Cette thèse a porté sur le développement pour la biologie de la microscopie par génération de troisième harmonique (THG), qui permet la visualisation sans marquage de cellules et de tissus avec une résolution sub-micrométrique. Son application en biologie était jusqu'à présent limitée par le manque d'études du mode de création du signal dans l'échantillon, des sources de contrastes biologiques endogènes ainsi que de la phototoxicité induite. Le travail présenté ici a essentiellement porté sur ces trois questions. Nous avons d'abord étudié théoriquement et expérimentalement l'influence de la structure de l'échantillon et de la focalisation du faisceau excitateur sur le signal THG. Nous avons montré que l'imagerie THG agit sur l'échantillon comme un filtre passe! -bande pour les fréquences spatiales et qu'ajuster la focalisation de l'excitation permet de moduler la visibilité de structures au sein d'un système complexe selon leur forme. Par ailleurs, nous avons caractérisé les propriétés optiques de différents liquides biologiques, qui prédisent qu'un corps lipidique dans un environnement aqueux doit constituer une source efficace de signal intracellulaire. Nous avons démontré que de telles structures peuvent effectivement être suivies et quantifiées par microscopie THG dans de nombreux types de tissus biologiques non marqués, ouvrant la voie à des applications en physiopathologie. Finalement, nous avons appliqué la microscopie THG à la visualisation in vivo et sans marquage du développement embryonnaire précoce chez la drosophile. Sur ce modèle, nous avons étudié les mécanismes de phototoxicité liés à l'imagerie THG et démontré la possibilité de visualiser les embryons en 3D sans perturbation du développement et de quantifier les mouvements morphogénétiques à partir des séquences obtenues.

Le travail effectué au cours de cette thèse a porté sur le développement et la mise en œuvre de nouvelles stratégies en microscopie non linéaire permettant d'augmenter le nombre de signaux non linéaires simultanément observables d'une part, et la vitesse d'acquisition d'autre part. Dans un premier temps, nous avons exploré la possibilité de produire des signaux multiples au moyen de deux trains d'impulsions synchronisés de longueur d'onde centrale distincte. Nous avons montré que cette approche permet d'exciter de façon optimale et simultanée trois protéines fluorescentes respectivement bleue, jaune, et rouge. Une application de cette méthode consiste à imager de grands volumes de tissus marqués avec des transgènes Brainbow dans le but d'étudier la connectivité ou le lignage cellulaire. Plus généralement, nous avons montré que cette approche permet de combiner plusieurs signaux non linéaires tels que la fluorescence, la génération de seconde (SHG) et de troisième (THG) harmoniques, ainsi que le mélange à quatre ondes (FWM). Dans un deuxième temps, nous avons étudié la possibilité d'augmenter la vitesse d'imagerie. Pour cela, nous avons mis en œuvre plusieurs manières de produire des faisceaux de Bessel focalisés afin d'augmenter la profondeur de champ d'un microscope à balayage. Enfin, en vue d'augmenter la vitesse d'acquisition tout en préservant le sectionnement optique, nous avons construit un microscope biphotonique à nappe de lumière de profil spatial programmable. Dans cette géométrie nous avons comparé les propriétés d'imagerie de profils d'excitation de type gaussien et de Bessel pour des applications en biologie du développement.

La microscopie par diffusion Raman Coh´erente Anti-Stokes (CARS) est une<br />m´ethode r´ecente d'imagerie dont le contraste provient de l'excitation r´eso-<br />nante s´elective de vibrations mol´eculaires intrins`eques d'une liaison ou d'un<br />ensemble de liaisons chimiques. Cette technique pr´esente l'avantage de s'af-<br />franchir de tout marqueur fluorescent qui peut ˆetre toxique pour un orga-<br />nisme biologique vivant. Elle permet aussi d'avoir une tr`es grande sensibilit´e<br />et une forte r´esolution spatiale, comparable `a celle de la microscopie confo-<br />cale. Le travail de cette th`ese concerne la r´ealisation d'un microscope CARS,<br />et sa mise en application `a diff´erents domaine de l'imagerie bio-m´edicale. Des<br />´etudes ont ´et´e men´ees d´emontrant les potentialit´es de cet outil, ainsi que sa<br />caract´erisation dans le domaine spatiale et spectral.

Dans cette thèse, nous proposons l'utilisation d'un nouveau type de fibre à cristal photonique, la fibre Kagomé à coeur creux, pour la livraison d'impulsions ultra-courtes en endoscopie non linéaire. Ces fibres permettent la livraison d'impulsions sans distorsion sur une large bande spectrale, avec un faible bruit de fond, grâce à la propagation dans le cœur creux. Nous avons résolu le problème de la résolution spatiale, à l'aide d'une microbille en silice, insérée dans le cœur de la fibre Kagomé. Nous avons développé un système d'imagerie compacte, qui utilise un tube piézo-électrique pour le balayage du faisceau, un système achromatiques de microlentilles et une fibre Kagomé double gaine, spécialement conçue pour l'endoscopie. Avec ce système, nous avons réussi à imager des tissus biologiques, à l'extrémité distale de la fibre (endoscopie), en utilisant des différentes techniques tels que TPEF, SHG et CARS, un résultat qui ne trouve pas d'égal dans la littérature actuelle. L'intégration dans une sonde portable (4,2 mm de diamètre) montre le potentiel de ce système pour de futures applications en endoscopie multimodale in-vivo. / In this thesis, we propose the use of a novel type of photonic crystal fiber, the Kagomé lattice hollow core fiber, for the delivery of ultra-short pulses in nonlinear endoscopy. These fibers allow undistorted pulse delivery, over a broad transmission window, with minimum background signal generated in the fiber, thanks to the propagation in a hollow-core. We solved the problem of spatial resolution, by means of a silica micro-bead inserted in the Kagomé fiber large core. We have developed a miniature imaging system, based on a piezo-electric tube scanner, an achromatic micro-lenses assembly and a specifically designed Kagomé double-clad fiber. With this system we were able to image biological tissues, in endoscope modality, activating different contrasts such as TPEF, SHG and CARS, at the distal end of the fiber, a result which finds no equal in current literature. The integration in a portable probe (4.2 mm in diameter) shows the potential of this system for future in-vivo multimodal endoscopy.

