La thrombopénie immunologique ou purpura thrombopénique immunologique (PTI) est une maladie auto-immune rare responsable d'une destruction périphérique immunologique des plaquettes associée à une production médullaire inadaptée. Dans la première partie de ce travail, nous exposons les connaissances actuelles de sa physiopathologie ainsi que certaines données concernant la réponse immunitaire T, le rôle des lymphocytes T régulateurs (Treg), l'implication de la rate dans la réponse immunitaire ainsi que les modes d'action d'une thérapeutique anti-lymphocytaire B, le rituximab. Dans une seconde partie, nous rapportons les résultats obtenus chez 40 patients atteints de PTI. Nous avons montré que le taux des Treg circulants CD4+CD25HighFoxp3+ est similaire chez les patients et les témoins, avec une élévation de leur taux chez les sujets répondeurs aux traitements. A l'inverse, il existe un déficit quantitatif en Treg au sein de la rate des patients. L'analyse des sous-populations lymphocytaires B spléniques a montré une augmentation du taux de lymphocytes B de la zone marginale chez les patients. Concernant les mécanismes d'action du rituximab, nous avons montré qu'une déplétion lymphocytaire B sanguine et splénique n'est pas suffisante pour obtenir une rémission, et que les plasmocytes ne sont pas sensibles à cette thérapeutique. Par ailleurs, nous proposons un mécanisme d'échappement à ce traitement. En effet, nous avons montré que les patients résistants au RTX présentent une élévation du ratio Th1/Treg spléniques. Chez ces sujets non répondeurs, nous avons également observé une élévation du ratio lymphocytes T CD8+/CD4+, au sein de la rate, suggérant une participation des lymphocytes T cytotoxiques dans la physiopathologie du PTI. Ces résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives dans la compréhension de la physiopathologie du PTI, notamment la possible implication des lymphocytes B de la zone marginale et le défaut de contrôle de la réponse immunitaire splénique par les Treg. Concernant le rituximab, son action sur la réponse immunitaire ne semble pas se limiter à une déplétion lymphocytaire B qui n'est pas suffisante pour obtenir une rémission. Un mécanisme d'échappement ou de résistance à cette thérapeutique passe par une orientation Th1 et une probable implication des lymphocytes T CD8+.

La thrombopénie immunologique ou purpura thrombopénique immunologique (PTI) est une maladie auto-immune rare responsable d’une destruction périphérique immunologique des plaquettes associée à une production médullaire inadaptée. Dans la première partie de ce travail, nous exposons les connaissances actuelles de sa physiopathologie ainsi que certaines données concernant la réponse immunitaire T, le rôle des lymphocytes T régulateurs (Treg), l’implication de la rate dans la réponse immunitaire ainsi que les modes d’action d’une thérapeutique anti-lymphocytaire B, le rituximab. Dans une seconde partie, nous rapportons les résultats obtenus chez 40 patients atteints de PTI. Nous avons montré que le taux des Treg circulants CD4+CD25HighFoxp3+ est similaire chez les patients et les témoins, avec une élévation de leur taux chez les sujets répondeurs aux traitements. A l’inverse, il existe un déficit quantitatif en Treg au sein de la rate des patients. L’analyse des sous-populations lymphocytaires B spléniques a montré une augmentation du taux de lymphocytes B de la zone marginale chez les patients. Concernant les mécanismes d’action du rituximab, nous avons montré qu’une déplétion lymphocytaire B sanguine et splénique n’est pas suffisante pour obtenir une rémission, et que les plasmocytes ne sont pas sensibles à cette thérapeutique. Par ailleurs, nous proposons un mécanisme d’échappement à ce traitement. En effet, nous avons montré que les patients résistants au RTX présentent une élévation du ratio Th1/Treg spléniques. Chez ces sujets non répondeurs, nous avons également observé une élévation du ratio lymphocytes T CD8+/CD4+, au sein de la rate, suggérant une participation des lymphocytes T cytotoxiques dans la physiopathologie du PTI. Ces résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives dans la compréhension de la physiopathologie du PTI, notamment la possible implication des lymphocytes B de la zone marginale et le défaut de contrôle de la réponse immunitaire splénique par les Treg. Concernant le rituximab, son action sur la réponse immunitaire ne semble pas se limiter à une déplétion lymphocytaire B qui n’est pas suffisante pour obtenir une rémission. Un mécanisme d’échappement ou de résistance à cette thérapeutique passe par une orientation Th1 et une probable implication des lymphocytes T CD8+. / Immune thrombocytopenia (ITP) is an autoimmune disease responsible for a peripheral immune destruction of platelets associated with an inappropriate bone marrow production. In this work, we first review the mechanisms involved in the pathogenesis of ITP. We also focus on the T cell immune response, highlighting the key role of regulatory T cells (Treg) in peripheral tolerance. The implication of the spleen in the immune response and the effects of rituximab, a B cell depleting therapy, are discussed. Then, our results obtained from 40 ITP patients are reported. Despite the fact that CD4+CD25HighFoxp3+ circulating Treg levels are similar between patients and controls, a significant increase is observed in responder patients. In the spleen, the rate of Treg is lower in ITP patients. Analyses of the spleens also reveal an increase in the level of marginal zone B cells in ITP. Rituximab is responsible for a complete depletion of both circulating and splenic B cells, which is not sufficient to achieve a response. Moreover, plasma cells are still observed after treatment. An increase in the Th1/Treg ratio in the spleen of non responder patients after rituximab infusion could trigger an escape to this therapy. The involvement of CD8+ T cells in the pathogenesis of ITP is highlighted by the increase in the CD8+/CD4+ ratio in the spleen after rituximab. New fields in the understanding of the pathogenesis of ITP are opened with these results, particularly by showing a quantitative deficiency in splenic Treg and the possible involvement of marginal zone B cells. Regarding rituximab effect on the immune response, we demonstrate on the one hand that complete circulating and splenic B cell depletion is not sufficient to achieve remission, and on the other hand that Th1 response and increase in CD8+ T cells level may represent an escape to this treatment.

