Bien que les matériaux poreux soient nombreux dans la nature, la synthèse en laboratoirede matériaux présentant une porosité multi-échelle ou hiérarchisée est toujours délicate. Enutilisant la matière molle (émulsions concentrées, auto-assemblages, mésophases lyotropes, etc)et le procédé sol-gel, il est possible d’obtenir une grande variété de matériaux monolithiques, àporosité hiérarchisée, composés d’un squelette silicique. La porosité de ces matériaux peut êtreoptimisée en jouant avec la nature de l’émulsion, le tensioactif utilisé, ou avec l’ajout d’agentd’extérieur comme le sel. En combinant ces méthodes, des matériaux possédant une mésoporositéhexagonale ont été obtenus. Grâce à leur surface riche en silanols, ces matériaux poreux ont étéfonctionnalisés par greffage post-synthèse de molécules organiques. Dès lors, l’immobilisationd’entités biologiques comme les enzymes au sein de la structure poreuse a permis d’utiliser cesmatériaux pour des réactions d’hydrolyse, de synthèse ou de décoloration en milieu aqueux dansune approche de « chimie verte ». Enfin, des micro-organismes ont été piégés dans ces matériauxporeux qui ont été recouverts d’une coque en silice. Les micro-organismes peuvent s’y développersans restriction et leur croissance est très différente de celle observée dans les cultures classiques.La coque en silice, formée en surface, est donc imperméable au passage des bactéries (taillemicrométrique) mais perméable à la diffusion des substrats et des réactifs. Cette diffusion a étémise à profit pour réaliser des réactions enzymatiques en cascade. Ces matériaux se positionnentcomme des biocatalyseurs très prometteurs pour de nombreuses applications. / Although porous materials are numerous in nature, the laboratory synthesis of materials withmulti-scale or hierarchical porosity is always difficult. By using soft matter (concentrated emulsions,self-assemblies, lyotropic mesophases, etc.) and the sol-gel process, it is possible to obtaina wide variety of monolithic materials with hierarchical porosity composed of a silicic skeleton.The porosity of these materials can be optimized by playing with the nature of the emulsion,the surfactant used, or with the addition of external agents such as salt. By combining these methods,materials with hexagonal mesoporosity have been obtained. Thanks to their silanol-richsurface, these porous materials have been functionalized by post-synthesis grafting of organicmolecules. Therefore, the immobilization of biological entities such as enzymes within the porousstructure has made it possible to use these materials for hydrolysis, synthesis or discolorationreactions in aqueous media in a "green chemistry" approach. Finally, microorganisms were trappedin these porous materials which were covered with a silica shell. Microorganisms can growthere without restriction and their growth is very different from that observed in conventionalcultures. The silica shell formed on the surface is therefore impermeable to the passage of bacteria(micrometric size) but permeable to diffusion of substrates and reagents. This diffusion wasused to carry out cascade enzymatic reactions. These materials are positioned as very promisingbiocatalysts for many applications.

Depuis peu, des travaux ont montré que chez l’Homme, la transcétolase (TK, EC 2.2.1.1.) dont le cofacteur est la thiamine diphosphate (forme active de la vitamine B1), est une enzyme impliquée dans de nombreuses maladies telles que, le diabète, certains cancers, ou encore des maladies neurologiques, comme le syndrome de Wernicke-Korsakoff et la maladie d’Alzheimer. Pour des applications thérapeutiques, des inhibiteurs spécifiques de cette enzyme sont actuellement conçus et synthétisés dans les milieux académiques et industriels. Afin de déterminer l’activité de la TK (dans un but de diagnostic) d’une part, et de détecter des inhibiteurs potentiels de cette enzyme (dans un but thérapeutique) d’autre part, il est nécessaire de disposer de tests alliant rapidité, sensibilité et faible coût. Nous avons envisagé d’utiliser des biocapteurs ampérométriques qui combinent l’ensemble de ces avantages, et qui, de plus, n’ont jamais été mis en oeuvre avec la TK. Pour la détermination de l’activité des TK d’E. coli et humaine libres en solution, nous avons tout d’abord élaboré un premier biocapteur à galactose oxydase (GAOx, EC 1.1.3.9), dans lequel cette enzyme est immobilisée sur la laponite. Puis, dans le but de detecter des inhibiteurs de la TK, avec un système réutilisable, nous avons developpé un biocapteur à GAOx-TK d’E. coli, les deux enzymes étant co-immobilisées à la surface de l’électrode. Pour cela la TK a été immobilisée dans des Hydroxydes Doubles Lamellaires (HDL). Ce biocapteur bicouche