Les plantes présentent une incroyable diversité de tailles, formes et couleurs, étroitement liée à certaines de leurs fonctions biologiques telles que la photosynthèse, la reproduction, etc. De ce fait, la façon dont ces organismes multicellulaires acquièrent des formes complexes est une question clé en biologie du développement. La morphologie des organes végétaux résulte en effet de la modulation, à l’échelle cellulaire, de patrons d’expression génétique, de croissance et de différenciation. Bien que la morphogénèse ait été largement étudiée d’un point de vue moléculaire, nous ne savons toujours pas comment ces réseaux génétiques sont traduits en formes biologiques. Le but de ce projet de recherche est donc d’étudier le développement des organes latéraux (feuilles juvéniles, feuilles caulinaires et organes floraux, id sépales, pétales et anthères) chez l’espèce modèle Arabidopsis thaliana. Afin d’approcher la question du rôle des interactions complexes entre cellules et organes lors du développement, nous nous intéressons à la variabilité entre les organes, mais aussi à la variabilité cellulaire intrinsèque de chaque organe. Nous avons donc testé (1) si la diversité de formes observées chez les organes latéraux résulte de modulations d’un programme développemental commun; (2) si la croissance et le développement des organes latéraux est un phénomène stochastique ou dépend de mécanismes sous-jacents spécifiques. Pour ce faire, nous utilisons une approche multidisciplinaire basée sur la génétique, la microscopie confocale et l’analyse d’images 3D pour extraire les patrons de croissance inhérents aux différents organes. Les résultats de la première étude (Chapitre 2) montrent que la forme des organes dépend de l’équilibre entre croissance et différentiation, dont la régulation précise permet l'acquisition de fonctions hautement spécialisées. La feuille caulinaire, par exemple, présente un retard de différenciation qui permet une activité morphogénétique prolongée et une redistribution de la croissance. À travers la suppression transitoire de la croissance lors des premiers stades de développement, la trajectoire développementale de la feuille caulinaire permet sa double fonction, à la fois protectrice et photosynthétique.\par La deuxième étude (Chapitre 3), quant-à-elle, s’intéresse aux comportements des cellules individuelles, dont la croissance, bien que contrôlée par des informations positionnelles, est souvent hétérogène. Cette variabilité résulte de la différenciation de cellules spécialisés, les stomates, qui suivent un programme de développement spécifique. Le comportement autonome de ces cellules, asynchrone, est la principale source de variabilité dans des tissus dont la croissance est autrement homogènes. Dans l’ensemble, cette thèse a permis de mettre en lumière l’importance de la temporalité lors du développement des organes végétaux. Que ce soit à l’échelle de l’organe, du tissu ou de la cellule, la modulation et la synchronisation de la croissance et de la différentiation sont nécessaires à l’acquisition des formes stéréotypiques des organes et à leur complexité fonctionnelle. / Plants display an incredible diversity of sizes, shapes, and colors, closely linked to some of their biological functions, such as photosynthesis, reproduction, etc. How these multicellular organisms acquire complex shapes is, therefore, a key question in developmental biology. The morphology of plant organs results from cell-level modulation of patterns of gene expression, growth, and differentiation. Although morphogenesis has been extensively studied from a molecular point of view, how genetic networks are translated into biological forms is still unclear. Thus, the aim of this research project is to study the development of lateral organs (rosette leaves, cauline leaves, and floral organs, i.e. sepals, petals, and anthers) in the model species Arabidopsis thaliana. To address the question of the role of complex cell-organ interactions during development, we are interested not only in variability between organs but also in the intrinsic cellular variability of each organ. We, therefore, tested (1) whether the diversity of shapes observed in lateral organs results from modulations of a common developmental program; (2) whether the growth and development of lateral organs is a stochastic phenomenon or depends on specific underlying mechanisms. To this end, we are using a multidisciplinary approach based on genetics, confocal microscopy, and 3D image analysis to extract the growth patterns inherent in the different organs. The results of the first study (Chapter 2) show that organ shape depends on the balance between growth and differentiation, which fine regulation enables the acquisition of highly specialized functions. The cauline leaf, for example, shows a delay in differentiation that allows for prolonged morphogenetic activity and growth redistribution. Through the transient growth suppression at early stages, the cauline leaf developmental trajectory allows for its dual function, from protection to photosynthesis. The second study (Chapter 3) focuses on the behavior of individual cells, whose growth, although controlled by positional information, is often heterogeneous. This variability results from the differentiation of specialized cells, the stomata, which follow a specific developmental program. The autonomous, asynchronous behavior of these cells is the main source of variability in tissues whose growth is otherwise homogeneous. Overall, this thesis has shed light on the importance of timing in plant organ development. Whether at the organ, tissue, or cell level, modulation and synchronization of growth and differentiation are necessary for the acquisition of stereotypic organ shapes and functional complexity.

Ce document présente les grandes lignes des travaux de recherche que j'ai menés dans divers laboratoires depuis ma thèse.