<p>Majority of new HIV-1 infections world-wide occur via the genital tract. Therefore, achieving effective mucosal immunity will be a critical component of vaccine strategies in the prevention and control of infection during early stages of transmission itself. Rigorous efforts have been made to identify conserved epitopes and develop rational design of immunogens, in order to elicit broadly-reactive protective Abs against HIV. Newly emerging data have highlighted the significance of Ab effector functions other than classical IgG-mediated neutralization in HIV infection. In the studies contributing towards this thesis, an optimized vaccine model is described that successfully elicits potent systemic and mucosal Abs against the highly conserved epitopes of the membrane-proximal external region and the coiled coil region of gp41. Intriguing observations are reported on the IgA-inducing capacity of the coiled coil epitope, QARVLAVERY, which highlight the potential of this epitope as an attractive candidate for mucosal vaccines. Most importantly, the epitope-specific Abs proved to be functional in neutralizing HIV in a standardized assay. With particular relevance to mucosal protection, epitope-specific IgA also effectively inhibited the transcytosis of HIV in an optimized transwell assay. The effect of gp41-specific Abs was also assessed against a novel panel of HIV-1 viral clones, and exhibited significant protection. These clones selectively express envelopes from viruses that would be desired targets of prophylactic immune responses, the earliest founder population in the mucosa after virus transmission.</p> / Doctor of Philosophy (PhD)

<p>Several labs have previously demonstrated that humoral immune responses at one mucosal tissue can disseminate to other mucosal sites, giving rise to the theory of the common mucosal immune system (CMIS). Evidence that demonstrates a similar link between systemic immune responses and mucosal protection is lacking despite indications that both mucosal and systemic memory B cells share common circulatory pathways. The focus of this study is to determine the contribution of blood-borne B cells to mucosal immunity in humans, and how B cells trafficking through blood can be induced to traffic to mucosal tissues.</p> <p>To address these aims, I have performed several analyses of active and inactive peripheral blood memory B cell (MBC) populations in normal, healthy humans. Analysis of recently activated blood B cells confirmed the revealed that the majority of pre-plasma cells (PPC) in blood of healthy, normal humans secrete IgA, and that the majority of IgA- positive PPC secrete primarily polymeric IgA. A large fraction of blood PPC also express CCR10, and this population contains the highest fraction of IgA-expressing and pIgA-secreting PPC in blood. In contrast, most CCR10- PPC secrete IgG, although a small fraction secretes and stains positive for IgA, and analysis of α4β7expression by blood MBC revealed that CCR10 is more inclusive of IgA-switched and pIgA-secreting PPC in blood. The data presented in this study demonstrate that IgA+/CCR10+ PPC represent the mucosal subset of PPC in the blood of healthy humans, and can be investigated as representative of recent or ongoing mucosal immune responses.</p> <p><em>In vitro </em>polyclonal stimulation of blood MBC through CD40 was able to induce CCR10 expression by blood MBC treated with IL-21, IL-2, IL-10 with additions of other germinal center (GC) cytokines such as IL-5 and TGF-β enhancing CCR10 induction. Surprisingly, CCR10 expression by IgG MBC stimulated under these conditions was similar to that of IgA MBC, demonstrating that CCR10 expression is not limited to IgA- switched B cell clones. The results of this study demonstrate that CCR10 expression is inducible by many GC factors, and importantly, is not limited to IgA-switched B cells.</p> <p>Systemic immunization of healthy volunteers with tetanus toxoid/diphtheria vaccine induced a robust systemic IgG response, but also resulted in a post-immunization mobilization of IgA PPC in blood. These PPC were not specific for tetanus or diphtheria, and in several volunteers showed specificity for mucosal pathogens such as poliovirus (PV) and herpes simplex virus (HSV) glycoproteins. In addition, stimulation of anti-HSV IgG memory was also observed. Thus we have demonstrated that a systemic immune response is capable of inducing antibody relevant to mucosal immunity, possibly exposing a mechanism through which systemic and mucosal humoral immune responses are linked.</p> <p>The studies presented here demonstrate the presence of mucosal B cell memory in blood and thus provide new insight into ways to assess and manipulate mucosal immunity.</p> / Doctor of Philosophy (Medical Science)

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Nephrotic syndrome is characterized by proteinuria, hypoproteinemia, edemas and hyperlipidemia. It occurs in primary (e.g. focal segmental glomerulosclerosis, FSGS or minimal change disease, MCD) and in secondary glomerulopathies (e.g. kidney amyloidosis). In primary forms, great attention is paid to the potential genetic background of the disease and due to new molecular genetic methods genes, whose mutations cause different nephropathies (e.g. ACTN4 or INF2) were identified. The aims of presented doctoral thesis were following. Firstly, to continue the mutational analysis of ACTN4 that was described in the author's diploma thesis in other glomerulopathies. Secondly, to implement the mutational analysis of INF2 and subsequently analyse this gene in patients with FSGS/MCD and in patients from special group characterized by positive family history for end stage renal disease (ESRD) in combination with advanced chronic kidney disease (CKD) or already developed ESRD at the time of diagnosis. Thirdly, mutational analysis of NPHS2 and TRPC6 (methods implemented in laboratory earlier) in selected patients from the special group. Finally, expression analyses of genes important for podocyte function or connected with human immune system. This part also verifies the applicability of NPHS2/SYNPO expression...

The mammalian intestine harbors an estimated 100 trillion microorganisms, which normally maintain a mutually beneficial relationship with the host. The intestinal epithelium consists of a single layer of intestinal epithelial cells (IECs) that provides a physical barrier as well as innate immune defense, preventing this vast community of microbes from entering host tissues. Secretory immunoglobulin A (SIgA) acts as the first line of antigen-specific immunity at the interface between the gut microbiota and the intestinal epithelium. Polymeric IgA secreted by plasma cells in the intestinal lamina propria is transported across IECs by the polymeric immunoglobulin receptor (pIgR). Defects in epithelial barrier and immune functions can lead to infections with opportunistic and pathogenic microbes and contribute to the etiology of inflammatory bowel disease (IBD). Here we investigate the ability of IEC biomarkers to define the mechanism and severity of intestinal inflammation, as well as provide insight into the function of IEC in regulating intestinal homeostasis and inflammation. Importantly, down-regulation of pIgR expression was a common feature in human IBD and mouse models of experimental colitis. One molecule of pIgR is consumed for every molecule of SIgA transported, thus high expression of pIgR is required to maintain sufficient supply of SIgA. Accordingly, we investigate the mechanisms by which IECs regulate pIgR expression in response to colonic bacteria. Cross-talk between the microbiota and IECs is mediated by pattern recognition receptors, including Toll-like receptors (TLR), leading to expression of gene products that enhance epithelial barrier function and innate immunity. The cytoplasmic adaptor protein MyD88 transduces signals from TLRs that recognize bacterial products. We show that pIgR induction by colonic bacteria is dependent on TLR4-MyD88 activation of NF-κB signaling. We examined the role of epithelial-specific MyD88 signaling in antibacterial immunity and epithelial expression of key gene products that participate in innate immunity in the gut by generating mice with an IEC-targeted deletion of the Myd88 gene (MyD88ΔIEC). MyD88ΔIEC mice display immunological and antimicrobial defects resulting in increased susceptibility to experimental colitis. We conclude that cross-talk between bacteria and IECs via MyD88-dependent signaling is crucial for maintenance of gut homeostasis.

Au cours des dernières années, Salmonella Enteritidis est devenus les sérotypes les plus souvent isolés chez les patients canadiens, les cas étant liés à la consommation de viande de poulet et d’œufs crus. Les vaccins tués commercialement disponibles pour la volaille, stimulent mal l'immunité mucosale, tandis que l'utilisation de vaccins vivants reste controversée. Par conséquent, un vaccin sous-unitaire par voie orale peut être une solution. Cinq protéines bactériennes ont été choisies comme candidates potentielles et identifiées, soit Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Enolase, Lipoamide dehydrogenase, DNA protection during starvation protein et Elongation factor-Tu. Notre objectif a été de produire et de purifier ces protéines et de démontrer leur immunogénicité. Les gènes des protéines ont été amplifiés et clonés dans le vecteur pQE-30 pour expression dans Escherichia coli M15. La purification a été effectuée par FPLC. Des poules pondeuses SPF ont été séparées en 6 groupes et injectées par voie intramusculaire à different âges avec une des 5 protéines, ou le PBS chez le groupe témoin. Les œufs ont été ramassés pendant l'expérience et du sang a été prélevé à 36 semaines d'âge. Les anticorps IgY ont été extraits à partir du jaune d'oeuf et du sérum, et les IgA à partir du blanc d'oeuf. Des immunodots, westernblots et ELISA ont évalué l'immunogénicité des protéines et les niveaux d'anticorps induits . Nous avons constaté que ces cinq protéines pourraient stimuler la production d'anticorps spécifiques in vivo. GAPDH, Enolase et DPS ont induit des titres d'anticorps plus élevés que LpdA et EF-Tu. / Over the past years, Salmonella Enteritidis (SE) has become the most prevalent serovars isolated in Canadian patients. Most cases in humans are associated with consumption of chicken meat, raw egg and related products. For controlling Salmonella transmission and infection in poultry, available commercially killed vaccines poorly stimulate mucosal immunity, while the use of live vaccines remains controversial. Therefore an oral subunit vaccine may be a solution. Five bacterial proteins were chosen as potential candidates and identified as Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Enolase, Lipoamide dehydrogenase, DNA protection during starvation protein and Elongation factor-Tu. Our objectives were to produce and purify these proteins and study their immunogenicity. The proteins genes were amplified and cloned into pQE-30 vector, then transformed into Escherichia coli M15 for expression. Purification was performed using FPLC. SPF laying hens were separated into 6 groups and injected intramuscularly 3 times at 16, 20 and 28 weeks of age. Five groups were injected with a single protein respectively while the sixth group was injected with PBS as control. Eggs were collected during the duration of the experiment and blood was collected when hens were sacrificed at 36 weeks of age. IgY was extracted from egg yolk and serum and IgA from egg white. Immunodot, westernblot and ELISA were used to evaluate the immunogenicity of proteins and antibody levels they induced. We found that these five proteins could stimulate production of specific antibody in vivo. GAPDH, Enolase and DPS induced higher antibody titer than LpdA and Ef-Tu.

Two methods for overcoming locking phenomena in isogeometric beams are presented. The first method blends the rotation of a Timoshenko beam with the rotation of a Bernoulli beam to produce realistic displacements in straight beams. The second method uses mixed variational principles, specifically the Hu-Washizu Principle, to produce realistic displacements as well as realistic strains without post-processing.

La NIgA primaire est la plus fréquente des glomérulonéphrites. Elle représente, selon l'origine géographique et ethnique des populations, 10 à 40% des glomérulonéphrites primitives. Le diagnostic de NIgA est fait nécessairement sur la ponction biopsie rénale (PBR) en immunofluorescence. La grande difficulté dans cette maladie se trouve dans la prédiction au moment du diagnostic par les facteurs pronostiques de l'évolution vers l'insuffisance rénale chronique terminale à 10 et 20 ans après le début de la maladie. L'hypertension artérielle, la protéinurie ≥l g/24 h et la sévérité des lésions histologiques sur la biopsie rénale sont les facteurs de risque majeurs qui permettent la prédiction initiale. Objectifs de l'étude : confirmer et valider dans notre cohorte de NIgA les 3 facteurs de risque (FdR) comme facteurs significatifs et indépendants prédictifs d'une évolution ultérieure vers la Dialyse ou le Décès (avant dialyse) et utiliser ces 3 FdR pour développer un modèle simple de Risque Rénal Absolu (RRA) dont le score évalué au moment du diagnostic permettrait une prédiction du devenir à long terme (10 et 20 ans). Notre cohorte de patients (332) avec NIgA a été recrutée par le Service de Néphrologie, Dialyse, et Transplantation Rénale du CHU de Saint Etienne à l'Hôpital Nord (IGAN-STET-CO). La cohorte est prospective et inclut tous les patients avec diagnostic de Néphropathie à IgA primaire dont la biopsie rénale diagnostique a été réalisée entre le 1er janvier 1990 et le 31 décembre 1999. Le diagnostic histologique de NIgA est défini par la présence de dépôts mésangiaux d'IgA, d'intensité au moins 1+ comme immunoglobuline dominante ou codominante en immunofluorescence. L'intervalle de temps entre le début la maladie et la PBR diagnostique a été de : moyenne (déviation standard, DS) = 5.7 (8.5) ans et médiane (extrêmes) = 2.5 (0.1-46.9) ans. La durée totale d'exposition au risque principal entre le début de NIgA et le dernier recul ou le l'évènement principal était: moyenne (DS) = 12.9 (9.5) ans et médiane (extrêmes) = 11.3 (0.l-56.0) ans; chez 44 patients cette durée d'exposition était supérieure à 20 ans (l3.3%). La progression de la NIgA a été basée sur l'apparition de deux évènements : l'évènement principal (primary end-point) était la dialyse (Di; correspondant à la mort rénale avec un DFG de stade V autour de 8 ml/mn/1.73m2S) ou le décès du patient (De; s'il survenait avant le début de la dialyse), et représenté par Di/De ou plus simplement par D/D; l'évènement secondaire (secondary end-point) était la survenue d'un DFGe<60 ml/mn/1.73m2S marquant le début de l'IRC et correspondant à l'entrée dans le stade III de la maladie rénale chronique (MRC-3+). Les facteurs de risque majeurs étudiés dans cette étude sont l'hypertension artérielle (supérieure à 140/90 mmHg), la protéinurie (≥1g/24 h), et le score optique global (GOS ≥8). Le risque rénal absolu (RRA) de dialyse/décès (D/D) a été calculé à partir de ces trois facteurs simplifiés et dichotomiques après avoir confirmé leur caractère indépendant (les uns des autres) et que leur poids spécifique dans cette prédiction était quantitativement très similaire. 