endotélio-hemogênico constituído por células CD34+CD31+. No entanto, apesar das características maduras das CTPHs obtidas por tal método, os ensaios de reconstituição hematopoiética mostraram que estas células ainda possuem limitada capacidade funcional de enxertamento em camundongos imunocomprometidos quando transplantadas por via retro-orbital. / Hematopoietic stem cells (HSC) transplant is the most successful type of cell therapy carried out to date. However, despite the success and the clinical relevance of HSC isolated from adult sources, these cells have some limitations regarding its availability, immunological compatibility and risk of contamination. Thus, we seek to develop solutions to overcome these difficulties to supply the demand for transplants. An emerging approach to overcome this problem is based on human embryonic stem cells (hESCs) culture and differentiation. These are pluripotent and undifferentiated stem cells with high capacity for self-renewal and differentiation in all cells derived from the three embryonic germ layers. However, differentiation methods used for HSC production from pluripotent cells are not efficient yet. Protocols described so far have generated varying numbers and heterogeneous cell populations, and produce only very primitive and immature HSC with low in vivo functional capacity. Part of this difficulty may result from the inefficiency of the microenvironment of culture for differentiation. Here, we demonstrate an efficient protocol based on co-culture of hESCs with mouse embryonic fibroblasts for hematopoietic differentiation with high performance to generate in vitro hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) that express CD45, CD43, CD31 and CD34 antigens with high purity of positive cells. We were able to produce all cells of erythroid and myeloid lineages at different stages of maturation. Lymphoid potential of hematopoietic cells was also evidenced. We demonstrated the primitive origin of hematopoietic cells through capillary-like structures constituted by hemogenic CD34+CD31+ cells. However, despite mature features of HSPCs obtained by our protocol, hematopoietic reconstitution assays showed that these cells have yet limited functional capacity for grafting into immunocompromised mice when exogenously transplanted by retro-orbital route.

O transplante de células-tronco hematopoéticas (CTHs) é o tipo mais bem-sucedido de terapia celular realizado até os dias atuais. No entanto, apesar do sucesso e da relevância clínica das CTHs isoladas a partir de fontes adultas, o uso destas células tem algumas limitações em relação à sua disponibilidade, compatibilidade imunológica e risco de contaminação. Desse modo, busca-se o desenvolvimento de soluções para as dificuldades apontadas para suprir a demanda de transplantes. Uma abordagem emergente para superar este problema é baseada na cultura e diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (CTEhs). Estas são célulastronco pluripotentes e indiferenciadas com elevada capacidade de auto-renovação e diferenciação em todas as células derivadas dos três folhetos germinativos. No entanto, os métodos de diferenciação utilizados para a produção de CTHs a partir de células pluripotentes ainda não são eficientes. Os protocolos descritos até o momento têm gerado números variados e populações de células heterogêneas, e produz apenas CTHs muito primitivas e imaturas com baixa capacidade funcional in vivo. Parte desta dificuldade pode decorrer da ineficiência do microambiente de cultura para a diferenciação. Neste trabalho, nós demonstramos um eficiente protocolo de diferenciação hematopoética baseado em cocultivo de CTEhs com fibroblastos embrionários murinos com alto rendimento na geração de célulastronco/progenitoras hematopoéticas (CTPHs) que expressam os antígenos CD45, CD43, CD31 e CD34, e apresentam potencial clonogênico in vitro equivalente ao de células mononucleares isoladas de sangue de cordão umbilical. Nós fomos capazes de produzir todas as células das linhagens eritróide e mielóide em diferentes estágios de maturação, como também células positivas para marcadores linfóides. Demonstramos ainda que as células hematopoéticas surgem no sistema de cultura a partir de um endotélio-hemogênico constituído por células CD34+CD31+. No entanto, apesar das características maduras das CTPHs obtidas por tal método, os ensaios de reconstituição hematopoiética mostraram que estas células ainda possuem limitada capacidade funcional de enxertamento em camundongos imunocomprometidos quando transplantadas por via retro-orbital. / Hematopoietic stem cells (HSC) transplant is the most successful type of cell therapy carried out to date. However, despite the success and the clinical relevance of HSC isolated from adult sources, these cells have some limitations regarding its availability, immunological compatibility and risk of contamination. Thus, we seek to develop solutions to overcome these difficulties to supply the demand for transplants. An emerging approach to overcome this problem is based on human embryonic stem cells (hESCs) culture and differentiation. These are pluripotent and undifferentiated stem cells with high capacity for self-renewal and differentiation in all cells derived from the three embryonic germ layers. However, differentiation methods used for HSC production from pluripotent cells are not efficient yet. Protocols described so far have generated varying numbers and heterogeneous cell populations, and produce only very primitive and immature HSC with low in vivo functional capacity. Part of this difficulty may result from the inefficiency of the microenvironment of culture for differentiation. Here, we demonstrate an efficient protocol based on co-culture of hESCs with mouse embryonic fibroblasts for hematopoietic differentiation with high performance to generate in vitro hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) that express CD45, CD43, CD31 and CD34 antigens with high purity of positive cells. We were able to produce all cells of erythroid and myeloid lineages at different stages of maturation. Lymphoid potential of hematopoietic cells was also evidenced. We demonstrated the primitive origin of hematopoietic cells through capillary-like structures constituted by hemogenic CD34+CD31+ cells. However, despite mature features of HSPCs obtained by our protocol, hematopoietic reconstitution assays showed that these cells have yet limited functional capacity for grafting into immunocompromised mice when exogenously transplanted by retro-orbital route.

京都大学 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13464号 / 論医博第2251号 / 新制||医||1055(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 金子 新, 教授 江藤 浩之, 教授 髙折 晃史 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20077号 / 医博第4170号 / 新制||医||1018(附属図書館) / 33193 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 江藤 浩之, 教授 斎藤 通紀, 教授 山田 泰広 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM