La greffe d'îlots de Langerhans permet de traiter le diabète de type 1 en restituant une insuline-sécrétion. La moitié des patients reprend l'insuline dans les 5 ans. Cette perte de fonction s'explique par l'absence d'outils de monitoring. Le but de notre travail était de déterminer l'efficacité de l'IRM à diagnostiquer un rejet de greffe, et d'évaluer l'intérêt du monitoring cellulaire chez les patients.Imagerie IRM chez le ratMéthodes : Des îlots syngéniques, allogéniques ou xénogéniques ont été greffés par voie intra-portale à des rats diabétiques après marquage avec une nanoparticule de fer (ferucarbotran). Les IRM étaient réalisées dans une IRM clinique 3T.Résultats : La décroissance du signal était différente suivant les 3 types de greffes. Le signal IRM des greffes allogéniques était significativement plus bas à J4 alors que la glycémie était normale. En prenant un seuil de 84% à J4, l'IRM permet d'obtenir une sensibilité de 91% et une spécificité de 70% Innnuno-monitoring cellulaireMéthodes : Des réactions lymphocytaires mixtes étaient réalisées entre les PBMC des patients greffés, et les splénocytes des donneurs. La réaction immunitaire était évaluée par la sécrétion d'IFNy (ELISpot), par la prolifération cellulaire (cytométrie du flux du Ki67), et par le dosage des cytokines (Bioplex). Le résultat était corrélé à la fonction du greffon évaluée par le (3-score).Résultats : Les patients avec une mauvaise fonction montraient une plus grande réactivité anti-donneur avec l'ELISpot IFNy (p=0,007, r=-0,50) et l'index de prolifération (p=0,006, r=-0,51). Les patients avec une mauvaise fonction avaient des taux d'IFNy, IL-5 et IL-17 plus élevés. / Langerhans islet transplantation allows curingtype 1 diabetes by restoring an endogenous insulin secretion. Halfof patients will resume insulin withinyears. This loss of function may be explained by the lack of monitoring tools able to diagnose an ongoing graft failure. The aims of our work were toevaluate the efficiency of MRI to diagnose islet graft rejection, and to assess the feasibility of immune cellular monitoring in transplanted patients.MRI in the rat mortelMethods: Syngeneic, allogeneic and xenogeneic islets were transplanted intra-portally to diabetic rats after labeling with superparamagnetic ironoxide nanoparticles (ferucarbotran). Images were acquired on a clinical 3T MRI scanner.Results: The signal decreasing was different between the 3 types of transplantations. At day 4, the MRI signal in allogeneic group was significantlylower while glycaemia remained normal. With a cut-off value of 84% at day 4, sensitivity of 91% and specificity of 70% were obtained.Cellular immune monitoringMethods: Mixed lymphocyte cultures were performed with peripheral blood mononuclear cells from recipients and splenocytes from donors. Immunereactivity was assessed by the release of IFNy (ELISpot), cell prolifération (flow cytometry of Ki67), and cytokine quantification (Bioplex). Theresults were correlated to the islet graft function assessed by (5-score.Results: Patients with low islet function showed higher cellular reactivity against donor cells assessed by ELISpot IFNy ((p=0,007, r=-0,50) andproliferation index (p=0,006, r=-0,51). Patients with low graft function had higher levels of IFNy, IL-5 and 1L-17.

La thérapie génique consiste à introduire du matériel génétique dans des cellules dans l’objectif de traiter une pathologie. Le plus souvent, la thérapie génique s’effectue au moyen d’un vecteur viral, transportant le gène jusque dans les cellules cibles. Dans le cas des maladies monogéniques, l’adeno-associated virus (AAV) s’est imposé progressivement comme un vecteur de choix. Son absence de pathogénicité, son large tropisme et sa capacité à transduire des cellules quiescentes sont autant d’avantages comparés à d’autres vecteurs utilisés en thérapie génique. L’utilisation d’AAV est approuvé en Europe pour le traitement d’un déficit rare en lipoprotéine lipase et vient récemment d’être approuvé par les autorités américaines pour le traitement d’un déficit de la vision. Toutefois, les essais de thérapies géniques se heurtent souvent aux réponses immunitaires dirigées contre l’AAV. En effet, les différents composants de ce vecteur viral ont été identifiés comme pouvant déclencher des réponses immunitaires s’opposant à l’efficacité à long terme de la thérapie génique. De plus, la protéine transgénique peut s’avérer immunogène, ce qui conduit au déclenchement de réponses immunitaires, à la destruction des cellules transduites et in fine à l’échec de la thérapie génique. En clinique, des immunosuppresseurs sont utilisés pour palier à ses effets indésirables. Toutefois, de par leurs effets secondaires infectieux et tumorigènes, des stratégies visant plutôt à induire de la tolérance vis-à-vis de la protéine transgénique, associées à un bénéfice pour la santé des patients, se sont développées.L’objectif de ce travail de thèse a été d’implémenter une nouvelle stratégie visant à étudier l’effet immunorégulateur et tolérogène de protéines de fusion dérivées de CTLA-4/Fc et de PD-L1/Fc. Pour cela, nous avons utilisé un modèle murin récapitulant les réponses immunitaires induites par un AAV permettant