Thèse d'exercice : Médecine. Médecine générale : Paris 12 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. f. 80-85.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine : Nancy 1 : 2003. / Titre provenant de l'écran-titre.

La vaccination est un moyen de prévention très efficace contre les infections. La majorité des vaccins sont administrés par voie sous-cutanée ou intra-musculaire avec des adjuvants et stimulent ainsi des réponses immunitaires adaptatives systémiques. Les muqueuses représentent une porte d’entrée majeure pour de nombreux pathogènes ayant un impact en Santé Publique. Cependant, peu de vaccins sont délivrés par les muqueuses en raison du manque d’adjuvants adaptés à ces voies. Ainsi le développement d'adjuvants muqueux permettrait la stimulation de réponses immunitaires locales et une protection efficace avant la dissémination des pathogènes. Les agonistes des Toll-Like-Receptors (TLR) sont développés comme adjuvants vaccinaux car ils stimulent l’immunité innée et adaptative. Au laboratoire, la flagelline de Salmonella enterica qui est un puissant agoniste de TLR5 est utilisée comme modèle afin de disséquer les mécanismes d’action des adjuvants muqueux. En effet, l'administration intranasale de vaccins adjuvantés par la flagelline se caractérise par une réponse T CD4+ de type Th1/Th2, une réponse en anticorps sécrétoires dans le compartiment respiratoire et une réponse systémique contre les antigènes vaccinaux. Seule l’activation de TLR5 dans le compartiment épithélial est nécessaire à l’activité adjuvante.Dans un premier temps, l'analyse transcriptionnelle du tissu pulmonaire a permis d'identifier une signature épithéliale spécifique du recrutement de cellules immunitaires, en particulier de monocytes et de neutrophiles ainsi que de l'activation fonctionnelle des cellules dendritiques. L'analyse de la dynamique cellulaire au niveau du tractus respiratoire et des ganglions drainants a ensuite été réalisée en réponse à l’administration intranasale de vaccin adjuvanté. Bien que les monocytes inflammatoires et les neutrophiles infiltrent massivement les poumons et capturent les antigènes, ils ne jouent pas de rôle majeur dans l’activation de la réponse immunitaire. Au contraire les cellules dendritiques conventionnelles CD11b+ capturent, migrent et présentent efficacement l’antigène aux lymphocytes T CD4+. A l'instar de l’effet adjuvant, l’activation de ces cellules dendritiques par la flagelline n'est pas directe mais requiert une expression de TLR5 dans les cellules structurales incluant les cellules épithéliales de la muqueuse. De plus, nos travaux suggèrent que les interleukines de la famille IL-1 ne sont pas à l'origine de la transactivation des cellules dendritiques.En conclusion, ce travail de thèse ouvre des perspectives intéressantes quant au développement d’adjuvants muqueux. / Many pathogens of public health concern (including the influenza and respiratory syncytial viruses, and bacteria such as Streptococcus pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa) enter the body via the respiratory tract in general and the lung mucosa in particular. Mucosal vaccines induce a local adaptive immune response (i.e. secretory antibodies and specific T cells) and constitute a unique means of directly preventing these infections. Most vaccines are delivered systemically and use systemic adjuvants. Although the few commercially available mucosal vaccines are generally effective, mucosal adjuvant candidates have not demonstrated sufficient levels of potency and safety. TLR signaling is instrumental for the induction of innate immunity and the concomitant ignition of adaptive immune responses. Thus TLR agonists are largely used as vaccine adjuvants. In the lab we use flagellin from Salmonella enterica (a potent TLR5 agonist) as a model to better understand the mode of action of mucosal adjuvants. The intranasal adjuvant effect of flagellin is characterized by an antigen-specific Th1/Th2 cell response, and a strong mucosal and systemic antibody response. However this adaptive immune response mainly depends on TLR5-mediated epithelial signaling.We used molecular profiling to show that cytokine/chemokine and dendritic cell maturation pathways are surrogate signatures for flagellin activation in the lung. Neutrophils and inflammatory monocytes were massively recruited to the lungs but were not essential for the adjuvant activity. In contrast, flagellin signaling did not induce a significant recruitment of conventional dendritic cells but enhanced their maturation and migration to the lymph nodes. In particular, CD11b+ migratory dendritic cells were essential for induction of a CD4+ T-cell response. Importantly, the functional activation of dendritic cells was independent of direct signaling via TLR5, suggesting the role of inflammatory cytokines produced by the activated epithelium. However or data suggest that IL-1 and IL-36 interleukins are not responsible for transactivation of dendritic cell. In conclusion, this thesis project opens up new perspectives for the development of mucosal adjuvants.

Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) sont des cellules immunorégulatrices qui s’accumulent massivement dans le microenvironnement (ME) tumoral. Chez les patients atteints de cancer de l’ovaire (CO) ou de mésothéliome pleural malin (MPM), leur densité est associé à un mauvais pronostic. Le projet est porté sur la caractérisation des mécanismes impliqués dans leur recrutement et leur polarisation. L’éctonucléotidase CD39 hydrolyse l’ATP enadénosine extracellulaire, présentant des propriétés immunosuppressives. Nous avons montré que les TAMCD14+CD163+ isolés de CO et les M générés in vitro en présence de M-CSF, expriment un niveau élevé de CD39membranaire comparativement aux M immunostimulants. L’inhibition de CD39 diminue les fonctions immunorégulatrices des M CD163+CD39+high (i.e. IL-10 etPD-L1). Nous avons identifié la cytokine IL-27, sécrétée parles neutrophiles infiltrants la tumeur, comme rhéostat de l’expression de CD39. En conséquence, neutraliser l’IL-27pendant la différenciation des M en présence de M-CSF diminue l’expression de CD39 et PD-L1 ainsi que la sécrétiond’IL-10 par ces M . Parallèlement, nous avons montré que les effusions pleurales du MPM induisent la migration des monocytes via CCL2, polarisent les monocytes en MCD163+ et protègent des cellules tumorales de l’effet des agents cytotoxiques. L’ensemble de ces résultats suggère que le ciblage du recrutement (CCL2) et des molécules impliquées dans la polarisation des TAM (ligands du MCSFR,IL-27, CD39) représentent de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement de certaines tumeurs solides. / Tumor-associated macrophages (TAM) are immunosuppressive cells that can massively accumulate in the tumor microenvironment (ME). In patients with ovarian cancer (OC) and malignant pleural mesothelioma (MPM), their density is correlated with poor prognosis. Targeting mediators that control the recruitment or the polarization of immunoregulatory macrophages (M ) represents therapeutic challenge to overcome tumor-associated immunosuppression. The ectonucleotidase CD39 hydrolyzes ATP into extracellular adenosine that exhibits potent immunosuppressive properties. We report here thatCD14+CD163+ TAM isolated from OC patients and Mgenerated in vitro with M-CSF, express high levels of the membrane ectonucleotidase CD39 compared to classically activated M . CD39 blockade diminished some of the immunosuppressive functions ofCD163+CD39hugh, such as IL-10 secretion. We identified the cytokine IL-27, secreted by tumorin-filtrating neutrophils, located close to infiltratingCD163+ M , as a major rheostat of CD39 expression and consequently, on the acquisition of immunoregulatory properties by macrophages. Accordingly, the depletion of IL-27 down-regulatedCD39, PD-L1 expression as well as IL-10 secretion byM-CSF-M . In parallel, we showed that pleural effusion of MPM induced monocytes migration via CCL2, the polarization of monocytes into CD163+ and induced protection to tumor cell death after chemotherapeutic treatments. Collectively, these data suggest that targeting the recruitment (CCL2) or molecules that maintain the immunosuppressive phenotype of TAM(CD39, drived by IL-27 and M-CSFR ligands) could give substantial benefit to the treatment of some solid tumors.

La vaccination est l’une des interventions humaines ayant le plus contribué à la diminution de la mortalité reliée aux maladies infectieuses. Les succès enregistrés par les vaccins traditionnels, composés de pathogènes atténués ou inactivés, ont été obtenus principalement grâce à la stimulation d’anticorps neutralisants. Or, ce corrélat de protection immunologique ne convient plus aux nouveaux pathogènes émergeants tels que le virus de l’hépatite C ou le virus de l’immunodéficience humaine, qui requiert également la stimulation d’une réponse de type cellulaire forte. Une solution intéressante à ce problème est l'ajout d'un adjuvant au vaccin, une méthode reconnue pour augmenter l'ampleur et la diversité de la réponse immunitaire contre le vaccin. Cependant, peu d’adjuvants sont reconnus pour leur capacité à générer des réponses cellulaires et aucun n’est disponible en vaccination humaine en Amérique du nord. A cet effet, les pseudo-particules virales (PPVs) du virus de la mosaïque de la papaye (PapMV) ont précédemment démontré un certain potentiel adjuvant au niveau de la réponse cellulaire. L’objectif de ma thèse de doctorat a donc été d’étudier le potentiel adjuvant des PPVs du PapMV sur des vaccins commerciaux, ainsi que sur des cibles protéiques complètes. Dans un premier temps, nous avons évalué l’effet adjuvant des PPVs de PapMV sur le vaccin inactivé utilisé pour lutter contre le virus influenza. Ensuite, nous avons évalué l’effet de cet adjuvant, ainsi que d’une version de haute avidité, sur la nucléoprotéine (NP) du virus influenza, une cible intéressante dans le développement d’un vaccin universel contre cet important pathogène. Finalement, nous avons évalué la possibilité de développer un vaccin candidat contre le virus de l’hépatite C (VHC) basé uniquement en tout ou en partie sur la protéine de coque du VHC, protéine la plus conservée du virus, en combinaison avec notre adjuvant. Globalement, l’adjuvant s’est avéré efficace à augmenter l’immunogénicité de l’ensemble des cibles vaccinales utilisées et a même contribué à augmenter l’effet protecteur généré par le vaccin inactivé et la protéine NP contre le virus de l’influenza. Son utilité pour le développement d’un vaccin protecteur contre l’hépatite C, comprenant uniquement la protéine de coque, reste à déterminer. / Vaccination is one of the human interventions that having the most contributed to the decrease of mortality attributed to infectious diseases. The successes recorded by the traditional vaccines, composed of attenuated or inactivated pathogens, were principally obtained by the induction of neutralizing antibodies. Now, this correlate of immunologic protection is no longer suitable for new emergent pathogens such as the hepatitis C virus or the human immunodeficiency virus that equally require the stimulation of a strong T-cell response. An interesting solution to this problem is the addition of adjuvants to vaccines, a method known to increase the breadth and diversity of the immune response against the vaccine. However, few adjuvants are known for their ability to generate cellular responses and no adjuvant of this type is available for human vaccination in North America. To this end, the virus-like particles (VLP) of Papaya mosaic virus (PapMV) have previously demonstrated potential adjuvant effect towards the cellular responses. The objective of my Ph.D. thesis was to study the adjuvant potential of the PapMV VLPs on commercial vaccines and on complete protein targets. First, we evaluated the effect of PapMV VLPs adjuvant on the inactivated vaccine used to fight the influenza virus. Secondly, we evaluated the adjuvant effect of this adjuvant, and the high avidity version, on the nucleoprotein (NP) of influenza virus, a promising target to develop a universal vaccine against this important pathogen. Finally, we evaluated the possibility of developing a candidate vaccine against the hepatitis C virus (HCV) based in whole or in part on the core protein of HCV, the most conserved protein of the virus, in combination with our adjuvant. Overall, the adjuvant was effective of increasing the immunogenicity of all vaccine targets used and even helped to increase the protective effect generated by the inactivated influenza vaccine and the NP protein. Its usefulness for the development of a protective vaccine against hepatitis C based solely on the core protein, remains to be determined.

Les stratégies de traitement biologiques ciblant le TNF-α se sont avérées efficaces pour réduire l'inflammation et les symptômes cliniques dans plusieurs maladies inflammatoires chroniques et sont maintenant couramment utilisées pour les patients qui ne répondent pas aux AINS au cours de la spondyloarthrite (SpA). Cependant, 30 à 40% des patients ne répondent pas aux anti-TNF, et il est actuellement impossible de prédire la réponse des patients à ces biomédicaments. Pour améliorer les résultats cliniques, nous avons besoin d’une part d’une meilleure compréhension des mécanismes d’action des anti-TNF sur le système immunitaire, et d’autre part de biomarqueurs permettant de prédire la réponse à ces biomédicaments afin de guider la décision thérapeutique. Mon projet de doctorat a porté sur deux objectifs complémentaires: (i) l'objectif principal était de progresser dans notre compréhension des mécanismes pathogéniques