IntroductionLe cancer colorectal est la 2ème cause de mortalité par cancer en France (HAS, 2013) mais aussi le 3ème cancer le plus fréquent (INCa, 2014). Un dépistage organisé existe depuis 2008, pourtant, les taux de participation restent faibles : 33,5% en France (Santé Publique France, 20018). D’après la littérature, les principaux freins à la participation au dépistage sont le manque de confiance envers le système de soins (Clavarino et al, 2004) ; l’embarras, l’inconfort et le déplaisir accompagnant les procédures des tests (Varela et al, 2010) ; ou encore le manque de temps. Enfin, le manque de recommandations de la part du médecin représente l’un des freins les plus importants (Walsh et al, 2010 ; Powell et al, 2009). Le test Hémoccult II, utilisé dans le cadre du dépistage organisé jusqu’en mars 2015, a été remplacé par un nouveau test immunologique, jugé plus sensible, plus spécifique et plus fiable par la communauté médicale (INCa, 2014).Objectifs et méthodeAu regard des faibles taux de dépistage et des principaux freins identifiés dans la littérature, ce travail de thèse a pour but d’analyser les déterminants de la participation au dépistage à la fois du point de vue des patients mais aussi des médecins généralistes. De plus, il apparaît nécessaire d’évaluer les enjeux de l’arrivée du nouveau test immunologique.Ce travail doctoral est basé sur la technique de la triangulation (théorique, méthodologique et des données). Plus précisément, deux cadres théoriques validés et reconnus en psychologie sociale de la santé ont été mobilisés, à savoir la Théorie des Représentations Sociales (Moscovici, 1984), et la Théorie du Comportement Planifié (Ajzen et al, 1991), permettant l’adoption d’une approche compréhensive aussi bien que prédictive du dépistage. Trois études ont ainsi été développées :- Une étude qualitative par entretiens semi-directifs, menée auprès de 17 médecins généralistes, ayant pour but d’appréhender leurs représentations sociales du dépistage du cancer colorectal ainsi que la manière dont celui-ci peut s’ancrer dans leur pratique de recommandation ;- Une étude qualitative par focus groups, menée auprès de 29 participants issus de la population générale dont l’objectif était d’appréhender leurs représentations sociales du dépistage du cancer colorectal ainsi que les freins et facilitateurs à son adhésion.- Une étude quantitative par questionnaires, menée auprès de 160 participants issus de la population générale, visant à identifier les principaux prédicteurs de l’intention et du comportement de dépistage du cancer colorectal.Principaux résultatsL’analyse des entretiens a révélé une incohérence entre le rôle que les médecins pensent devoir jouer auprès des patients dans la prévention et le dépistage, et la réalité de leur pratique qui ne leur laisse que peu de temps à y consacrer. L’analyse des focus groups a révélé que les principaux freins à la participation au dépistage sont : le manque d’accessibilité du test (nécessité de consulter le médecin généraliste pour obtenir le kit de dépistage), une faible préoccupation pour la prévention, mais aussi le fait que le cancer colorectal se réfère à une partie du corps liée à un tabou, et considérée comme sale. Enfin, l’analyse des questionnaires a permis d’identifier plusieurs variables ayant une influence sur l’intention et le comportement de dépistage, à savoir : le comportement antérieur de dépistage, la fréquence de dépistage, le déni, la proximité sociale, les normes sociales et le contrôle comportemental perçu. Les analyses ont particulièrement mis en avant l’importance du contrôle comportemental perçu, pouvant agir directement sur le comportement sans passer par l’intention.ConclusionLes conclusions révèlent la pertinence d’allier une approche compréhensive à une approche prédictive. Nos perspectives proposent la mise en place d’interventions visant à améliorer le niveau de contrôle perçu de la population générale face à ce dépistage. / IntroductionColorectal cancer is the second leading cause of cancer deaths in France (HAS, 2013) but also the third most common cancer (INCa, 2014). An organized screening programme has been put in place since 2008, but participation rates remain low: 33.5% in France (Santé Publique France, 2018). According to the literature, the main barriers to participation in screening are the lack of confidence in the health care system (Clavarino et al, 2004) ; embarrassment, discomfort and dissatisfaction accompanying testing procedures (Varela et al, 2010); or lack of time. Finally, the lack of general practitioners’ recommendations is one of the most significant obstacles (Walsh et al, 2010, Powell et al, 2009). The Hemoccult II test, used as part of organized screening until March 2015, was replaced by a new immunological test, considered more sensitive, more specific and more reliable by the medical community (INCa, 2014).Objectives and methodFaced with the low screening rates and main obstacles identified in the literature, this thesis aims at analyzing the determinants of screening participation, with both patient and general practitioner points of view. Moreover, it appears necessary to evaluate issues with the arrival of the new immunological test.This doctoral work is based on the technique