0 pour aucun de ces FdR, 3 pour leur présence simultanée et un score intermédiaire de 1 ou de 2 pour la présence de 1 ou 2 parmi ces 3 facteurs. Ce RRA a été utilisé comme une variable qualitative avec 4 catégories. Nous avons utilisé les courbes de survie sans l'évènement étudié selon Kaplan-Meier (KM) et la méthode de régression de Cox qui permet d'étudier l'influence d'une variable sur la survie sans l'évènement et permet ainsi d'isoler des facteurs pronostiques. Le DFG estimé au moment du diagnostic est de: moyenne(DS) = 74.7 (28.3) et médiane = 80 ml/mn/1.73m2S contre au dernier recul: moyenne (DS) = 68.0 (3 l .3) et médiane = 72.5 avec un P très significatif. La répartition des patients selon le RRA était la suivante: 151 patients (45,5%) avec un score de 0, 69 (20,8%) avec un score de 1,65 (19,6%) avec un score de 2, et 47 patients (14,2%) avec un score de 3. Le taux d'incidence cumulative de D/D, respectivement à 10 ans et 20 ans, a été de 2% (81 à risque) et 4% (15 à risque) pour RRA = 0,2% (38 à risque) et 9% (12 à risque) pour RRA = 1,7% (42 à risque) et 18% (9 à risque) pour RRA = 2, et 29% (27 à risque) et 64% (8 à risque) pour RRA = 3 (test du Logrank global; Chi2 = 62,1; P <0,0001). Les courbes de survie des patients sans D/D, selon Kaplan-Meier ont montré une meilleure survie avec un contrôle effectif de l'HTA. Le taux d'incidence cumulée pour dialyse/décès à 10 et à 20 ans était respectivement, pour le groupe non hypertendu de 4% (84 patients à risque) et 5% (17 patients à risque); pour le groupe des patients avec HTA contrôlée de 1% (54 patients à risque) et 19% (14 patients à risque), et pour le groupe des hypertendus non- contrôlés de 19% (50 patients à risque) et 42% (13 patients à risque) avec une différence significative entre les groupes des non hypertendus et des hypertendus contrôlés avec le groupe des hypertendus non contrôlés (P <0,0001). Pour la protéinurie, les courbes de survie des patients sans D/D, selon Kaplan-Meier, ont montré une amélioration significative (p<0,0001) en cas de réduction effective de la protéinurie. Ainsi, le taux d'incidence cumulée pour dialyse/décès à 10 et 20 ans était de 3% (118 à risque) et 5% (25 à risque) pour le groupe avec protéinurie faible/absente, 2% (40 à risque) et 2% (10 à risque) pour le groupe avec " protéinurie réduite", et 29% (30 à risque) et 67% (9 à risque) pour le groupe avec protéinurie non-réduite. Le contrôle des lésions histologiques graves est difficile à estimer à partir de notre cohorte en l'absence de biopsies répétées. Notre score de Risque Rénal Absolu est basé sur trois facteurs de risque majeurs, indépendants et simplifiés prédictifs de la progression vers la MRC-3+, puis vers la dialyse/décès. Ces FdR avaient finalement un poids identique dans cette prédiction à long terme, comme en témoignent : - une valeur de β/SE comprise entre 4 et 5 dans l'analyse monofactorielle et entre 2 et 3 dans l'analyse multifactorielle de Cox, - ainsi que des paramètres d'exactitude quasi similaires: même valeur prédictive négative autour de 0,95 et même valeur prédictive positive autour de 0,30; de même la probabilité de survenue de dialyse/décès était d'environ 31% en leur présence, mais seulement de 3 à 6% en leur absence. Au moment du diagnostic, 47 patients présentaient les 3 FdR ensemble (RRA = 3) et 28 (60%) sont arrivés en dialyse ou sont décédés. La probabilité de l'évolution à long terme vers la dialyse/décès était de 60% chez les patients avec RRA = 3 contre seulement 6% chez les patients avec RRA =0. Nous sommes les premiers à publier sur le Risque Rénale Absolu de dialyse e/o de décès et de proposer un score global avec une application clinique importante. L'utilisation de ce score RRA, nous permet de prédire à 10 et 20 ans après le début de la maladie, le taux d'incidence cumulative de dialyse/décès en retenant les chiffres arrondis à 20ans