O presente estudo tem por objetivo principal avaliar as alterações funcionais precoces de mitocôndrias hepáticas de ratos wistar submetidos ao estímulo de sepse através da técnica de ligadura cecal e punção (cecal ligation and puncture-CLP) e indução de tolerância ao lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli. As mitocôndrias exercem papel na alteração do metabolismo celular de pacientes sépticos. Os objetivos do presente trabalho foram: (1) padronizar a técnica de indução a tolerância para ratos wistar com LPS de E. coli (2) avaliar a função mitocondrial fosforilativa e oxidativa; (3) quantificar DNA mitocondrial em tecido hepático de animais submetidos à CPL e tolerância; (4) verificar a expressão dos genes responsáveis pela biogênese mitocondrial e replicação do DNA mitocondrial: nuclear respiratory factor (NRF-1), mitochondrial transcription factor A (TFAM) e peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1alfa); (5) avaliar a função dos complexos respiratórios I e IV. Os resultados encontrados no presente estudo revelaram que: (a) a taxa de mortalidade dos animais submetidos a tolerância foi de 10% quando submetidos à dose letal de LPS, enquanto a taxa de mortalidade dos animais controle foi de 100% quando submetidos à dose letal de LPS; (b) observou-se que o grupo do controle respiratório que recebeu doses controladas de LPS e foi submetido à CLP apresentou razão igual ao grupo Controle, sugerindo que a fosforilação oxidativa se manteve igual ao basal, enquanto o grupo que foi submetido ao procedimento de CLP sem indução a tolerância apresentou piora da razão do controle respiratório em relação ao grupo controle; (c) a quantificação de DNA mitocondrial mostrou-se maior nos animais submetidos a CLP sem prévia indução a tolerância, com igual aumento da expressão dos fatores de biogênese mitocondrial em relação aos demais grupos; (d) houve diferença significativa na avaliação da funcionalidade dos complexo I, porém o complexo IV se manteve igual em todos os grupos. Concluiu-se que a indução a tolerância altera positivamente a função mitocondrial em animais submetidos à CLP / The aim of this study was to evaluate the early functional alterations of hepatic mitochondria of wistar rats submitted to the stimulation of sepsis through the technique of cecal ligation and puncture (CLP) and induction of tolerance to lipopolysaccharide (LPS) of Escherichia coli. Mitochondria play a role in altering the cellular metabolism of septic patients. The objectives of the present study were: (1) to standardize the tolerance induction technique for wistar rats with E. coli LPS (2) to evaluate the mitochondrial phosphorylation and oxidative function; (3) quantify mitochondrial DNA in hepatic tissue of animals submitted to CPL and tolerance; (4) to verify the expression of genes responsible for mitochondria biogenesis and mitochondrial DNA replication nuclear mitochondrial biogenesis (NRF-1), mitochondrial transcription factor A (TFAM) and peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1alpha); (5) to evaluate the function of respiratory complexes I and IV. The results found in the present study revealed that: (a) the mortality rate of the animals submitted to tolerance was 10% when submitted to the lethal dose of LPS, whereas the mortality rate of the control animals was 100% when submitted to the lethal dose of LPS; (B) it was observed that the group receiving controlled doses of LPS and submitted to CLP presented a ratio equal to the control group, suggesting that oxidative phosphorylation remained the same at baseline, whereas the group that underwent CLP procedure without induction of tolerance presented worsening of the respiratory control ratio in relation to the control group; (C) the mitochondrial DNA quantification was higher in the animals submitted to CLP without prior tolerance induction, with an equal increase in mitochondrial biogenesis factors expression in relation to the other groups; (D) there was significant difference in the evaluation of the functionality of complexes I, but no difference in complex IV in all groups. It was concluded that induction of tolerance positively alters mitochondrial function in animals submitted to CLP

INTRODUÇÃO: A alergia à proteína do leite de vaca (APLV) é a alergia alimentar (AA) mais comum na infância e o desenvolvimento de tolerância a este alimento vem ocorrendo cada vez mais tardiamente. OBJETIVOS: 1. Avaliar as características epidemiológicas, clínicas e laboratoriais de pacientes tolerantes e daqueles com alergia persistente à APLV. 2. Estabelecer o diâmetro da pápula do Teste cutâneo de Hipersensibilidade Imediata (TCHI) com extrato do leite de vaca (LV) associado ao desenvolvimento de tolerância oral (TO). 3. Comparar o diâmetro da pápula do TCHI, realizado com extrato de LV, entre os pacientes dos grupos tolerante e persistente, em três tempos distintos, no diagnóstico de APLV, no tempo médio da evolução da doença e no momento da aquisição de tolerância ou na data do último TCHI no grupo que persistiu alérgico. MÉTODOS: Trata-se de um estudo de coorte retrospectivo de análise de banco de dados dos prontuários de todas as crianças com diagnóstico de APLV mediada pela imunoglobulina E (IgE), em seguimento na Unidade de Alergia e Imunologia no Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (ICr HCFMUSP), que realizaram TCHI de forma evolutiva, sendo alocados em dois grupos: APLV tolerantes e APLV persistentes, no período entre janeiro de 2000 a julho de 2015. O TCHI foi realizado por equipe treinada e com extrato padronizado de LV total, sendo considerado positivo quando o diâmetro médio da pápula foi >= 3 mm em relação ao controle negativo. As variáveis nominais: gênero, história familiar de atopia, uso de LV no berçário, amamentação