of triangulation (theoretical, methodological and data triangulation). More precisely, two validated and recognized theoretical frameworks in health and social psychology were employed, namely the Theory of Social Representations (Moscovici, 1984), and the Theory of Planned Behaviour (Ajzen et al, 1991), allowing the adoption of a comprehensive approach as well as a predictive approach to studying screening participation. Three studies have been set up:- A qualitative study through semi-structured interviews, conducted with 17 general practitioners, aimed at understanding their social representations of colorectal cancer screening and how it can be anchored in their practice of recommendation;- A qualitative study by focus groups, conducted with 29 participants from the general population. The objective was to apprehend their social representations of colorectal cancer screening as well as the obstacles and facilitators to screening participation.- A quantitative study by questionnaire, including 160 participants from the general population, endeavours to identify the key predictors of colorectal cancer screening intention and behaviour.Main resultsThe analysis of interviews revealed an inconsistency between the role general practitioners think they should play with patients in prevention and screening, and the reality of their practice which leaves them insufficient time to devote to it. The focus group analysis revealed that the main barriers to participation in screening are: the lack of accessibility of the test (needing to consult the general practitioner in order to obtain the screening kit), a low concern for prevention, but also the fact that colorectal cancer refers to a body part that is deemed taboo, and considered “dirty”. Finally, the analysis of questionnaires allowed the identification of several variables influencing intention and behaviour of screening, namely: previous screening behaviour, frequency of screening, denial, social proximity, social norms and perceived behavioural control. Analysis particularly emphasized the value of perceived behavioural control, which can directly influence behaviour without going through intention.ConclusionResults reveal the relevance of combining a comprehensive approach with a predictive approach. Our perspectives suggest the implementation of interventions aimed at improving the perceived level of control of the general population faced with this screening.

La réaction allergique de type I est caractérisée par une réponse immunitaire inappropriée de type Th2, et /ou par l'absence d'une tolérance immunologique contre un antigène habituellement toléré par la plupart des individus : l'allergène. Des études récentes soulignent le rôle central joué par les lymphocytes T CD4+ spécifiques de l'allergène dans le contrôle des réponses allergiques. Néanmoins, l'étude des mécanismes immunologiques impliqués se doit d'être approfondie. Elle pourrait ainsi fournir d'importants renseignements concernant l'induction de tolérance périphérique contre l'allergène observée chez les individus sains. L'examen de ces réponses spécifiques apparaît alors comme primordial pour améliorer les approches thérapeutiques actuelles, dans l'hypothèse que l'immunothérapie spécifique de l'allergène puisse reproduire une telle réponse immunitaire naturelle protectrice de l'allergène. Durant cette thèse, nous avons conçu et développé des tétramères MHC classe II afin d'analyser à l'échelle de la cellule les réponses lymphocytaires T CD4+ spécifiques de l'allergène à la fois chez les patients allergiques et les volontaires sains. Pour ce faire, nous avons déterminé les conditions expérimentales nécessaires pour s'assurer d'une détection efficace des cellules T CD4+ spécifiques de l'allergène par cet outil. Ce travail a été réalisé dans le cadre d'une analyse des réponses T CD4+ induites d'une part contre l'allergène majeur du pollen de bouleau (Bet v 1) ou d'autre par contre les allergènes majeurs des acariens (Der p 1 et Der p 2). Nous avons ainsi démontré que la tolérance périphérique observée chez les sujets sains est associée à la présence et l'expansion de lymphocytes T CD4+ spécifiques de l'allergène. Nous avons également développé des méthodes expérimentales permettant de caractériser fonctionnellement les cellules tétramères positives. Nous avons ainsi démontré que les cellules T CD4+ spécifiques de l'allergène des volontaires sains sécrètent principalement de l'IFN-γ et de l'IL-10 en réponse à l'allergène et expriment très fortement le marqueur CTLA-4, un marqueur associé aux cellules T régulatrices. A l'inverse, chez les patients allergiques, ces cellules sont clairement de type Th2 confirmant leur rôle dans l'induction et l'amplification des réponses allergiques. Le développement des tétramères MHC classe II dans le contexte de l'allergie fournit une approche pertinente pour définir clairement le rôle joué par les cellules T CD4+ spécifiques de l'allergène. Ce travail, réalisé à la fois chez les individus sains, allergiques ou en cours de désensibilisation, s'inscrit pleinement dans un projet d'entreprise. Ces outils faciliteront le développement de nouveaux candidats vaccins en permettant d'identifier des marqueurs biologiques associés à un bénéfice clinique.