et bi-enzymatique GAOx-TK, nous a permis d’évaluer l’effet d’inhibiteurs, tels que différents analogues du cofacteur et de substrats pris comme modèles. / Some recent studies have shown that human transketolase (TK, EC 2.2.1.1.), which thiamine diphosphate (active form of vitamin B1) is the cofactor, is involved in numerous disease such as diabete, some cancers and neurodegenerative diseases as Alzheimer’s disease and Wernicke-Korsakoff syndrome. For therapeutic purposes, TK inhibitors have been designed and synthesized in both academic and industrial fields. To determine TK activity (diagnostic) on the one hand, and to detect potential inhibitors of this enzyme (therapeutic) on the other hand, it is necessary to develop fast, sensitive and low cost assays. In this context, we designed some original amperometric biosensors that combine these advantages and were never studied with TK from now. We performed a first galactose oxidase (GAOx, EC 1.1.3.9) biosensor for E. coli and human TK activities detection. For that purpose, GAOx was immobilized on laponite matrix. Then, we designed a GAOx-TK biosensor by co-immobilization of GAOX and TK on the electrode surface that enabled the detection TK inhibitors with a reusable system. Thence, TK was immobilized in Layered Double Hydroxides (HDL). This bilayer and bi-enzymic biosensors, allowed us to determine the inhibitor potencies of several cofactors and substrates analogues as model compounds.

Ce manuscrit de thèse présente le développement de méthodes basées sur la spectrométrie de masse consacrées à la recherche d'inhibiteurs d'enzymes en milieux complexes, tels que les extraits de plantes. L’enzyme Tyrosinase a été utilisé comme principale cible biologique du fait de son implication dans les processus d’hyperpigmentation cutanée. De ce fait, la recherche d’inhibiteurs de cette enzyme, présente un grand intérêt pour l'industrie cosmétique. La première partie de ce manuscrit décrit la mise en place de la chromatographie d'affinité frontale (FAC), permettant d’obtenir le classement simultané des inhibiteurs présent dans un mélange complexe en fonction de leurs affinités avec la cible biologique. Deux capillaires hydrophiles de phase monolithiques ont été évalués afin de réduire au maximum les interactions non spécifiques indésirables entre les analytes et le support solide d’immobilisation. De plus, nous avons étudié la faisabilité de l’utilisation de phases à base de silice comme support solide d’immobilisation des enzymes dans le cadre de ces analyses par chromatographie d'affinité frontale. La seconde partie du manuscrit de thèse est consacrée au développement et à l’optimisation de l’approche nommée ENALDI-MS (Enzyme-coupled Nanoparticles-Assisted Laser Desorption/Ionisation Mass Spectrometry) permettant d’accéder à une gamme des faibles masses (m/z 500 Da). Elle est déclinée en une première approche dite par ‘extinction d’ions’ (Ion Fading, IF-ENALDI), basée sur l’identification directe de la liaison des inhibiteurs vis-à-vis de l’enzyme sans pré-traitement de l’échantillon végétal. Une seconde déclinaison de l’ENALDI-MS concerne une approche dite par ‘Ion Hunting’ (IH - ENALDI MS), basée sur une méthode de pré-concentration sélective des inhibiteurs présents dans l'échantillon. / This thesis report presents the development of mass spectrometry-based methods for searching for inhibitors of enzymes in complex mixtures, such as plant extracts. Tyrosinase enzyme was used as the main biological target for the reason of a significant importance of its inhibitors in the cosmetic industry as the skin whitening agents. The first part of this report describes Frontal Affinity Chromatography (FAC), an approach enabling simultaneous ranking the inhibitors within the complex mixture according to their affinities to the biological target. Two hydrophilic capillary-scale polymer-based bioaffinity stationary phases were evaluated in the context of the presence of undesirable nonspecific interactions between the analyte and the solid immobilisation support. In addition, we explored the usability of two types of silica-based particles as a solid support for enzyme immobilisation for FAC. The second part of the thesis manuscript is devoted to Enzyme-coupled Nanoparticle-Assisted Laser Desorption/Ionisation Mass Spectrometry (ENALDI MS) as a low-mass compatible extension of the Intensity ion Fading MALDI MS (IF-MALDI MS) method for high-throughput screening of the inhibitors in the complex mixtures. Two variations of ENALDI MS were evaluated: 'Ion Fading' (IF-ENALDI MS), based on on-the-spot binding of inhibitors by enzyme molecules and 'Ion Hunting' (IH-ENALDI MS), based on selective pre-concentration of inhibitors present in the sample.