de 5% si RRA=0, de 10% si RRA=1, de 20% si RRA= 2, et de 60% si RRA=3, et cela dans une population activement traitée. Notre RRA est très simple à calculer par une simple addition des FdR présents au diagnostic, ne nécessite pas de calcul et s'affranchit des autres facteurs de risque (cliniques, biologiques, pathologiques et génétiques) décrits chez les patients avec NIgA comme le sexe ou l'âge du patient au moment de la biopsie ou l'indice de masse corporelle, IMC . Le point important est que l'utilisation du RRA, permettrait de bien sélectionner les patients à inclure dans des essais randomisés et contrôlés L'autre avantage sera dans les études génétiques de démontrer l'impact d'un génotype / allèle spécifique lié à la progression de la maladie en montrant une augmentation pas à pas de la fréquence du génotype/allèle dans les sous- groupes de RRA= 0 à RRA=3

In the present studies we have explored the link between food hypersensitivity and IgA nephropathy (IgAN) and evaluated treatment options in primary and recurrent disease. Approximately one third of our IgAN patients had a rectal mucosal sensitivity to gluten, as demonstrated by increased local mucosal nitric oxide production and/or myeloperoxidase release after gluten challenge. The gluten sensitivity seemed to be an innate immune reaction unrelated to the pathogenesis of celiac disease. Approximately half of the patients had a rectal mucosal sensitivity to soy or cow’s milk (CM). The levels of IgG antibodies to alfa-lactalbumin, beta-lactoglobulin and casein were significantly higher in CM sensitive as compared with non-sensitive IgAN patients, indicating that an adaptive immune response might be involved in addition to the innate immune reaction observed. With the knowledge of gastrointestinal reactivity enteric treatment was considered as a potential new treatment approach of IgAN. A 6-month prospective trial demonstrated proof-of-concept for the use of enteric budesonide targeted to the ileocaecal region of IgAN patients. We observed a modest, but significant reduction in urine albumin, a minor reduction of serum creatinine and a modest increase of eGFR calculated by the MDRD equation. eGFR calculated from the Cockcroft-Gault formula and cystatin C was not changed. In a retrospective study recurrence of IgAN and graft loss was evaluated in Norwegian and Swedish patients having received a primary renal transplant due to IgAN. Adjusting for relevant covariates, a multiple Cox-regression analysis on time to IgAN recurrence showed that use of statins was associated with reduced risk of recurrence and reduced risk of graft loss. The time lag from diagnosis to first transplantation and female gender were also associated with lower risk of recurrence. Improved graft survival was associated with related donor, low donor age and no or low number of acute rejection episodes.

Chez les mammifères, le développement du système immunitaire intestinal est initié in utero par un programme déterminé génétiquement. Cependant, le développement complet de ce système immunitaire et sa maturation finale n'ont lieu qu'après la naissance, sous l'influence des très nombreuses bactéries qui colonisent alors l'intestin et qui composent le microbiote intestinal. L'utilisation de modèles in vivo originaux de souris axéniques, sans germe, et gnotoxéniques, colonisées avec des bactéries individuelles ou des groupes de bactéries plus ou moins complexes, nous a permis d'identifier le rôle particulier de la bactérie segmentée filamenteuse (ou SFB) dans la maturation des réponses immunes intestinales adaptatives, IgA et lymphocytaires T. Sa capacité singulière à adhérer à l'épithélium des plaques de Peyer suggère un rôle important de ces formations lymphoïdes dans l'initiation des réponses immunes induites par la SFB. Nos résultats renforcent l'idée du rôle majeur des plaques de Peyer dans l'initiation des réponses IgA intestinales par le microbiote. De façon inattendue, en l'absence de ces structures, la SFB induit dans le chorion des souris, la néogenèse de structures lymphoïdes tertiaires capables d'initier des réponses IgA associées à une forte réponse IL-17 spécifique de la SFB. Ces résultats suggèrent que les puissantes propriétés immunostimulantes de la SFB sont soutenues par de multiples voies d'induction des réponses immunes qui pourraient être liées à son adhésion à la muqueuse intestinale