impliqués dans la SpA axiale et de définir de quelle façon les anti-TNF-α affectent les réponses immunitaires des patients, (ii) de développer des biomarqueurs pour prédire la réponse thérapeutique aux inhibiteurs du TNF. En collaboration avec l'équipe du Pr. Dougados à l'Hôpital Cochin, nous avons recruté deux cohortes indépendantes de patients SpA ayant une maladie active et pour lesquels nous avons collecté des échantillons de sang avant l'initiation du traitement par anti-TNF puis 1 semaine et 3 mois après le début du traitement. Les réponses immunitaires de ces patients ont été analysées à l'aide de tests hautement standardisés réalisés ex-vivo sur sang circulant. Ces tests "TruCulture" se présentent sous forme de seringues, dans lesquelles 1 ml de sang total est mis à incuber avec un stimulus spécifique ; 20 stimuli différents ont été testé et validé avant et après traitement dans les deux cohortes de patients. Nous avons observé une réduction très significative de la sécrétion de IL-1ra, IL-1β, IL-8, and MIP-1β en réponse à des stimuli microbiens et à des agonistes des TLR dans les échantillons de sang prélevés 7 jours et/ou 3 mois après le début du traitement. Pour identifier les bases moléculaires de l’action des inhibiteurs du TNF nous avons analysé l'expression des gènes dans ces différentes conditions de stimulation. L'analyse bioinformatique quantitative de l'expression des gènes (QuSAGE) a révélé que les gènes les plus modulés par le traitement anti-TNF étaient NF-KB et les gènes cibles de NF-kB, y compris le TNF lui-même et l’IL1B. Nos données suggèrent que les inhibiteurs du TNF agissent principalement en perturbant une boucle autorégulatrice pilotée par NF-kB. Afin d'identifier les signatures immunologiques de réponse aux anti-TNF avant le début du traitement, nous avons corrélé les réponses immunitaires chez les patients analysés au temps 0 à la réponse thérapeutique aux anti-TNF mesurée à 3 mois. Nos résultats suggèrent que les patients atteints de SpA et exprimant des niveaux inférieurs de PAX5 et des niveaux supérieurs de SPP1 en réponse à la stimulation avec SEB avant l'initiation de la thérapie anti-TNF ont les meilleures réponses thérapeutiques. Notre recherche montre que les tests TruCulture sont un outil efficace pour étudier les fonctions immunitaires chez les patients atteints de SpA et que les effets du traitement anti-TNF peuvent être mesurés lorsque les cellules immunitaires sont stimulées. En terme de recherche translationnelle, nous avons identifié des molécules qui pourront être utilisés comme biomarqueurs pour aider les cliniciens à prédire les réponses thérapeutiques aux traitements anti TNF / The introduction of anti-TNF therapy has proven effective to reduce inflammation and clinical symptoms in several chronic inflammatory diseases. However, 30-40% of patients do not respond to TNF blockers and it is currently not possible to predict responsiveness of patients to anti-TNF therapy. Furthermore, their impact on the immune system is incompletely understood. The goals of my PhD project were (i) to define the impact of anti-TNF therapy on immune responses to microbial challenges and stimuli targeting specific immune pathways in spondyloarthritis (SpA) patients, and (ii) to identify immunological correlates associated with therapeutic responses to TNF-blockers.Using a set of whole-blood, syringe-based assays to perform ex vivo stimulation while preserving physiological cellular interactions (TruCulture assays), we have performed a pilot study in SpA patients and investigated immune responses to 20 different stimuli before and 3 months after initiation of anti-TNF therapy. These findings were validated in a replication cohort, also assessing the effects of anti-TNF agents after only one week of treatment. We observed a highly significant reduction of the secretion of IL-1ra, IL-1β, IL-8 and MIP-1β in response to selected stimuli after 3 months of treatment compared to the baseline. Interestingly, these changes were already detectable after a single injection of an anti-TNF agent. To gain insight into the molecular mechanism of TNF blockers, we profiled gene expression in the stimulation cultures from all patients. Quantitative set analysis for gene expression (QuSAGE) revealed that the gene modules most affected by anti-TNF therapy are NF-kB transcription factors and inhibitors and NF-kB target genes, including TNF itself and IL1B. Our data suggest that TNF-blockers primarily act by disrupting an autoregulatory loop driven by NF-kB. We also tested whether there is a correlation between the responses of immune cells to specific stimuli and the clinical response to TNF-blockers. The decision tree model that we trained and validated suggests that SpA patients who expressed lower levels of PAX5 and higher levels of SPP1 in response to SEB stimulation before initiation of anti-TNF therapy had the best therapeutic responses. Our study shows that TruCulture assays are an efficient and robust tool to monitor immune functions in SpA patients and that the effects of anti-TNF therapy can be measured when immune cells are challenged, but not at steady state. Our data also indicate that analyzing immune responses in patients before therapy is a promising strategy to develop biomarkers for prediction of therapeutic responses to TNF-blockers