Thèse d'exercice : Médecine. Pédiatrie : Paris 12 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. 69 f. : ill. Bibliogr. f. 49-57.

Cette thèse présente le développement de tests immunologiques innovants, rapides et sensibles combinant des nanoparticules superparamagnétiques (SPN) fonctionnalisées et des micro-aimants : nos immuno-essais magnétiques exploitent les forts gradients de champ magnétique de ces micro-aimants pour capturer les complexes immunologiques liés aux SPN. L’attraction magnétique est souvent utilisée en biotechnologies car elle peut générér des forces capables de capturer des molécules d’intérêt. Les immuno-essais sur billes utilisent habituellement des aimants centi- et millimétriques pour capturer des micro-particules. Réduire la taille des particules magnétiques est très intéressant pour réduire les cinétiques de réactions, tout en diminuant les phénomènes de sédimentation et d’agrégation. Cette réduction d’échelle des particules permet aussi d’augmenter la surface de réaction et ainsi d’augmenter la sensibilité des tests. Cependant les aimants millimétriques génèrent des gradients faibles qui capturent difficilement les SPN, trop mobiles. Les micro-aimants de l’Institut Néel génèrent des forts gradients locaux et ainsi des forces magnétiques importantes. Ces technologies innovantes sont utilisées dans cette thèse pour développer des immuno-essais rapides tirant profit de la réduction d’échelle des particules et des aimants, par rapport aux technologies commerciales.Dans un premier temps, nous avons développé un test immunologique magnétique (MagIA) colorimétrique, comme approche innovante du test ELISA. Nous avons réalisé une preuve de concept pour la détection d’anticorps dirigé contre l’ovalbumine et comparé les résultats avec ceux de tests ELISA. Le test MagIA optimisé présente une limite de détection et une zone dynamique similaires au test ELISA développé avec les mêmes réactifs biologiques. Les micro-aimants fabriqués selon la méthode de micro-magnetic imprinting sont intégrés à bas coût dans les micro-puits des plaques multi-puits ELISA, et permettent la capture efficace des complexes immunologiques couplés aux SPN. La méthode est générique est permet de réaliser des tests ELISA en 30 minutes avec le même équipement.Nous avons ensuite développé un test magnétique immunologique avec une détection fluorescente locale tirant profit des propriétés de capture locale des SPN sur les micro-aimants. Ce test permet la quantification de la molécule d’intérêt en à peine 15 minutes sans étape de lavage. Une preuve de concept réalisée sur la détection de l’anticorps anti-ovalbumine a été réalisée, avec des anticorps de détection fluorescents et des micro-aimants fabriqués selon la méthode de thermo-magnetic patterning. La mesure différentielle entre le signal fluorescent provenant des complexes immunologiques couplés aux SPN localisées sur les micro-aimants, et le signal non spécifique (à l’extérieur des micro-aimants) permet la quantification d’une molécule. Ce test MLFIA (magnetically localized FIA) possède des performances jusqu’à 100 fois meilleures que les tests ELISA standard, pour la détection d’anticorps anti-ovalbumine en PBS. Le test MLFIA a ensuite été transféré à la détection de paramètres cliniques tels que la protéine C réactive, l'ostéopontine, et les sérologies de la toxoplasmose (IgG et IgM). La comparaison des résultats avec des méthodes automatisées a montré d’excellentes corrélations. Le test MLFIA présente plusieurs avantages : il est versatile, compatible avec les milieux biologiques, utilise de faibles volumes et requiert peu d’énergie. Ces résultats ouvrent la voie à une nouvelle génération de tests immunologiques sensibles et nous développons désormais un lecteur miniature pour le diagnostic portable. / This thesis reports the development of innovative, sensitive and fast immunoassays combining functionalized superparamagnetic nanoparticles (SPN) and micro-magnets. Our magnetic immunoassays exploit high gradients generated by micro-magnets to capture immune-complexes captured on SPN. Magnetic attraction is widely used in biotechnology, because it provides long-range forces able to capture molecules of interest. Bead-based immunoassays use common centimetre-scale magnets to attract micro-particles. Those magnets generate low magnetic gradients and struggle to capture superparamagnetic nano-particles, which are too small and mobile to be efficiently trapped. Down-scaling the size of magnetic particles is very interesting since it allows diffusion-based transport to perform faster reactions, while avoiding particle sedimentation and aggregation. Furthermore, it increases the reaction surface, which improves the sensitivity of immunoassays. Thanks to the scaling law effects micro-magnets from Institut Néel generate high local gradients and therefore large magnetic volume forces: we use this innovative technology to develop fast immuno-assays that take advantage of a radical size reduction, compared to commercial technology.We first developed a colorimetric magnetic immunoassay (MagIA) as a new approach to standard ELISA. A proof-of-concept based on colorimetric quantification of anti-ovalbumin antibody in buffer was performed and compared with conventional ELISAs. After optimization, MagIA exhibits a limit of detection and dynamic range similar to ELISAs developed using the same biochemical tools. Micromagnets made by the micro-magnetic imprinting method can be fully integrated in multi-well plates at low cost, allowing the efficient capture of immuno-complexes carried by SPNs. The method is generic and performs magnetic ELISA in 30 min.We then developed a magnetically localized fluorescent immunoassay (MLFIA) exploiting the local capture of SPN on micro-magnets. The differential measurement of fluorescence localized on and besides micro-magnet arrays allows the detection and quantification of a molecule in only 15 minutes without fluid handling. We present a proof of concept based on the detection of monoclonal antibody anti-ovalbumin. Functionalized nanoparticles are incubated with fluorescent detection antibody and the sample containing the molecule to be detected. After a single incubation step, the nanoparticles are captured on micro-magnets made by thermo-magnetic patterning. Fluorescence is then read under a microscope. Differential measurement between the signal from the immunological complex localised on the micro-magnets and the non-specific signal localised besides micro-magnets allows the quantification of mAb anti-OVA. The performance of MLFIA was compared with conventional ELISA and exhibits a limit of detection up to 100 times better for anti-OVA mAb in PBS. For further validation, MLFIA was used to measure clinical parameters: we developed a sandwich assay to detect C-reactive protein, and a serology for Toxoplasma gondii immunoglobulin G and M or osteopontin in human samples. Comparisons with data obtained with routine clinical automatized methods show excellent correlation. Our MLFIA technology presents several key advantages: it is compatible with biological media (serum, plasma), uses small volumes and requires little energy. It also is versatile and thus can be used to detect any antigen or antibody in complex media. We are currently developing a portable prototype for point-of-care diagnostics. The results will open the way to a new generation of sensitive immunological lab-on-chip.

Depuis leur commercialisation en 1996, les surfaces de cultures de plantes transgéniques Bt ont considérablement augmentées, représentant en 2007 près de 42 millions d'hectares. Ces plantes produisent en continu une protéine insecticide (issue de Bacillus thuringiensis) leur permettant de lutter contre les insectes ravageurs tels que la pyrale du maïs. La toxine est introduite dans les sols par exsudation racinaire et dégradation des tissus végétaux. Les interactions de la toxine avec les particules de sol peuvent modifier sa mobilité, sa biodisponibilité, sa persistance et sa toxicité. Il est donc important d'étudier le rôle du sol dans le devenir de cette toxine. Ce travail de thèse a permis de mieux comprendre les interactions physicochimiques entre la toxine et les composantes du sol et en particulier avec les argiles, surfaces très réactives. L'adsorption de la toxine sur les argiles est une interaction de faible affinité, fortement dépendante du pH et difficilement réversible. La différence de quantité maximale de toxine adsorbée sur la montmorillonite et sur la kaolinite était fortement liée à leurs surfaces spécifiques respectives, plutôt qu'à leur charge de surface spécifique. Une analyse de la mobilité de la toxine à l'état adsorbé sur la montmorillonite par Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) a montré que cette protéine est immobilisée par son adsorption sur l'argile. Ces résultats suggèrent que le risque de transfert de la toxine dans le sol se limite aux transports facilités par les colloïdes et aux processus de bioturbation. Par ailleurs, des études de persistance de la toxine dans le sol ont montré que plus de 50 % de l'immuno-réactivité de la toxine est perdue en moins d'une semaine. Les processus biotiques (dégradations microbiennes) semblent peu impliqués dans ce phénomène. Il semblerait que la toxine ne soit pas dégradée mais plutôt inactivée par des changements de conformations suite à son interaction avec les composants du sol. Les processus abiotiques (interactions physicochimiques) sont donc fortement impliqués dans la persistance de la toxine dans le sol, avec une contribution significative des interactions hydrophobes. Dans ce travail de thèse, un effort important a été consacré à l'élaboration d'une méthode de détection in situ de la toxine dans le sol. Deux stratégies ont été envisagées, basées à la fois sur la spectroscopie de fluorescence et l'immunologie, mettant en jeu la reconnaissance soit de deux épitopes de la toxine par deux anticorps marqués (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET), soit la reconnaissance d'un épitope par un anticorps marqué après présaturation des surfaces (sites protéiques). Les résultats, encore préliminaires, sont encourageants et nécessitent d'être poursuivis.

Suite à la rencontre d’un antigène (Ag) présenté à la surface des cellules présentatrice de l’Ag (CPA), les lymphocytes T naïfs, ayant un récepteur des cellules T (RCT) spécifique de l’Ag, vont proliférer et se différencier en LT effecteurs (1). Suite à l’élimination de l’Ag la majorité des LTe vont mourir par apoptose alors que les restants vont se différencier en LT mémoire (LTm) protégeant l’organisme à long terme. Les mécanismes qui permettent la différenciation des LTe en LTm sont encore inconnus. Pour comprendre comment les LTm CD8+ sont générés à partir des LTe, nous avons émis l’hypothèse que la densité de l’Ag présenté par les CPA peut avoir un impact sur la sélection des LT CD8+ répondant l’Ag à se différencier en LTm. De manière intéressante, nos résultats montrent qu’une immunisation avec des cellules dendritiques (DCs) exprimant un haut niveau de complexe CMH/peptide à sa surface permet le développement de LTm. À l’inverse, le développement des LTm est fortement réduit (10-20X) lorsque les souris sont immunisées avec des DCs exprimant un niveau faible de complexes CMH/peptide à leur surface. De plus, la quantité d’Ag n’a aucune influence ni sur l’expansion des LT CD8+ ni sur l’acquisition de leurs fonctions effectrices, mais affecte de manière critique la génération des LTm. Nos résultats suggèrent que le nombre de RCT engagé lors de la reconnaissance de l’Ag est important pour la formation des LTm. Pour cela nous avons observé par vidéo-microscopie le temps d’interaction entre des LTn et des DCs. Nos résultats montrent que le temps et la qualité de l’interaction sont dépendants de la densité d’Ag présenté par les DCs. Effectivement, nous observons une diminution dans le pourcentage de LT faisant une interaction prolongée avec les DCs quand le niveau d’Ag est faible. De plus, nous observons des variations de l’expression des facteurs de transcription clefs impliqués dans la différenciation des LTm tels qu’Eomes, Bcl-6 et Blimp-1. Par ailleurs, la densité d’Ag fait varier l’expression du Neuron-derived orphan nuclear receptor 1 (Nor-1). Nor-1 est impliqué dans la conversion de Bcl-2 en molécule pro-apoptotique et contribue à la mort par apoptose des LTe pendant la phase de contraction. Notre modèle propose que la densité de l’épitope contrôle la génération des CD8+ LTm. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la génération des LTm permettra le développement de meilleures stratégies pour la génération de vaccin. Dans un second temps, nous avons évalué le rôle du signal RCT dans l’homéostasie des LTm. Pour ce faire, nous avons utilisé un modèle de souris transgénique pour le RCT dont son expression peut être modulée par un traitement à la tétracycline. Ce système nous a permis d’abolir l’expression du RCT à la surface des LTm. De manière intéressante, en absence de RCT exprimé, les LTm CD8+ peuvent survivre à long terme dans l’organisme et rester fonctionnels. De plus, une sous population des LTm CD4+ a la capacité de survivre sans RCT exprimé dans un hôte lymphopénique alors que l’autre sous population nécessite l’expression du RCT. / Following antigen (Ag) encounter presented at surface of antigen presenting cell (APC), naïve T lymphocytes, which express a T cell receptor (TCR) specific for Ag, undergo massive proliferation and differentiate into effector T cells (1). After elimination of the pathogen, most effector T cells die, while the remaining differenciates into memory T cells (LTm) which are responsible for long-term protection of the organism. The mechanism that promotes the differentiation of effectors T cells into memory T cells is still largely unknown. To understand how Tm cells are generated from effectors, we hypothesized that the density of antigen on the APC could have an impact on the selection of CD8+ T cell responders differentiating into memory. Very interestingly, our results show that immunization of mice with dendritic cells (DCs) expressing high levels of peptide-MHC complexes on their surface allow a strong development of LTm. In contrast, the development of memory T cells was strongly reduced (10-20X) when mice were immunized with DCs expressing two-fold less level of peptide-MHC complexes. In agreement with the results described above, the amount of Ag does not have any influence on T cell expansion and acquisition of effector functions, but critically affects memory T cell generation. Our data suggest that the numbers of TCR engaged in MHC/peptide recognition are important for the formation of memory T cells. To do that, we evaluated by time-lapse videomicroscopy the time of interaction between LTn and DCs. Effectively, we observed a significant reduction in the percentage of cells making prolonged interaction with DCs when the level of Ag is decreased. Moreover, we observed a modification in the expression of key transcription factors involved in the differentiation of Tm cells, such as Eomes, Bcl6 and Blimp-1. Further analysis reveals that the Ag density influences the expression of Neuron-derived orphan nuclear receptor 1 (Nor1). Nor-1 is involved in the conversion of Bcl-2 into a pro-apoptotic molecule and contributes to effector death by apoptosis during contraction phase. Our model proposes that density of Ag controls the generation of LTm. A better understanding of the role of TCR signals in the generation of LTm will help to develop better vaccination strategies. Second time, we have evaluated the role of TCR signals in Tm cell homeostasis. To do that, we have used a tetracycline-inducible expression system of the TCR in mice. This system allows us to abolish TCR expression on Tm cells. Interestingly, we show that the ablation of TCR expression did not influence the survival and functionnality of Ag-specific CD8+ LTm cells. Furthermore, our results show that a subset of CD4 Tm cells can survive in the absence of TCR expression in nonlymphopenic hosts while another subset requires the TCR expression to survive.

Suite à la rencontre d’un antigène (Ag) présenté à la surface des cellules présentatrice de l’Ag (CPA), les lymphocytes T naïfs, ayant un récepteur des cellules T (RCT) spécifique de l’Ag, vont proliférer et se différencier en LT effecteurs (1). Suite à l’élimination de l’Ag la majorité des LTe vont mourir par apoptose alors que les restants vont se différencier en LT mémoire (LTm) protégeant l’organisme à long terme. Les mécanismes qui permettent la différenciation des LTe en LTm sont encore inconnus. Pour comprendre comment les LTm CD8+ sont générés à partir des LTe, nous avons émis l’hypothèse que la densité de l’Ag présenté par les CPA peut avoir un impact sur la sélection des LT CD8+ répondant l’Ag à se différencier en LTm. De manière intéressante, nos résultats montrent qu’une immunisation avec des cellules dendritiques (DCs) exprimant un haut niveau de complexe CMH/peptide à sa surface permet le développement de LTm. À l’inverse, le développement des LTm est fortement réduit (10-20X) lorsque les souris sont immunisées avec des DCs exprimant un niveau faible de complexes CMH/peptide à leur surface. De plus, la quantité d’Ag n’a aucune influence ni sur l’expansion des LT CD8+ ni sur l’acquisition de leurs fonctions effectrices, mais affecte de manière critique la génération des LTm. Nos résultats suggèrent que le nombre de RCT engagé lors de la reconnaissance de l’Ag est important pour la formation des LTm. Pour cela nous avons observé par vidéo-microscopie le temps d’interaction entre des LTn et des DCs. Nos résultats montrent que le temps et la qualité de l’interaction sont dépendants de la densité d’Ag présenté par les DCs. Effectivement, nous observons une diminution dans le pourcentage de LT faisant une interaction prolongée avec les DCs quand le niveau d’Ag est faible. De plus, nous observons des variations de l’expression des facteurs de transcription clefs impliqués dans la différenciation des LTm tels qu’Eomes, Bcl-6 et Blimp-1. Par ailleurs, la densité d’Ag fait varier l’expression du Neuron-derived orphan nuclear receptor 1 (Nor-1). Nor-1 est impliqué dans la conversion de Bcl-2 en molécule pro-apoptotique et contribue à la mort par apoptose des LTe pendant la phase de contraction. Notre modèle propose que la densité de l’épitope contrôle la génération des CD8+ LTm. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la génération des LTm permettra le développement de meilleures stratégies pour la génération de vaccin. Dans un second temps, nous avons évalué le rôle du signal RCT dans l’homéostasie des LTm. Pour ce faire, nous avons utilisé un modèle de souris transgénique pour le RCT dont son expression peut être modulée par un traitement à la tétracycline. Ce système nous a permis d’abolir l’expression du RCT à la surface des LTm. De manière intéressante, en absence de RCT exprimé, les LTm CD8+ peuvent survivre à long terme dans l’organisme et rester fonctionnels. De plus, une sous population des LTm CD4+ a la capacité de survivre sans RCT exprimé dans un hôte lymphopénique alors que l’autre sous population nécessite l’expression du RCT. / Following antigen (Ag) encounter presented at surface of antigen presenting cell (APC), naïve T lymphocytes, which express a T cell receptor (TCR) specific for Ag, undergo massive proliferation and differentiate into effector T cells (1). After elimination of the pathogen, most effector T cells die, while the remaining differenciates into memory T cells (LTm) which are responsible for long-term protection of the organism. The mechanism that promotes the differentiation of effectors T cells into memory T cells is still largely unknown. To understand how Tm cells are generated from effectors, we hypothesized that the density of antigen on the APC could have an impact on the selection of CD8+ T cell responders differentiating into memory. Very interestingly, our results show that immunization of mice with dendritic cells (DCs) expressing high levels of peptide-MHC complexes on their surface allow a strong development of LTm. In contrast, the development of memory T cells was strongly reduced (10-20X) when mice were immunized with DCs expressing two-fold less level of peptide-MHC complexes. In agreement with the results described above, the amount of Ag does not have any influence on T cell expansion and acquisition of effector functions, but critically affects memory T cell generation. Our data suggest that the numbers of TCR engaged in MHC/peptide recognition are important for the formation of memory T cells. To do that, we evaluated by time-lapse videomicroscopy the time of interaction between LTn and DCs. Effectively, we observed a significant reduction in the percentage of cells making prolonged interaction with DCs when the level of Ag is decreased. Moreover, we observed a modification in the expression of key transcription factors involved in the differentiation of Tm cells, such as Eomes, Bcl6 and Blimp-1. Further analysis reveals that the Ag density influences the expression of Neuron-derived orphan nuclear receptor 1 (Nor1). Nor-1 is involved in the conversion of Bcl-2 into a pro-apoptotic molecule and contributes to effector death by apoptosis during contraction phase. Our model proposes that density of Ag controls the generation of LTm. A better understanding of the role of TCR signals in the generation of LTm will help to develop better vaccination strategies. Second time, we have evaluated the role of TCR signals in Tm cell homeostasis. To do that, we have used a tetracycline-inducible expression system of the TCR in mice. This system allows us to abolish TCR expression on Tm cells. Interestingly, we show that the ablation of TCR expression did not influence the survival and functionnality of Ag-specific CD8+ LTm cells. Furthermore, our results show that a subset of CD4 Tm cells can survive in the absence of TCR expression in nonlymphopenic hosts while another subset requires the TCR expression to survive.

LFA-1 (Lymphocyte Function Associated antigen-1) est une intégrine centrale dans la fonction cytotoxique des lymphocytes T CD8+ car elle permet la formation de la synapse immunologique avec les cellules cibles. La régulation de cette interaction cellulaire est contrôlée par la qualité de l'engagement de LFA-1 avec son ligand ICAM-1 (Intracellular Adhesion Molecule-1). Un support clef au contrôle spatio-temporel de l'activation de LFA-1 est le cytosquelette d'actine corticale dans lequel est ancré LFA-1 par son domaine intracellulaire. Comment LFA-1 est organisée à la synapse immunologique et comment la coordination entre LFA-1 et cytosquelette d'actine s'opère de manière précise au sein des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques sont des questions non résolues. Le but de ce projet de thèse a été d'étudier l'organisation précise de la distribution de LFA-1 à la synapse immunologique en relation avec l'actine corticale sous-jacente au contact entre lymphocytes T cytotoxiques et les cellules présentatrices d'antigènes. Pour ce faire, des approches de microscopies de super-résolution SIM (Structured Illumination Microscopy), dSTORM (direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy) et TIRF (Total Internal Reflexion Fluorescence microscopy) ont été développées. Elles ont été appliquées à des lymphocytes T humains non transformés dérivés de contrôles sains et de patients atteints d'une immunodéficience congénitale, le Syndrome de Wiskott-Aldrich (WAS), caractérisé par un défaut de remodelage du cytosquelette d'actine à la synapse immunologique. L'emploi de l'approche de dSTORM en mode TIRF nous a permis de révéler que dans sa conformation activée, LFA-1 forme à la synapse une ceinture radiale composée de centaines de nano-clusters. L'intégrité du cytosquelette d'actine et notamment la protéine WASP s'avèrent importantes pour la formation de la ceinture de nano-clusters de LFA-1, comme le montre le défaut de formation de cette ceinture dans les lymphocytes de patients WAS. L'approche de SIM multi-couleur nous a permis de révéler le rôle de la ceinture de LFA-1 dans le confinement des granules lytiques. Par comparaison de marquages avec des anticorps spécifiques de différentes conformations de LFA-1, notre travail montre également que l'activation de LFA-1 s'opère de manière digitale, dans le sens où les nano-clusters fonctionnent comme des unités au sein desquelles l'activation de LFA-1 suit une loi du tout ou rien. En conclusion, ce travail de thèse démontre l'intérêt des approches de microscopie de super-résolution pour révéler des mécanismes clefs de l'activation des lymphocytes T et pour appréhender la nature des défauts à l'origine de dérèglements pathologiques de la fonction de ces cellules. / LFA-1 (Lymphocyte Function Associated antigen-1) is a central integrin in the function of cytotoxic CD8+ T lymphocytes since it allows the formation of the immunological synapse with target cells. The regulation of this cellular interaction is controlled by the quality of the engagement of LFA-1 with its ligand, ICAM-1 (Intracellular Adhesion Molecule- 1). A key support for the spatio-temporal control of LFA-1 activation is the cortical actin cytoskeleton in which LFA-1 is anchored by its intracellular domain. How LFA-1 is organized at the immunological synapse and how the coordination between LFA-1 and actin cytoskeleton operates accurately within cytotoxic CD8+ T lymphocytes are unresolved issues. The aim of this thesis project was to study the precise organization of the LFA-1 distribution at the immunological synapse in relation to the cortical actin underlying the contact between cytotoxic T lymphocytes and target cells. For this purpose, super-resolution microscopy approaches, including SIM (Structured Illumination Microscopy), dSTORM (direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy) and TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence microscopy) were developed. They were applied to untransformed human T lymphocytes derived from healthy donors and patients with a congenital immunodeficiency, the Wiskott-Aldrich Syndrome (WAS), characterized by actin cytoskeleton remodeling defects at the synapse. The use of the dSTORM approach revealed that activated LFA-1 forms a radial belt composed of hundreds of nanoclusters. The assembly of this belt depends on the integrity of the actin cytoskeleton, as shown by the impairment of this structure in the T lymphocytes derived from the WAS patients. The multi-color SIM approach allowed us to investigate the role of the LFA-1 belt in the confinement of lytic granules. Furthermore, the combination of staining with antibodies specific of LFA-1 conformation states shows that LFA-1 activation is a digital process, whereby nanoclusters operate as units in which LFA-1 activation follows an on / off rule. In conclusion, this PhD work exemplifies the great asset of super-resolution microscopy approaches to reveal key activation mechanisms in T lymphocytes and explore the nature of the defects causing pathological dysregulation of the function of these cells.