l’expression d’une protéine modèle fortement immunogène, l’ovalbumine (Ova). Ensuite, des AAV codant pour les protéines au potentiel immunorégulateur ont été synthétisés et injectés aux souris conjointement à l’AAV-Ova. Cette stratégie d’immunorégulation vectorisée (VIR) nous a permis d’évaluer la capacité de chacune des protéines à moduler les réponses immunitaires dirigées contre l’Ova directement in vivo. Au total, ce travail a permis de mettre en évidence i) l’intérêt et les limites de la stratégie VIR, ii) celui du rôle délétère de CTLA-4/Fc au long terme sur les lymphocytes Tregs CD4+FoxP3+, périphériques et centraux, iii) et de démontrer l’intérêt de 2 nouvelles molécules dérivées PD-L1/Fc sur la persistance de l’Ova. / Gene therapy consist into introducing genetic material into cells to treat genetic disorders. Most gene therapies use viral vectors to carry the gene within target cells. In case of monogenic disorders, adeno-associated viruses (AAV) has become a vector of choice because of its lack of pathogenicity, its large tropism and its capacity to transduce quiescent cells. The use of AAV is approved in Europe to treat a rare lysosomal storage disease and has recently been approved by the FDA to treat a genetic cause of blindness. However, most clinical trials face immune responses directed against AAV components which may be highly immunogenic. This deleterious immunogenicity often lead to the trial failure. In addition, transgenic protein can also be immunogenic, aimaing to the destruction of transduced cells and ultimatly to gene therapy failure. In clinic, immunosuppressive drug remain the only option to counteract unwanted immune responses. These drugs possess infectious and tumorigenic side effects, therefore strategies aiming to rather capable to induce tolerance toward the transgenic protein are being developped and needed. The objectif of this work was to implement a new strategy aiming to study the immunoregulatory and tolerogenic effect of fusion proteins derived from CTLA-4 and PD-L1. We used a murin model recapitulating the immunes responses induced by an AAV coding for an immunogenic model protein, ovalbumin (Ova) presented in previous studies by our group and others. Then, we synthesized AAV coding for our newly designed immunoregulatory protein and injected them into mice along with AAV-Ova. This strategy of vectorized immunoregulation (VIR) allowed to evaluate the intrinsic capacity of each individual proteins to modulate immune responses against Ova directly in vivo. Eventually, this work allow to 1) assess the benefits and limits of the VIR strategy, 2) the deletrious long-term effects of CTLA-4/Fc on central and peripheral Tregs in mice, 3) to demonstrate the interest of new molecules specifically derived from PD-L1/Fc over the immune tolerance through the long-term persistance of Ova transgene.

Le syndrome d'Evans est défini par l'existence concomitante ou séquentielle de cytopénies auto-immunes, le plus souvent, anémie hémolytique et thrombopénie immunologique. Chez l'enfant, il peut être secondaire à une infection, une maladie auto-immune systémique ou un déficit immunitaire primitif. Alternativement, chez une grande partie des patients, l'étiologie n'est pas clairement identifiée. Les patients atteints de syndrome d'Evans présentent parfois d'autres atteintes, telles une auto-immunité d'organe, une lymphoprolifération bénigne ou un déficit immunitaire. L'objectif de ce travail était d'identifier des causes génétiques chez des enfants présentant un syndrome d'Evans sans étiologie sous-jacente identifiée. Nous avons centré notre étude sur des formes sévères à début pédiatrique en faisant l'hypothèse qu'une maladie monogénique serait plus fréquente dans ce groupe de patients. Nous avons mis à profit les technologies de séquençage haut débit « nouvelle génération » (NGS) pour réaliser et analyser le séquençage de l'exome de patients et de certains de leurs apparentés afin de mettre en évidence des gènes candidats potentiels. Ce travail a permis l'identification de 4 gènes candidats : LRBA, CTLA-4, STAT3 (mutations gain de fonction) et NFKBIA. L'implication des 3 premiers gènes dans de nouvelles maladies monogéniques où l'auto-immunité est au premier plan a été confirmée par d'autres équipes au cours de ce travail. Pour chacun de ces gènes, nous avons poursuivi 2 objectifs complémentaires : d'une part, tenter de valider l'implication des gènes identifiés dans la maladie des patients. Nous avons pour cela utilisé des approches et techniques variées : biochimie et protéomique afin d'identifier des partenaires protéiques, microscopie confocale pour localiser les protéines et leurs interactions, tests cellulaires in vitro pour mettre en évidence un défaut fonctionnel, marquages en cytométrie en flux pour identifier des modifications dans les sous-populations lymphocytaires. D'autre part, nous avons recherché d'autres mutations de ces gènes chez des patients de phénotype clinique similaire. Nous avons ainsi constitué et exploré 3 cohortes de patients présentant des mutations de LRBA, CTLA-4 ou STAT3. Nous avons rassemblé une cohorte de 18 patients porteurs d'une mutation de LRBA, répartis dans 11 familles. Cela nous a permis de préciser et d'étendre le spectre clinique de cette maladie de découverte récente, avec en particulier des atteintes articulaires sévères s'associant à un diabète précoce, ou des entéropathies. Nous avons identifié 15 nouvelles mutations de transmission autosomique récessive dans le gène LRBA, codant une protéine de fonction inconnue dont l'absence entraine une maladie principalement caractérisée par une poly-auto-immunité. Nous avons identifié 29 partenaires protéiques potentiels de LRBA et précisé la localisation de LRBA dans les différents compartiments cellulaires. Nous avons également établi une cohorte de 12 patients dans 10 familles présentant un déficit en CTLA-4 par haplo-insuffisance. Au delà de la mise en évidence de 9 nouvelles mutations, nous avons décrit une famille où la variation est transmise de façon autosomique récessive. Dans les déficits en LRBA et CTLA-4, nous avons mis en évidence une diminution du pourcentage de lymphocytes T régulateurs parmi les PBMC et une diminution de l'expression de CTLA-4 dans les lymphocytes T activés. Ceci corrobore l'interaction entre ces 2 protéines décrite en parallèle par une autre équipe. Nous avons montré que les spectres cliniques des déficits en LRBA et CTLA-4, fortement chevauchant dans les premières descriptions publiées, pourraient se différencier, malgré l'implication des lymphocytes T régulateurs dans ces 2 maladies. (...) / Evans syndrome is defined by the occurence of autoimmune cytopenias, either at the same time or sequential, mainly autoimmune hemolytic anemia and immune thrombocytopenia. In children, it may be secondary to infections, systemic autoimmune disease, or primary immune deficiency, though in most patients, its etiology isn't obvious. Patients affected with Evans syndrome can also present other features, such as autoimmunity toward a particular organ, benign lymphoproliferation or immunodeficiency. The main goal of this work was to identify genetic causes in children presenting an Evans syndrome without a known underlying etiology. We focused our study on severe, early onset forms of the disease, with the hypothesis that a monogenic disease would be more frequent in this group of patients. Taking advantage of high throughput "Next Generation" sequencing (NGS) techniques, we sequenced and analyzed exome from patients and their relatives in search for adequate candidate genes. We identified 4 candidate genes: LRBA, CTLA-4, STAT3 (gain-of-function mutations), and NFKBA. Implication of the first 3 genes in new monogenic diseases with autoimmunity as a key feature was also confirmed by others during the course of this work. For each gene, we pursued 2 complementary goals: First, we sought to validate the implication of the gene in the patients' disease. To do so, we used various techniques and approaches: biochemistry and proteomics to identify protein partners, confocal microscopy to localize proteins and interactions, in vitro cellular assays to bring to light functional defect, flow cytometry to identify changes in lymphocytes subpopulations. We also looked for other mutations of each gene in patients with a similar clinical presentation. Hence we created and explored 3 cohorts of patients presenting with mutations of LRBA, CTLA-4 or STAT3. We constituted a cohort of 18 patients with LRBA mutations within 11 families. We then were able to precise and extend the clinical spectrum of this recently described disease. In particular, we observed patients with severe chronic arthritis associated with diabetes mellitus or enteropathies. We identified 15 new mutations of autosomal recessive transmission in the LRBA gene, coding a protein of unknown function, which absence is responsible for a disease mainly characterized by autoimmune features. We identified 29 candidate protein partners of LRBA and precized LRBA localisation in cell compartiments. We also established a cohort of 12 patients within 10 families presenting CTLA-4 haploinsufficiency. Beyond describing 9 new mutations, we report a family with autosomal recessive transmission.In LRBA and CTLA-4 deficiencies, we showed a decrease of regulatory T lymphocyte subset proportion among PBMC and a decrease of CTLA-4 expression in activated T cells. These results support the interaction between these 2 proteins, described concurrently by another team. We showed that the clinical spectra of these 2 diseases, although widely overlapping in first published reports, could be different despite a role of regulatory T cells in both. Hence, organ-specific autoimmunity and lymphoproliferation are more frequent in LRBA deficiency whereas granuloma and hypogammaglobulinemia are more present in CTLA-4 deficiency. Theses results suggests a role of genetic modifyers, which remain to identify. Among our cohort of patients with Evans syndrome, we also identified 5 patients within 5 families presenting gain-of-function mutations of STAT3. 3 of those mutations were reported by others during our work and appeared de novo in our patients. Functional validation of the 4th one is in progress. The last mutation follows a recessive transmission and could exemplify a new transmission modality of this disease. (...)