por menos de 6 meses, presença de outras doenças alérgicas foram descritas através de frequências e comparadas entre tolerantes e persistentes. No grupo tolerante as mesmas variáveis foram comparadas entre aqueles com idade 5 anos pelo Teste de Fisher. As variáveis contínuas (idade do início sintomas e idade na coleta dos dados, bem como a dosagem de IgE específica para LV pelo ImmunoCap) nos mesmos grupos foram descritas através de medianas e comparadas através teste de Mann-Whitney e Wilcoxon. Os resultados do TCHI (em mm) foram descritos através de medianas, valores mínimos e máximos ao diagnóstico, no tempo médio e ao final, no grupo de tolerantes e de persistentes e comparados em cada tempo pelo teste de Mann-Whitney. A comparação das medianas nos 3 tempos em cada grupo foram realizadas através teste de Friedman. Em todas as análises foi adotado um nível de significância de 5%. RESULTADOS: Após a aplicação de critérios de inclusão e exclusão, obteve-se uma amostra de 44 pacientes, 29 no grupo que desenvolveu tolerância, e 15 no grupo que persistiu com APLV na época da conclusão deste estudo. Não houve diferença estatisticamente significante entre os diferentes achados epidemiológicos e clínicos entre os grupos tolerantes e persistentes. No grupo tolerante ao LV foram encontradas as seguintes medidas de TCHI: ao diagnóstico a mediana foi de 6 mm (3 mm - 15 mm), no tempo médio de seguimento de 3 mm (0 mm - 15 mm) e no desenvolvimento de tolerância de 2 mm (0 mm - 5 mm), valores que mostraram diferença estatisticamente significante nos três períodos avaliados (p < 0,0001; teste de Friedman). No grupo de pacientes persistentes ao LV foram encontradas as seguintes medidas de TCHI: ao diagnóstico mediana de 7 mm (3 mm - 13 mm); no tempo médio de 4 mm (2 mm - 20 mm) e no momento do último TCHI realizado até o término deste estudo a mediana foi de 5mm (0 mm - 19 mm), não havendo diferença estatisticamente significante nos três períodos em que os pacientes foram avaliados (p= 0,256; teste de Friedman). Avaliando o decaimento dos valores do TCHI no grupo de pacientes tolerantes, a mediana do TCHI ao diagnóstico foi de 6mm (3 - 15 mm) e no momento da tolerância de 2 mm (0 mm - 5 mm), com diferença estatisticamente significante entre os valores (p < 0,0001; Teste de Wilcoxon). No grupo persistente não houve diferença estatisticamente significante entre o primeiro e o último TCHI, com p = 0,173 (Teste de Wilcoxon). CONCLUSÃO: O estudo mostrou que a utilização do TCHI para o diagnóstico e detecção de tolerância na APLV é uma ferramenta útil, devendo ser realizado de maneira seriada ao longo da evolução na APLV e seu decaimento poderia indicar o momento para realização de testes de provocação oral (TPO) / BACKGROUND: Cow\'s milk allergy (CMA) is the most common food allergy in childhood and the development of tolerance to this food has been occurred increasingly later. OBJECTIVES: 1.To assess the epidemiological, clinical and laboratory characteristics of tolerant patients and those with persistent allergy to CMA. 2. To establish the wheal diameter of the Skin Prick Test (SPT) with cow\'s milk (CM) extract associated with the development of oral tolerance (OT). 3. To Compare the wheal diameter of the SPT, carried out with CM extract, among the patients of the tolerant and persistent groups in three distinct periods: during the diagnosis of CMA, during the average time of disease progression, and at the moment of tolerance acquisition or on the date of the last SPT in the group that persisted allergic. METHODS: This was a retrospective cohort study of database analysis of medical records of all children diagnosed with CMA mediated by immunoglobulin E (IgE), following the Allergy and Immunology Unit at the Children\'s Institute of the HCFMUSP (between jan/2000 to jul/2015) who underwent SPT in an evolutionary way. They were classified into two groups: CMA tolerant and CMA persistent. The SPT was carried out by trained personnel and with a standardized extract of whole CM, being considered positive when the average wheal diameter was >= 3 mm compared to the negative control. The nominal variables of gender, family history of atopy, CM use in the nursery, breastfeeding for less than six months, and the presence of other allergic diseases were described by frequencies and compared between tolerant and persistent groups. In the tolerant group, the same variables were compared among those aged 5 years by the Fisher Test. Continuous variables (age of onset symptoms and age in the data collection as well as specific IgE levels to CM by ImmunoCap) in the same groups were described by medians and compared using the Mann-Whitney and Wilcoxon test. The results of the SPT (in mm) were described by median, minimum and maximum values for the diagnosis, at the middle and at the end point in the tolerant and persistent groups, and at each time point were compared by way of the Mann-Whitney test. Comparison of the medians in the 3 periods in each group were made using the Friedman test. In all analyses, a significance level of 5% was adopted. RESULTS: After applying inclusion and exclusion criteria, we obtained a sample of 44 patients, 29 in the group that developed tolerance, and 15 in the group that persisted with CMA at the time of completion of this study. There was no statistically significant difference between the different epidemiological and clinical findings between the tolerant and persistent groups. In the CM tolerant group the following SPT measures were found: during diagnosis the median average was 6 mm (3 mm - 15 mm), during the average follow-up time it was 3 mm (0 mm - 15 mm), and for the development of tolerance it was 2 mm (0 mm - 5 mm); values that showed statistically significant differences in the three evaluation periods (p < 0.0001; Friedman test). In the group of patients with persistent allergy to CM, a SPT found the following measures: during diagnosis the median average was 7 mm (3 mm - 13 mm); during the average follow-up time it was 4 mm (2 mm - 20 mm), and at the time of the last SPT performed until the end of the study the median was 5 mm (0 mm - 19 mm), with no statistically significant difference in the three periods (p = 0.256, Friedman test). Evaluating the decay of SPT values in the group of tolerant patients, the median SPT at diagnosis was 6 mm (3-15 mm) and, at the time of tolerance, 2 mm (0 mm - 5 mm), with a statistically significant difference between the values (p < 0.0001; Wilcoxon test). In the persistent group there was no statistically significant difference between the first and the last SPT, p = 0.173 (Wilcoxon test). CONCLUSION: The study showed that the use of the SPT for the diagnosis and detection of tolerance to the CMA is a useful tool and should be performed sequentially throughout the evolution of the CMA and that its decay could indicate the time for performing oral food challenge (OFC)

Made available in DSpace on 2017-07-21T20:00:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Murilo Delgobo.pdf: 2288840 bytes, checksum: d9ce3a086e9ee92b92ac76ac76264e04 (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Brown-Spider’s venom (Loxosceles sp.) is presented as a complex mixture of toxins, able to induce skin necrosis with gravitational spreading, intense inflammatory response, edema induction and increase in vascular permeability in vivo. Recently, the biotechnological potential of the toxins was explored by its use in clinical test, in the study of inflammatory response, as a research tool in cell biology, as a biopesticide and in immunotherapy, through the production of antiserum. In this context, immunotherapy is broadly spread through the production of vaccines, available for the treatment of deleterious reactions developed in accidents. In the present work, we investigated if immunological tolerance induction to dermonecrotic recombinant toxin (LiRecDT1) and its mutated form (LiRecDT1 H12A), through its oral administration, could modulate inflammatory and deleterious responses triggered by dermonecrotic toxin. For this purpose, an oral tolerance protocol was designed, consisting in the administration of 10 μg of LiRecDT1 and LiRecDT1 H12A three times in a week, for three weeks. Adult Swiss mice were further immunized, and oral tolerance induction was observed by reduction in serum levels of IgG antibody anti-toxin when compared with control group. It was observed that mice tolerant to LiRecDT1 H12A present a reduction in paw edema, caused by the injection of 6 μg of dermonecrotic toxin in plantar surface hind paw. Mice tolerized with LiRecDT1 and challenged with 50 μg of dermonecrotic toxin, exhibited higher survival, when compared to control group. This effect was not observed in mice tolerized to LiRecDT1 H12A. The present findings suggested that oral tolerance induction to LiRecDT1 H12A was able to alleviate inflammatory responses triggered by dermonecrotic toxin in paw edema and oral tolerance to LiRecDT1 increase survivability in challenge. The results shown that LiRecDT1 and LiRecDT1 H12A can be explored as a tool in the induction and study of oral tolerance phenomena. The generation of T regulatory cells (Tregs) and following involvement of immunosuppressive cytokines might take part in the modulation of immune response. / O veneno de aranha-marrom (Loxosceles sp.) apresenta-se como uma mistura complexa de toxina, capazes de causar necrose com espalhamento local, intensa resposta inflamatória, indução de edema e aumento da permeabilidade vascular in vivo. Recentemente, o potencial biotecnológico das toxinas foi explorado através de seu uso em análises clínicas, no estudo da resposta inflamatória, como ferramenta de pesquisa na biologia celular, como biopesticidas e na imunoterapia, através da produção de anti-soro. No presente trabalho, foi investigado se a indução de tolerância imunológica à toxina dermonecrótica recombinante (LiRecDT1) e sua forma mutada (LiRecDT1 H12A), através de sua administração oral, poderia modular as respostas inflamatórias e deletérias causadas pela toxina dermonecrótica. Para tal, foi desenvolvido um protocolo para indução de tolerância oral, consistindo na administração de 10 μg de LiRecDT1 e LiRecDT1 H12A três vezes por semana, durante três semanas. Camundongos Swiss fêmeas adultas foram posteriormente imunizadas, e a indução de tolerância foi confirmada pela diminuição nos níveis de anticorpos IgG anti-toxina em relação ao grupo controle, resultado que aponta a obtenção de sucesso na indução de tolerância imunológica. Observou-se que animais tolerantes a LiRecDT1 H12A apresentaram uma diminuição no edema desenvolvida na pata, causado pela aplicação de 6 μg de LiRecDT1 na superfície plantar traseira. Animais tolerizados com LiRecDT1 e desafiados com 50 μg intraperitoneal de toxina dermonecrótica apresentaram maior índice de sobrevivência, quando comparados ao grupo controle. Esse efeito não foi observado em animais tolerizados com LiRecDT1 H12A. Os dados obtidos no presente trabalho sugerem que a indução de tolerância oral à LiRecDT1 H12A é capaz de atenuar o desenvolvimento da resposta inflamatória no edema de pata, enquanto a tolerância oral a LiRecDT1 foi capaz de aumentar a sobrevivência em animais desafiados com LiRecDT1. Os resultados demonstram que as toxinas LiRecDT1 e LiRecDT1 H12A podem ser exploradas como ferramenta na indução e estudo da tolerância oral. A geração de células T regulatórias (Tregs) e subsequente participação de citocinas imunossupressoras devem estar envolvidas na modulação da resposta imune.

INTRODUÇÃO: A alergia à proteína do leite de vaca (APLV) é a alergia alimentar (AA) mais comum na infância e o desenvolvimento de tolerância a este alimento vem ocorrendo cada vez mais tardiamente. OBJETIVOS: 1. Avaliar as características epidemiológicas, clínicas e laboratoriais de pacientes tolerantes e daqueles com alergia persistente à APLV. 2. Estabelecer o diâmetro da pápula do Teste cutâneo de Hipersensibilidade Imediata (TCHI) com extrato do leite de vaca (LV) associado ao desenvolvimento de tolerância oral (TO). 3. Comparar o diâmetro da pápula do TCHI, realizado com extrato de LV, entre os pacientes dos grupos tolerante e persistente, em três tempos distintos, no diagnóstico de APLV, no tempo médio da evolução da doença e no momento da aquisição de tolerância ou na data do último TCHI no grupo que persistiu alérgico. MÉTODOS: Trata-se de um estudo de coorte retrospectivo de análise de banco de dados dos prontuários de todas as crianças com diagnóstico de APLV mediada pela imunoglobulina E (IgE), em seguimento na Unidade de Alergia e Imunologia no Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (ICr HCFMUSP), que realizaram TCHI de forma evolutiva, sendo alocados em dois grupos: APLV tolerantes e APLV persistentes, no período entre janeiro de 2000 a julho de 2015. O TCHI foi realizado por equipe treinada e com extrato padronizado de LV total, sendo considerado positivo quando o diâmetro médio da pápula foi >= 3 mm em relação ao controle negativo. As variáveis nominais: gênero, história familiar de atopia, uso de LV no berçário, amamentação por menos de 6 meses, presença de outras doenças alérgicas foram descritas através de frequências e comparadas entre tolerantes e persistentes. No grupo tolerante as mesmas variáveis foram comparadas entre aqueles com idade 5 anos pelo Teste de Fisher. As variáveis contínuas (idade do início sintomas e idade na coleta dos dados, bem como a dosagem de IgE específica para LV pelo ImmunoCap) nos mesmos grupos foram descritas através de medianas e comparadas através teste de Mann-Whitney e Wilcoxon. Os resultados do TCHI (em mm) foram descritos através de medianas, valores mínimos e máximos ao diagnóstico, no tempo médio e ao final, no grupo de tolerantes e de persistentes e comparados em cada tempo pelo teste de Mann-Whitney. A comparação das medianas nos 3 tempos em cada grupo foram realizadas através teste de Friedman. Em todas as análises foi adotado um nível de significância de 5%. RESULTADOS: Após a aplicação de critérios de inclusão e exclusão, obteve-se uma amostra de 44 pacientes, 29 no grupo que desenvolveu tolerância, e 15 no grupo que persistiu com APLV na época da conclusão deste estudo. Não houve diferença estatisticamente significante entre os diferentes achados epidemiológicos e clínicos entre os grupos tolerantes e persistentes. No grupo tolerante ao LV foram encontradas as seguintes medidas de TCHI: ao diagnóstico a mediana foi de 6 mm (3 mm - 15 mm), no tempo médio de seguimento de 3 mm (0 mm - 15 mm) e no desenvolvimento de tolerância de 2 mm (0 mm - 5 mm), valores que mostraram diferença estatisticamente significante nos três períodos avaliados (p < 0,0001; teste de Friedman). No grupo de pacientes persistentes ao LV foram encontradas as seguintes medidas de TCHI: ao diagnóstico mediana de 7 mm (3 mm - 13 mm); no tempo médio de 4 mm (2 mm - 20 mm) e no momento do último TCHI realizado até o término deste estudo a mediana foi de 5mm (0 mm - 19 mm), não havendo diferença estatisticamente significante nos três períodos em que os pacientes foram avaliados (p= 0,256; teste de Friedman). Avaliando o decaimento dos valores do TCHI no grupo de pacientes tolerantes, a mediana do TCHI ao diagnóstico foi de 6mm (3 - 15 mm) e no momento da tolerância de 2 mm (0 mm - 5 mm), com diferença estatisticamente significante entre os valores (p < 0,0001; Teste de Wilcoxon). No grupo persistente não houve diferença estatisticamente significante entre o primeiro e o último TCHI, com p = 0,173 (Teste de Wilcoxon). CONCLUSÃO: O estudo mostrou que a utilização do TCHI para o diagnóstico e detecção de tolerância na APLV é uma ferramenta útil, devendo ser realizado de maneira seriada ao longo da evolução na APLV e seu decaimento poderia indicar o momento para realização de testes de provocação oral (TPO) / BACKGROUND: Cow\'s milk allergy (CMA) is the most common food allergy in childhood and the development of tolerance to this food has been occurred increasingly later. OBJECTIVES: 1.To assess the epidemiological, clinical and laboratory characteristics of tolerant patients and those with persistent allergy to CMA. 2. To establish the wheal diameter of the Skin Prick Test (SPT) with cow\'s milk (CM) extract associated with the development of oral tolerance (OT). 3. To Compare the wheal diameter of the SPT, carried out with CM extract, among the patients of the tolerant and persistent groups in three distinct periods: during the diagnosis of CMA, during the average time of disease progression, and at the moment of tolerance acquisition or on the date of the last SPT in the group that persisted allergic. METHODS: This was a retrospective cohort study of database analysis of medical records of all children diagnosed with CMA mediated by immunoglobulin E (IgE), following the Allergy and Immunology Unit at the Children\'s Institute of the HCFMUSP (between jan/2000 to jul/2015) who underwent SPT in an evolutionary way. They were classified into two groups: CMA tolerant and CMA persistent. The SPT was carried out by trained personnel and with a standardized extract of whole CM, being considered positive when the average wheal diameter was >= 3 mm compared to the negative control. The nominal variables of gender, family history of atopy, CM use in the nursery, breastfeeding for less than six months, and the presence of other allergic diseases were described by frequencies and compared between tolerant and persistent groups. In the tolerant group, the same variables were compared among those aged 5 years by the Fisher Test. Continuous variables (age of onset symptoms and age in the data collection as well as specific IgE levels to CM by ImmunoCap) in the same groups were described by medians and compared using the Mann-Whitney and Wilcoxon test. The results of the SPT (in mm) were described by median, minimum and maximum values for the diagnosis, at the middle and at the end point in the tolerant and persistent groups, and at each time point were compared by way of the Mann-Whitney test. Comparison of the medians in the 3 periods in each group were made using the Friedman test. In all analyses, a significance level of 5% was adopted. RESULTS: After applying inclusion and exclusion criteria, we obtained a sample of 44 patients, 29 in the group that developed tolerance, and 15 in the group that persisted with CMA at the time of completion of this study. There was no statistically significant difference between the different epidemiological and clinical findings between the tolerant and persistent groups. In the CM tolerant group the following SPT measures were found: during diagnosis the median average was 6 mm (3 mm - 15 mm), during the average follow-up time it was 3 mm (0 mm - 15 mm), and for the development of tolerance it was 2 mm (0 mm - 5 mm); values that showed statistically significant differences in the three evaluation periods (p < 0.0001; Friedman test). In the group of patients with persistent allergy to CM, a SPT found the following measures: during diagnosis the median average was 7 mm (3 mm - 13 mm); during the average follow-up time it was 4 mm (2 mm - 20 mm), and at the time of the last SPT performed until the end of the study the median was 5 mm (0 mm - 19 mm), with no statistically significant difference in the three periods (p = 0.256, Friedman test). Evaluating the decay of SPT values in the group of tolerant patients, the median SPT at diagnosis was 6 mm (3-15 mm) and, at the time of tolerance, 2 mm (0 mm - 5 mm), with a statistically significant difference between the values (p < 0.0001; Wilcoxon test). In the persistent group there was no statistically significant difference between the first and the last SPT, p = 0.173 (Wilcoxon test). CONCLUSION: The study showed that the use of the SPT for the diagnosis and detection of tolerance to the CMA is a useful tool and should be performed sequentially throughout the evolution of the CMA and that its decay could indicate the time for performing oral food challenge (OFC)

O presente estudo tem por objetivo principal avaliar as alterações funcionais precoces de mitocôndrias hepáticas de ratos wistar submetidos ao estímulo de sepse através da técnica de ligadura cecal e punção (cecal ligation and puncture-CLP) e indução de tolerância ao lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli. As mitocôndrias exercem papel na alteração do metabolismo celular de pacientes sépticos. Os objetivos do presente trabalho foram: (1) padronizar a técnica de indução a tolerância para ratos wistar com LPS de E. coli (2) avaliar a função mitocondrial fosforilativa e oxidativa; (3) quantificar DNA mitocondrial em tecido hepático de animais submetidos à CPL e tolerância; (4) verificar a expressão dos genes responsáveis pela biogênese mitocondrial e replicação do DNA mitocondrial: nuclear respiratory factor (NRF-1), mitochondrial transcription factor A (TFAM) e peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1alfa); (5) avaliar a função dos complexos respiratórios I e IV. Os resultados encontrados no presente estudo revelaram que: (a) a taxa de mortalidade dos animais submetidos a tolerância foi de 10% quando submetidos à dose letal de LPS, enquanto a taxa de mortalidade dos animais controle foi de 100% quando submetidos à dose letal de LPS; (b) observou-se que o grupo do controle respiratório que recebeu doses controladas de LPS e foi submetido à CLP apresentou razão igual ao grupo Controle, sugerindo que a fosforilação oxidativa se manteve igual ao basal, enquanto o grupo que foi submetido ao procedimento de CLP sem indução a tolerância apresentou piora da razão do controle respiratório em relação ao grupo controle; (c) a quantificação de DNA mitocondrial mostrou-se maior nos animais submetidos a CLP sem prévia indução a tolerância, com igual aumento da expressão dos fatores de biogênese mitocondrial em relação aos demais grupos; (d) houve diferença significativa na avaliação da funcionalidade dos complexo I, porém o complexo IV se manteve igual em todos os grupos. Concluiu-se que a indução a tolerância altera positivamente a função mitocondrial em animais submetidos à CLP / The aim of this study was to evaluate the early functional alterations of hepatic mitochondria of wistar rats submitted to the stimulation of sepsis through the technique of cecal ligation and puncture (CLP) and induction of tolerance to lipopolysaccharide (LPS) of Escherichia coli. Mitochondria play a role in altering the cellular metabolism of septic patients. The objectives of the present study were: (1) to standardize the tolerance induction technique for wistar rats with E. coli LPS (2) to evaluate the mitochondrial phosphorylation and oxidative function; (3) quantify mitochondrial DNA in hepatic tissue of animals submitted to CPL and tolerance; (4) to verify the expression of genes responsible for mitochondria biogenesis and mitochondrial DNA replication nuclear mitochondrial biogenesis (NRF-1), mitochondrial transcription factor A (TFAM) and peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1alpha); (5) to evaluate the function of respiratory complexes I and IV. The results found in the present study revealed that: (a) the mortality rate of the animals submitted to tolerance was 10% when submitted to the lethal dose of LPS, whereas the mortality rate of the control animals was 100% when submitted to the lethal dose of LPS; (B) it was observed that the group receiving controlled doses of LPS and submitted to CLP presented a ratio equal to the control group, suggesting that oxidative phosphorylation remained the same at baseline, whereas the group that underwent CLP procedure without induction of tolerance presented worsening of the respiratory control ratio in relation to the control group; (C) the mitochondrial DNA quantification was higher in the animals submitted to CLP without prior tolerance induction, with an equal increase in mitochondrial biogenesis factors expression in relation to the other groups; (D) there was significant difference in the evaluation of the functionality of complexes I, but no difference in complex IV in all groups. It was concluded that induction of tolerance positively alters mitochondrial function in animals submitted to CLP

L’injection de cellules immunologiquement compétentes à un hôte histo-incompatible amène une réaction qui peut se traduire par la maladie du greffon-contre-l’hôte (GVHD). La GVHD demeure une barrière importante à une utilisation plus répandue de la greffe allogénique de cellules hématopoïétiques (AHCT), pourtant un traitement efficace pour traiter de nombreuses maladies. Une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent cette pathologie pourrait en faciliter le traitement et la prévention. L’Interféron-gamma (IFN-γ) et le Transforming Growth Factor-béta (TGF-β) sont deux cytokines maîtresses de l’immunité impliquées dans la fonction et l’homéostasie des cellules greffées. Nous démontrons chez la souris que l’IFN-γ limite la reconstitution lympho-hématopoïétique de façon dose-dépendante en mobilisant des mécanismes d’apoptose et en inhibant la prolifération cellulaire. Le TGF-β est quant à lui généralement connu comme un immunosuppresseur qui contrôle l’immunité en utilisant plusieurs voies de signalisation. Le rôle relatif de ces voies en AHCT est inconnu. Nous avons étudié une de ces voies en greffant des cellules provenant de donneurs déficients pour le gène SMAD3 (SMAD3-KO), un médiateur central de la voie canonique du TGF-β, à des souris histo-incompatibles. Bien que l’absence de SMAD3 ne cause aucune maladie chez nos souris donneuses, l’injection de cellules SMAD3-KO amène une GVHD du colon sévère chez le receveur. Cette atteinte est caractérisée par une différenciation Th1 et une infiltration massive de granulocytes témoignant d’un rôle central de SMAD3 dans la physiologie des lymphocytes T CD4 et des cellules myéloïdes. Nous avons focalisé ensuite nos efforts sur le rôle de SMAD3 chez les lymphocytes T CD4 en sachant que SMAD3 était actif chez les lymphocytes T CD4 tolérants. Nous avons découvert que SMAD3 était rapidement inactivé après une activation des cellules T, suggérant que l’inactivation de SMAD3 était fonctionnellement importante pour briser l’état de tolérance. Des études de micro-puces d’ADNc nous ont montré que SMAD3 contrôlait en effet l’expression de nombreux transcrits de gènes connus comme étant reliés à la tolérance et/ou à des processus biologiques dont les rôles dans le maintien de la tolérance sont plausibles. / The injection of immuno-competent cells into a histo-incompatible host can result in the development of Graft-versus-Host disease (GVHD). GVHD is the most significant barrier to a more widespread use of allogeneic hematopoietic cell transplantation (AHCT), a potent treatment for several diseases. A better understanding of the pathophysiological underpinnings of GVHD would facilitate the design of rational approaches to treat and prevent this complication of AHCT. Gamma-interferon (IFN-γ) and Transforming Growth Factor-beta (TGF-β) are master cytokines of immunity and have a role in the function and homeostasis of transplanted cells. Using a murine model, we show that IFN-γ curtails lympho-hamatopoitic reconstitution in a dose-dependent fashion by increasing apoptosis and by limiting donor cell proliferation. TGF-β is an immunosuppressive cytokine that controls immune cells through multiple signaling pathways. The relative contribution of these pathways in AHCT is unknown. We specifically studied the role of one of these pathways by transplanting SMAD3 deficient cells (SMAD3-KO) in histo-incompatible hosts. SMAD3 is a key mediator of the so-called canonical TGF-β signaling pathway. Although SMAD3-KO donor mice are healthy, the injection of SMAD3-KO cells leads to severe GVHD in the hosts, characterized by intestinal involvement associated with Th1 skewing and massive granulocyte infiltration. These findings hint at a crucial role for SMAD3 in CD4 T-cell and myeloid cell biology. We then focalized on the role of SMAD3 in CD4 T cells knowing that SMAD3 is active in tolerant, resting CD4 T cells. We found that SMAD3 was rapidly inactivated upon T cell activation, suggesting that SMAD3 inactivation was functionally important to break the state of tolerance. Our cDNA microarray experiments show that indeed, SMAD3 regulates the transcript levels of multiple genes known to be involved in T cell tolerance and in biological processes plausibly related to immune tolerance.

The entire dissertation/thesis text is included in the research.pdf file; the official abstract appears in the short.pdf file (which also appears in the research.pdf); a non-technical general description, or public abstract, appears in the public.pdf file. Title from PDF of title page (University of Missouri--Columbia, viewed on April 1, 2010). Vita. Thesis advisor: Habib Zaghouani. "May 2008" Includes bibliographical references.

L’objectif général de cette thèse était d’étudier le rôle de la protéine soluble HLA-G (sHLA- G) dans la variabilité des réponses à l’infection par P. falciparum chez la femme enceinte et son nouveau-né pendant ses deux premières années de vie. Précisément, nous avons étudié, chez les mères pendant la grossesse et leurs nourrissons de la naissance à 2 ans, les relations entre les niveaux de sHLA-G et l’infection palustre au niveau périphérique et placentaire. Nous avons également étudié les polymorphismes génétiques situés dans la région 3’UTR du gène HLA- G chez les mères et leurs nourrissons par la détermination des fréquences alléliques, génotypiques et haplotypiques afin évaluer l’impact de ces polymorphismes sur la cinétique d’expression de sHLA-G dans un contexte d’infection palustre. Nos résultats ont montré une association entre le niveau élevé de sHLA-G chez les nourrissons et l’augmentation du risque d’infection palustre au cours du trimestre suivant. Ces niveaux élevés de sHLA-G dans le sang de cordon ont été également associés au faible poids de naissance du nouveau-né. De même, nous avons trouvé une forte corrélation entre les niveaux de sHLA-G maternels dans le sang périphérique à l’accouchement et ceux de l’enfant dans le sang du cordon à la naissance. Nous avons aussi montré l’existence de trois profils d’expression de sHLA-G chez les individus inclus dans l'étude. Certains individus expriment la protéine à chaque prélèvement (HLA-G ++) alors que d’autres l’expriment par intermittence (HLA-G +-) ou ne l’expriment pas (HLA-G --). Le risque de développer un accès palustre chez les mères était respectivement trois fois plus élevé (p=0,001, OR=3,47;p=0,008, OR=3,14) chez celles appartenant au groupe HLA-G (++) et HLA-G (+-) que le groupe HLA-G (--). L’analyse génétique de la région 3’UTR du gène nous a permis de mettre en évidence huit sites polymorphes dans cette région et de construire six haplotypes correspondant (UTR 1, 2, 3, 4, 5, 6). Nous avons aussi montré chez les mères une association entre l’allèle T en position +3001 (C/T) et une expression plus fréquente de sHLA-G tandis que l’allèle C en position +3003 (T/C) et l’haplotype UTR-4 ont été associés à une expression moins fréquente de la protéine. Ces associations n’ont pas été mises en évidence chez les enfants. L’ensemble de ces résultats suggère l'implication de sHLA-G dans la sensibilité à l'infection palustre. Cette sensibilité serait, en partie, corrélée à l’inhibition des réponses anticorps spécifiquement dirigées contre P. falciparum. sHLA-G pourrait donc à terme devenir un bio-marqueur de susceptibilité au paludisme chez la femme enceinte et chez le nouveau-né au cours des premières années de vie. / The general objective of this thesis was to study the role of soluble HLA-G protein (sHLA-G) in the variability of individual response to malaria during pregnancy and during the first 2 years of infant life. Actually, we assessed the relationships between sHLA-G and malaria infection in peripheral and placental blood. We also investigated the effect of polymorphisms in the 3’UTR region of HLA-G gene in 400 mothers and their infants on the kinetic of sHLA-G expression three times during pregnancy and at 6, 9, 12, 18, 24 months of life in a context of malaria infection. Our results showed that high levels of sHLA-G increased the risk of malaria at the subsequent trimester in infants and were associated with low birth weight. We also showed a strong correlation between the plasmatic sHLA-G level of the mothers at delivery and those of newborns in cord blood. We found that the risk of developing malaria in mothers was respectively three fold higher in the HLA-G (++) (OR=3.47; p=0.001) and HLA-G(+-)(OR=3.14, p=0.008) groups compared to HLA-G (--) group. Besides, we described eight polymorphic sites in the 3’UTR corresponding to six haplotypes (UTR 1, 2, 3, 4, 5, 6) and showed in mothers, an association between the allele T at position +3001 (C/T) and a higher frequency of sHLA-G expression. However, the allele C at position +3003 (T/C) and UTR-4 were associated to a lower frequency of sHLA-G expression. In infants, no association was observed between alleles or haplotypes and expression of the soluble protein. Overall, these results suggest that sHLA-G is implicated in malaria susceptibility. This could be partly, related to the inhibition of P. falciparum-specific antibody responses. Therefore, sHLA-G might be useful as a bio- marker of malaria susceptibility during pregnancy and during the first years of infancy.

O timo é um orgão linfóide primário, no qual ocorre a indução da tolerância imunológica central aos antígenos do próprio que são expressos pelos tecidos periféricos (PTAs). A medula tímica é formada por células tímicas medulares epiteliais (mTECs) que expressam centenas desses PTAs que representam virtualmente todos os órgãos e tecidos do corpo. Esse fenômeno foi denominado de expressão gênica promíscua (PGE) a qual é parcialmente regulada pelo modulador da transcrição Autoimmune regulator (Aire). Os precursores de células T oriundos da medula óssea migram para o timo (agora são denominados de timócitos) e na medula desse órgão, passam pela seleção negativa mediada pelas mTECs. As células sobreviventes evoluem para células T maduras e funcionais que migram para a periferia com capacidade de reconhecimento das moléculas de MHC e tolerantes aos PTAs. Além de controlar a transcrição de genes PTAs, Aire também controla a expressão de microRNAs (miRNAs), relacionados com a integridade e funcionalidade do microambiente tímico. A seleção negativa no timo é um processo essencial para a manutenção da autotolerância imunológica e o desbalanço desse processo está associado com o desenvolvimento de doenças autoimunes como, por exemplo, o diabetes mellitus do tipo 1 (DM1).Tendo em vista essas premissas, nosso trabalho se fundamentou em duas hipóteses: 1) Variações na expressão do gene Aire podem perturbar a expressão de genes PTAs e miRNAs no timo, causando alterações na PGE, 2) A expressão balanceada de genes como Aire e/ou PTAs nas mTECs, é fundamental para a integridade da tolerância central. O desbalanço na expressão desses genes, está associado com a emergência do diabetes mellitus tipo 1 no camundongo. Para testar nossa primeira hipótese efetuamos o silenciamento de Aire (Aire knockdown) por meio de eletrotransfeção de RNA interferente (siRNA) anti-Aire in vivo no timo de camundongos BALB/c. Análises do transcriptoma (mRNAs) e miRNoma (miRNAs) das mTECs, revelaram que silenciamento parcial e transitório de Aire foi suficiente para afetar a expressão de PTAs Aire dependentes bem como a de miRNAs. Redes de interação miRNA-mRNA, revelaram que o controle pós-transcricional da PGE também é afetado pelo silenciamento de Aire. Os resultados encontrados revelam que Aire e miRNAs podem formar uma via essencial durante a indução da tolerância central. Para testar nossa segunda hipótese comparamos o transcriptoma de mTECs de camundongos BALB/c (linhagem não-autoimune) com mTECs de camundongos non-obese diabetic NOD (modelo animal utilizado nos estudos de DM1 autoimune). Nossos resultados revelaram que a expressão transcricional de autoantígenos relacionados ao DM1 está desbalanceada em camundongos NOD já numa fase precoce, quando esses animais ainda não apresentavam a doença clínica (fase pré-diabética). Inesperadamente, os níveis transcrionais de Aire apresentaram-se equivalentes no timo dessas duas linhagens, porém os níveis da proteína AIRE estavam reduzidos no timo da linhagem NOD. Esses resultados sugerem a participação de algum mecanismo de atenuação póstrascricional de Aire nessa linhagem provavelmente envolvendo atuação de miRNAs. Isso poderia explicar o desbalanço de PTAs Aire-dependentes e a repressão autoantígenos relacionados ao DM1. Concluímos que nossos resultados, além de abrir novas perspectivas para pesquisas nesta área, contribuem com melhor compreensão dos mecanismos moleculares desencadeados por Aire e por miRNAs no controle da expressão de autoantígenos no timo o que é importante para a tolerância imunológica central. / The thymus is a primary lymphoid organ, in which occurs in the induction of central immune tolerance to self peripheral tissue antigens (PTAs). The thymic medulla is formed by medullary thymic epithelial cells (mTECs) expressing hundreds of such PTAs representing virtually all organs and tissues of the body. This phenomenon has been termed promiscuous gene expression (PGE), which is partially regulated by the Autoimmune regulator (Aire) gene. The T cell precursors derived from the bone marrow migrate to the thymus (now termed thymocytes). A part of these thymocytes are eliminated by negative selection mediated mTEC cells. The surviving cells to evolve and functional mature T cells that migrate to the periphery and are capable of recognizing MHC molecules and are tolerant to PTAs. In addition to controlling the transcription of PTA genes, Aire also controls the expression of microRNAs (miRNAs). The negative selection in the thymus is a process essential to the maintenance of immunologic self-tolerance and imbalance of this process is associated with the development of autoimmune diseases such as type 1 diabetes mellitus (DM1) . Given these assumptions, our work was based on two hypothesis: 1) Changes in the expression of the Aire gene can disrupt the expression of PTA genes and miRNAs in the thymus, causing changes in PGE, 2) The balanced expression of Aire / or PTA genes in mTECs is fundamental for central tolerance. The imbalance in the expression of these genes is associated with the emergence of type 1 diabetes in mice. To test our first hypothesis we made Aire silencing (Aire knockdown) through electrotransfection of anti - Aire interfering RNA (siRNA) in vivo in the thymus of BALB/c mice. Analysis of the transcriptome (mRNAs) and miRNome (miRNAs) of mTECs revealed that partial and transient silencing of Aire was enough to affect the expression of Aire - dependent PTAs as well as miRNAs. miRNA -mRNA interaction networks revealed that the posttranscriptional control of PGE is also affected by the silencing of Aire. The results show that Aire and can form an miRNA pathway essential for the induction of central tolerance. To test our second hypothesis we compared the transcriptome of mTECs of BALB/c mice (non-autoimmune strain) with mTECs from non - obese diabetic NOD (animal model used in studies of autoimmune DM1) . Our results indicate that the transcriptional expression of DM1-related autoantigens are unbalanced in NOD mice in an very early stage, when these animals have not had clinical disease (pre-diabetic period). Unexpectedly, the transcriptional levels of Aire in the thymus was equivalent in these two strains, but the AIRE protein levels were reduced in thymus of NOD strain. These results suggest that some mechanism of post-transcriptional attenuation of Aire is acting in this lineage probably involving action of miRNAs . This could explain the imbalance of Aire - dependent PTAs and repression autoantigens related to DM1. Our results open perspectives for research in this area, contributing to better understanding the molecular mechanisms triggered by Aire and miRNAs in control of the expression of autoantigens in the thymus, which is important for the central immune tolerance.

Orientador: Lair Zambon / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T10:28:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PerroudJunior_MauricioWesley_D.pdf: 9913138 bytes, checksum: 5dd1ec64b004b6d50e2392e6383c9c98 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Os resultados terapêuticos globais do carcinoma de pulmão não pequenas células em estádio avançado são bem limitados. A imunoterapia com células dendríticas foi desenvolvida como uma nova estratégia para o tratamento de câncer de pulmão. O objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade, segurança e respostas imunológicas em pacientes com carcinoma de pulmão não pequenas células tratados com vacina autóloga de células dendríticas maduras pulsadas com antígenos. Cinco pacientes HLA-A2 com carcinoma de pulmão não pequenas células inoperável (estádio III ou IV) foram selecionados para receber duas doses de 5 x 107 de células dendríticas administradas por vias subcutânea e intravenosa, duas vezes em intervalos de duas semanas. A segurança, tolerabilidade e respostas imunológica e tumoral à vacina foram avaliadas pela evolução clínica e laboratorial, ensaio de linfoproliferação e critérios de RECIST, respectivamente. A dose utilizada para a imunoterapia demonstrou ser segura e bem tolerada. O ensaio de linfoproliferação mostrou uma melhora na resposta imune específica após a imunização, com uma resposta significativa após a segunda dose (p = 0,001). Esta resposta não foi persistente e houve uma tendência à redução após duas semanas da segunda dose da vacina. Dois pacientes apresentaram uma sobrevida quase duas vezes maior que a média esperada e foram os únicos que expressaram os antígenos tumorais HER-2 e CEA Apesar do pequeno tamanho da amostra, os resultados sobre o tempo de sobrevida, resposta imune, segurança e tolerabilidade, combinado com os resultados de outros estudos, são animadores para a condução de um estudo clínico com doses múltiplas em pacientes com câncer de pulmão que foram submetidos a tratamento cirúrgico, seguindo as diretrizes do Cancer Vaccine Clinical Trial Working Group / Abstract: Overall therapeutic outcomes of advanced non-small-cell lung cancer (NSCLC) are poor. The dendritic cell (DC) immunotherapy has been developed as a new strategy for the treatment of lung cancer. The purpose of this study was to evaluate the feasibility, safety and immunologic responses in use in mature, antigen-pulsed autologous DC vaccine in NSCLC patients. Five HLA-A2 patients with inoperable stage III or IV NSCLC were selected to receive two doses of 5x107 DC cells administered subcutaneous and intravenously two times at two week intervals. The safety, tolerability and immunologic and tumor responses to the vaccine were evaluated by the clinical and laboratorial evolution, lymphoproliferation assay and RECIST's criteria, respectively. The dose of the vaccine has shown to be safe and well tolerated. The lymphoproliferation assay showed an improvement in the specific immune response after the immunization, with a significant response after the second dose (p = 0.001). This response was not long lasting and a tendency to reduction two weeks after the second dose of the vaccine was observed. Two patients had a survival almost twice greater than the expected average and were the only ones that expressed HER-2 and CEA together. Despite the small sample size, the results on the survival time, immune response, and safety and tolerability, combined with the results of other studies, are encouraging to the conduction of a large clinical trial with multiples doses in patients with early lung cancer who underwent surgical treatment, following the guidelines of the Cancer Vaccine Clinical Trial Working Group / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Ciências