Une tumeur est un environnement complexe comprenant à la fois des composants immunitaires et non immunitaires. Dans notre équipe, nous avons démontré précédemment le rôle des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans les cancers du poumon, dans la génération de réponses anti-tumorales protectrices. Cependant, les tumeurs peuvent se développer en utilisant des mécanismes d’immunosuppression tels que l’infiltration des cellules T régulatrices (Tregs) dans le microenvironnement tumoral. Cette thèse a étudié le mécanisme présumé des Tregs dans la régulation des réponses immunitaires dans le cancer du poumon. Cette étude démontre la présence de Tregs FoxP3+ dans les TLS aussi bien que dans les autres régions tumorales. Les Tregs infiltrant la tumeur (Ti-Tregs) présentent un phénotype de lymphocytes T à mémoire centrale, et effecteur mémoire. Ces cellules expriment un vaste répertoire de molécules d’activation et de « chekpoints » immunologiques. L’analyse de l’expression des gènes et des résultats de cytométrie en flux a montré que les Tregs expriment des marqueurs de co-stimulation et de co-inhibition. Une forte densité de Ti-Tregs dans les TLS ou les autres régions tumorales, est associée à une faible survie des patients. Lorsqu’on combine ce résultat avec la densité de DC matures ou lymphocytes B associés aux TLS ou CD8+, un groupe de patients présentant de faible densités de ces cellules mais de fortes densités en Tregs a le pronostic le moins favorable avec le plus grand risque de décès. Les Tregs créent un environnement immunosuppresseur dans les cancers pulmonaires. Ce mécanisme pourrait être une explication de la réduction observée de la survie de ces patients. / Tumor comprise complex niche of the immune and non-immune components. The complex interaction between the tumor cells with its environment turns into either eradication or the growth and metastasis of the tumors. We have previously demonstrated the role of TLS (tertiary lymphoid structures) in lung tumors, in protective anti-tumor responses. Despite of this, tumors do develop via exploiting the regulatory mechanisms, particularly includes, infiltration of the Tregs (regulatory T cells). The aim of thesis was to study the putative role of Tregs in regulating the immune responses in lung cancer. This study strongly demonstrates the presence of FoxP3+ Tregs in the TLS as well as non-TLS areas of the lung tumors. Tregs mainly exhibit central and effector memory phenotype expressing vast repertoire of the activation and immune checkpoint molecules. The gene expression and flow cytometry data showed that Tregs express the co-stimulatory and inhibitory markers which are known to be involved in the their activation and immune suppression. The high density of the Ti-Tregs either in TLS or in nonTLS areas is associated with the poor survival of the NSCLC patients. When combined with the density of TLS mature DC or B cells or CD8+ T cells, a group of patients with the low DC, B cells and CD8+ T cells but high Tregs densities, had the worst clinical outcome. This allowed, to identify the NSCLC patients with highest risk of death. Thus, it be concluded that the Tregs create the immunosuppressive environment in the lung tumors by acting in both TLS and nonTLS areas of the tumors and thus could be possible reason for the reduced survival of the lung cancer patients.

The failure of the immune system to provide efficient protection against tumour cells has been considered as a major issue in immunology. It is now well established that inadequate function of the host immune system is one of the main mechanisms by which tumours escape from immune control contributing to the limited success of cancer immunotherapy. Several cell populations have been described which display immunosuppressive properties and may impede tumor-specific immunity. Among them, GR1+CD11b+ immature myeloid suppressor cells and CD4+CD25+ regulatory T cells seem to play an important role. These cells accumulate in the spleens of tumour bearing mice and patients with cancer and contribute to immunosuppression by inhibiting the function of CD8+ T cells and/or by promoting tumour angiogenesis.<p><p>The aim of our work was to define the mechanisms by which a single dose of cyclophosphamide (CTX), a chemical agent commonly used in chemotherapy treatment, induces the rejection of established P815 mastocytoma. <p><p>Our data show that CTX treatment leads to the selective loss of GR1medCD11b+ splenic myeloid cell producing TGF-â, a cytokine which is known to suppress antitumoral response. Furthermore, injection of CTX causes a decrease in the number of naturally occurring regulatory T cells (CD4+CD25+Foxp3+) in the spleen and the tumor. Finally, CTX treatment induces the differentiation of GR1highCD11b+ splenic myeloid cells into mature GR1highCD11b+CD11c+ (possibly dendritic cells?) which express high levels of CD11c, MHC class II and CD86 molecules. Of note, these cells are mainly detected in tumour necrosis areas. <p><p>Collectively, these results suggest that CTX prevents suppressive mechanisms and induces a population of CD11c+ myeloid cells which may present tumor antigens and activate T lymphocytes, an hypothesis in line with the requirement for CD4+ cells in CTX-induced long term resistance. <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished