O imprinting genômico, processo regulado epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua origem parental, está envolvido no crescimento e desenvolvimento placentário. Na região 11p15.5 encontram-se vários genes regulados por duas regiões controladoras de imprinting (ICR1 e ICR2), onde se encontram as regiões diferencialmente metiladas H19DMR e KvDMR1. Acredita-se que o padrão de imprinting seja dinamicamente regulado durante o desenvolvimento da placenta. Em humanos, há poucas informações sobre imprinting genômico e desenvolvimento placentário, principalmente para estágios precoces do desenvolvimento devido às dificuldades técnicas de obtenção dessas placentas. A descrição de mosaicismo do padrão de metilação restrito a placenta ou entre a placenta e o feto evidencia um perfil epigenético único deste órgão. A 5-hidroximetilação, a qual não tem um papel de silenciamento gênico, pode ser confundida com a metilação do DNA nas análises moleculares. O objetivo principal do presente estudo foi o de verificar a influência da idade gestacional (IG) no perfil de metilação do DNA das ICRs 1 e 2 em vilosidade coriônica, bem como a existência de mosaicismo do perfil de metilação intra-placentário. Neste trabalho também foi investigada a presença de hidroximetilação na KvDMR1. Foram coletadas amostras de tecido placentário, sendo 25 de vilosidades coriônicas (VC) (15 de 3° trimestre gestacional e 10 do 1° trimestre) e nove de cordão umbilical (UC) de 1° trimestre (pareadas com a VC). Quatro placentas de 3° trimestre foram analisadas em separado para o estudo de mosaicismo. O perfil de metilação do DNA das regiões foi verificado por PCR Específica para a Metilação (MS-PCR), Análise Combinada de Bissulfito e Restrição Enzimática (COBRA) e Método de Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em Tempo Real (DESM-RT), além do ensaio para hidroximetilação na KvDMR1. Com os ensaios qualitativos (MS-PCR e COBRA) foi observado um perfil de metilação monoalélico, sendo que na H19DMR foi identificada a presença de CpGs diferentemente metilados. Para a H19DMR foram observadas médias de 0,43 de metilação em VC e 0,31 em UC de 1° trimestre, e de 0,41 em VC de 3° trimestre. Para a KvDMR1, foram encontradas médias de 0,47 em VC e 0,57 em UC de 1° trimestre, e de 0,41 em VC de 3° trimestre. A presença de hidroximetilação na KvDMR1 foi excluída. Não foram observadas diferenças significativas entre as médias das diferentes IGs ou entre tecidos pelos testes t e F para ambas as regiões. Não foi observada correlação positiva no perfil de metilação para H19DMR e KvDMR1 entre os tecidos. Em relação ao mosaicismo, não houve diferenças significativas no perfil de metilação entre os diferentes cotilédones amostrados numa mesma placenta. Os resultados demonstram uma discordância entre tecido embrionário (UC) e extraembrionário (VC). Apesar de não serem observadas alterações significantes nos perfis de metilação da H19DMR e KvDMR1 em diferentes IGs, as informações apresentadas são importantes para as pesquisas sobre a dinâmica do fenômeno de imprinting genômico ao longo da gestação, para os estudos de mosaicismo intraplacentário bem como o perfil epigenético da placenta em relação a outros tecidos. / Genomic imprinting, an epigenetically regulated process by which genes are expressed accordingly to their parental origin, is involved in placental growth and development. In 11p15.5 region, there are many genes regulated by two Imprinting Control Regions (ICR1 and ICR2), in which are found two Differentially Methylated Regions, H19DMR and KvDMR1, respectively. Imprinting patterns seem to be adjusted during placenta development. In humans, there is little information on genomic imprinting and placental development, especially for early stages of development due to technical difficulties in obtaining these placentas. The description of mosaicism in methylation pattern restricted to placenta or between placenta and fetus shows a unique epigenetic profile of this organ. The 5-hidroxymethylation, which has no role in gene silencing, can be confused with DNA methylation in molecular analysis. The main aim of our study was to verify the influence of gestational age (GA) in DNA methylation profile of ICRs 1 and 2 in chorionic villi, as well as the existence of intra-placental methylation profile mosaicism. The presence of hydroximethylation in the KvDMR1 was also investigated. Samples were collected from placentas, 25 from chorionic villi (CV) (15 of the 3rd gestational trimester and 10 of the 1st trimester) and nine from umbilical cord (UC) in 1st trimester (paired with the CV samples). Four 3rd trimester placentas were separately analyzed for mosaicism. DNA methylation profile was verified by Methylation Specific PCR (MS-PCR), and Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA) and Methylation-Sensitive Enzyme Digestion Method associated with Real-Time PCR (DESM-RT), in addition to hydroximethylation test in the KvDMR1 region. With qualitative assays (MS-PCR and COBRA), it was observed a monoallelic methylation pattern, and, only for the H19DMR, differently methylated CpGs were observed. For the H19DMR, we observed methylation means of 0.43 in CV and 0.31 in UC of 1st trimester, and 0.41 in CV of 3rd trimester. For KvDMR1, we observed means of 0.47 in CV and 0.57 in UC of 1st trimester, and 0.41 in CV of 3rd trimester. No hydroximethylation in the KvDMR1 was observed. There were no significant differences between the means of different GAs or between tissues by F and t tests for both regions. No positive correlation was found on methylation profile for H19DMR and KvDMR1 between tissues. In relation to mosaicism, there were no significant differences in methylation profile between different cotyledons sampled in the same placenta. The results showed a discrepancy between embryonic (UC) and extra-embryonic (CV) tissues. Although it was not observed significant changes in methylation profiles of H19DMR and KvDMR1 in different GAs, the presented results are important to research on dynamics of genomic imprinting phenomenon during pregnancy, studies of intra-placental mosaicism and placenta epigenetic profile in relation to other tissues.

O imprinting genômico, processo regulado epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua origem parental (paterna ou materna), está envolvido no desenvolvimento placentário. Na região cromossômica 11p15.5 encontram-se vários genes importantes para o desenvolvimento fetal e da placenta, os quais são regulados por duas principais regiões controladoras de imprinting (ICR1 e 2) onde se encontram as regiões diferencialmente metiladas H19DMR e KvDMR1, respectivamente. O imprinting genômico e a inativação aleatória do cromossomo X são processos epigenéticos presentes em mamíferos placentários. O presente trabalho teve como objetivo principal verificar a presença de mosaicismo do perfil epigenético entre tecidos extraembrionários de estágios precoces da gravidez (primeiro trimestre), e em vilosidade coriônica de placentas a termo (terceiro trimestre). Foram coletadas amostras de 10 gestações de primeiro trimestre (vilosidade coriônica, âmion, membrana de cordão umbilical e tecido embrionário) e 14 de terceiro trimestre (vilosidade coriônica), das quais 10 foram consideradas como controles e quatro utilizadas para estudo de mosaicismo restrito à vilosidade coriônica (coleta de amostras de todos os cotilédones). Após extração do DNA, foi utilizado o Método de Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em Tempo Real para o estudo do padrão de metilação da KvDMR1 e da H19DMR em diferentes tecidos do primeiro trimestre gestacional e em tecido placentário do terceiro trimestre. O padrão de inativação do cromossomo X foi avaliado em todos os cotilédones de duas placentas a termo, de fetos do sexo feminino, por meio do ensaio do receptor de andrógeno humano (HUMARA assay), utilizando eletroforese capilar, e com acréscimo de um novo marcador de inativação do cromossomo X (ICX1). Na análise estatística foram utilizados o teste t não pareado, teste de Turkey e teste t pareado. A média de metilação da KvDMR1 das amostras de vilosidade coriônica do primeiro trimestre gestacional foi estatisticamente diferente da média de metilação do terceiro trimestre. Enquanto que a metilação da H19DMR não apresentou diferença estatística entre amostras de vilosidade coriônica do primeiro e do terceiro trimestre gestacionais. Com relação ao mosaicismo, a KvDMR1 não apresentou variação com relação ao tamanho ou a posição dos cotilédones, enquanto que a H19DMR apresentou diferença estatisticamente significativa na média de metilação com relação ao tamanho dos cotilédones e ao posicionamento nos quadrantes; em consequência da hipometilação em cotilédones pertencentes a uma das placentas estudadas. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na média de metilação da KvDMR1 e da H19DMR entre diferentes tecidos das amostras do primeiro trimestre gestacional. No entanto, a comparação entre tecidos pareados de um mesmo indivíduo mostrou que a metilação não é correspondente entre os tecidos. Os dados obtidos mostram que o imprinting genômico provavelmente é um processo dinâmico, que evolui ao longo da gestação, estando relacionado a formação e ao amadurecimento da placenta. No presente estudo foi possível verificar que cotilédones de uma mesma placenta apresentam diferentes padrões de inativação do cromossomo X. Diferenças que podem ser explicadas pela expansão clonal das células trofoblásticas progenitoras com o cromossomo X paterno ou o cromossomo X materno inativo. Devido à variabilidade epigenética, exames em tecidos placentários devem considerar as diferenças intra-placentárias e as diferenças entre tecidos embrionários e extraembrionários. / Genomic imprinting, a mechanism of allele-specific expression depending on parental origin, is an epigenetic process that regulates the expression of many genes involved in placental development. Several important genes for fetal and placental growth are located on the human chromosome region 11p15.5, which are regulated by two imprinting control regions (ICR1 e 2), which have the differentially methylated regions H19DMR and KvDMR1, respectively. Genomic imprinting and random inactivation of X chromosome are two epigenetic processes present in placental mammals. The present study aimed to verify the presence of epigenetic mosaicism between extra-embryonic and embryonic tissues from early stages of pregnancy (first trimester), and in chorionic villi of term placentas (third trimester). Samples were collected from 10 pregnancies in the first trimester (chorionic villous, amnion, umbilical cord membrane, and embryonic tissue) and 14 from third trimester (chorionic villus sampling), of which 10 were considered as controls and four used to study mosaicism restricted to chorionic villi (sampling of all cotyledons). After DNA extraction, we used real time PCR associated to enzymatic restriction with a methylation sensitive enzyme to study the methylation pattern of KvDMR1 and H19DMR in different tissues from first trimester and placental third trimester tissue. The pattern of X chromosome inactivation was evaluated in all cotyledons from two term placentas of female fetuses, using the human androgen receptor (HUMARA) assay, capillary electrophoresis, and adding a new X chromosome inactivation (ICX1) marker. Unpaired and paired t and Turkey tests were used in statistical analysis. The average methylation of KvDMR1 of chorionic villi samples in first trimester was statistically different from average methylation of the third trimester. While the methylation of H19DMR showed no statistically significant difference between chorionic villi samples in the first and third trimester of pregnancy. In relation to the mosaicism, the KvDMR1 methylation did not vary in respect to the size or position of the cotyledons, while H19DMR showed statistically significant difference in average methylation relative to the size of the cotyledons, to the position in quadrants, due to the hypomethylation in cotyledons from one studied placenta. There were no statistically significant differences in the mean methylation KvDMR1 and H19DMR among different tissues from the first trimester of pregnancy, however, the comparison between paired tissues from the same individual showed that the methylation is different between tissues. The data from this study showed that genomic imprinting is probably a dynamic process and evolved across human pregnancy. This process is probable connected to placenta formation and maturation. We observed different patterns of X chromosome inactivation in cotyledons from the same placenta. This difference could be explained by clonal expansion of a limited number of trophoblastic progenitor cells with either an inactive maternal or paternal X chromosome. Due to the epigenetic variability, placental tissue examinations must consider the differences intra-placental and differences between embryonic and extra-embryonic tissues.

ARAUJO, F. M. Ocorrência Familial e Associação de Polimorfismos dos Genes H19 e IGF2 com as Síndromes Hipertensivas Gestacionais. 2007. 118f. Disertação (Mestrado) Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007. As síndromes hipertensivas gestacionais [Pré-eclâmpsia/eclâmpsia (PE/E), hipertensão gestacional (HG) e hipertensão arterial crônica (HAC)] estão entre as maiores causas de morte materna e fetal. A PE é a mais prevalente dessas síndromes e o papel dos fatores genéticos na sua etiologia é bem aceito, embora o padrão de herança seja ainda assunto para debate. Os genes H19 e IGF2 sofrem imprinting (marcação) genômico e estão envolvidos na formação placentária e no desenvolvimento fetal. O objetivo do presente trabalho foi a pesquisa de ocorrência familial e da associação com os polimorfismos H19/RsaI e do IGF2/ApaI das síndromes hipertensivas gestacionais e do peso do recém-nascido. Todas as pacientes do estudo foram atendidas no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo e o projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética deste hospital e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa. Para a condução do estudo familial foram selecionadas 226 mulheres (75 apresentavam PE, 49 com HG e 102 do grupo controle). Os dados foram analisados pelos Testes Exato de Fisher e do Qui-quadrado, resultando em uma maior freqüência estatisticamente significativa (p <0,05) de parentes de primeiro-grau com PE/E entre o grupo de PE/E comparado aos outros grupos. Não foi observada influência da cor da pele na distribuição entre os grupos de pacientes. Para a pesquisa de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição H19/RsaI (alelos A e B) e IGF2/ApaI (alelos A e G) através da reação em cadeia da polimerase , foi extraído DNA de sangue periférico de 236 pacientes (55 apresentavam PE, 40 com HG, 34 com HAC e 107 do grupo controle). Os resultados, analisados através dos Testes do Qui-quadrado e G, não mostraram associação estatisticamente significativa entre os polimorfismos e as síndromes hipertensivas gestacionais ou HAC. Houve uma maior freqüência do alelo G na população estudada. Foi observado que em torno de 80% das pacientes dos quatro grupos estudados apresentou pelo menos uma cópia do alelo B e uma do alelo G, concomitantemente. A associação do peso do recém-nascido com os polimorfismos foi analisada utilizando-se os Testes Kolmogorov-Smirnov (a P<0,05) e os Não-paramétricos de Kruskal-Wallis (a P<0,05), não tendo sido evidenciadas diferenças estatisticamente significativas. No grupo da PE houve uma diminuição estatisticamente significativa do peso dos recém-nascidos quando não havia correção para a idade gestacional. Embora não tenha sido evidenciada correlação entre os polimorfismos e os fenótipos estudados, trabalhos futuros com um número amostral maior serão importantes para auxiliar no entendimento do envolvimento de fatores epigenéticos nas síndromes hipertensivas gestacionais e fornecer indícios para a prevenção, o tratamento e o aconselhamento genético. / ARAUJO, F. M. Familial Occurrence and H19 and IGF2 Polymorphism Association with Gestational Hypertensive Disorders. 2007. 118p. Dissertation (Master\'s degree) - University of Medicine, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2007. Gestational hypertensive disorders [preeclampsia/eclampsia (PE/E), gestational hypertension (GH) and chronic hypertension (CH)] are among the largest causes of maternal and fetal death. PE is the more prevalent of those syndromes and the role of the genetic factors in its etiology is well accepted, although the pattern of inheritance is still subject for debate. The imprinted genes H19 and IGF2 are involved in the placental formation and in the fetal development. The objective of the present study was to verify the familial occurrence of these disorders and the H19/RsaI and IGF2/ApaI polymorphism association with gestational hypertensive disorders and the weight of the newborn. All patients of the study were referred to the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, University of São Paulo, and the project was approved by the Hospital Ethic Committee and the National Commission of Ethics in Research. For the familial study, 226 women were selected (75 presented PE/E, 49 with GH and 102 from the control group). The data were analyzed by Exact of Fisher and Qui-square tests, and the frequency of families with at least one female first-degree relative (mothers and/or sisters) with PE/E was higher among the PE/E group compared to the other groups, and it was statistically significant (P<0.05). There was no statistically significant influence of the \"skin color\". Blood samples of 236 pregnant women (55 with PE/E, 40 with GH, 34 with CH and 107 from the control group) were obtained for DNA extraction, and PCR. Genotyping was carried out by enzymatic digestion with ApaI (IGF2) and RsaI (H19). The statistical analyses were performed by Qui-square and G tests. The genotypes were not significantly associated with the different groups. A higher frequency of the G allele (IGF2) was observed. Around 80% of the patients presented at least one copy of the allele B (H19) and G (IGF2), concomitantly. The association of the weight of the newborn with the polymorphisms was analyzed using the Kolmogorov-Smirnov (P <0.05) and the No-parametric Test of Kruskal-Wallis (P <0.05) tests, and statistically significant differences were not evidenced. In the group of the PE/E there was a statistically significant decrease of the weight of the newborn when the correction for the gestational age was not carried out. Although correlation has not been evidenced between the polymorphisms and the phenotypes, future studies with a higher number of patients and other imprinted genes will be important to elucidate the involvement of epigenetic factors for the prevention, treatment and genetic counseling of the gestational hypertensive disorders

O imprinting genômico, processo regulado epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua origem parental (paterna ou materna), está envolvido no desenvolvimento placentário. Na região cromossômica 11p15.5 encontram-se vários genes importantes para o desenvolvimento fetal e da placenta, os quais são regulados por duas principais regiões controladoras de imprinting (ICR1 e 2) onde se encontram as regiões diferencialmente metiladas H19DMR e KvDMR1, respectivamente. O imprinting genômico e a inativação aleatória do cromossomo X são processos epigenéticos presentes em mamíferos placentários. O presente trabalho teve como objetivo principal verificar a presença de mosaicismo do perfil epigenético entre tecidos extraembrionários de estágios precoces da gravidez (primeiro trimestre), e em vilosidade coriônica de placentas a termo (terceiro trimestre). Foram coletadas amostras de 10 gestações de primeiro trimestre (vilosidade coriônica, âmion, membrana de cordão umbilical e tecido embrionário) e 14 de terceiro trimestre (vilosidade coriônica), das quais 10 foram consideradas como controles e quatro utilizadas para estudo de mosaicismo restrito à vilosidade coriônica (coleta de amostras de todos os cotilédones). Após extração do DNA, foi utilizado o Método de Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em Tempo Real para o estudo do padrão de metilação da KvDMR1 e da H19DMR em diferentes tecidos do primeiro trimestre gestacional e em tecido placentário do terceiro trimestre. O padrão de inativação do cromossomo X foi avaliado em todos os cotilédones de duas placentas a termo, de fetos do sexo feminino, por meio do ensaio do receptor de andrógeno humano (HUMARA assay), utilizando eletroforese capilar, e com acréscimo de um novo marcador de inativação do cromossomo X (ICX1). Na análise estatística foram utilizados o teste t não pareado, teste de Turkey e teste t pareado. A média de metilação da KvDMR1 das amostras de vilosidade coriônica do primeiro trimestre gestacional foi estatisticamente diferente da média de metilação do terceiro trimestre. Enquanto que a metilação da H19DMR não apresentou diferença estatística entre amostras de vilosidade coriônica do primeiro e do terceiro trimestre gestacionais. Com relação ao mosaicismo, a KvDMR1 não apresentou variação com relação ao tamanho ou a posição dos cotilédones, enquanto que a H19DMR apresentou diferença estatisticamente significativa na média de metilação com relação ao tamanho dos cotilédones e ao posicionamento nos quadrantes; em consequência da hipometilação em cotilédones pertencentes a uma das placentas estudadas. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na média de metilação da KvDMR1 e da H19DMR entre diferentes tecidos das amostras do primeiro trimestre gestacional. No entanto, a comparação entre tecidos pareados de um mesmo indivíduo mostrou que a metilação não é correspondente entre os tecidos. Os dados obtidos mostram que o imprinting genômico provavelmente é um processo dinâmico, que evolui ao longo da gestação, estando relacionado a formação e ao amadurecimento da placenta. No presente estudo foi possível verificar que cotilédones de uma mesma placenta apresentam diferentes padrões de inativação do cromossomo X. Diferenças que podem ser explicadas pela expansão clonal das células trofoblásticas progenitoras com o cromossomo X paterno ou o cromossomo X materno inativo. Devido à variabilidade epigenética, exames em tecidos placentários devem considerar as diferenças intra-placentárias e as diferenças entre tecidos embrionários e extraembrionários. / Genomic imprinting, a mechanism of allele-specific expression depending on parental origin, is an epigenetic process that regulates the expression of many genes involved in placental development. Several important genes for fetal and placental growth are located on the human chromosome region 11p15.5, which are regulated by two imprinting control regions (ICR1 e 2), which have the differentially methylated regions H19DMR and KvDMR1, respectively. Genomic imprinting and random inactivation of X chromosome are two epigenetic processes present in placental mammals. The present study aimed to verify the presence of epigenetic mosaicism between extra-embryonic and embryonic tissues from early stages of pregnancy (first trimester), and in chorionic villi of term placentas (third trimester). Samples were collected from 10 pregnancies in the first trimester (chorionic villous, amnion, umbilical cord membrane, and embryonic tissue) and 14 from third trimester (chorionic villus sampling), of which 10 were considered as controls and four used to study mosaicism restricted to chorionic villi (sampling of all cotyledons). After DNA extraction, we used real time PCR associated to enzymatic restriction with a methylation sensitive enzyme to study the methylation pattern of KvDMR1 and H19DMR in different tissues from first trimester and placental third trimester tissue. The pattern of X chromosome inactivation was evaluated in all cotyledons from two term placentas of female fetuses, using the human androgen receptor (HUMARA) assay, capillary electrophoresis, and adding a new X chromosome inactivation (ICX1) marker. Unpaired and paired t and Turkey tests were used in statistical analysis. The average methylation of KvDMR1 of chorionic villi samples in first trimester was statistically different from average methylation of the third trimester. While the methylation of H19DMR showed no statistically significant difference between chorionic villi samples in the first and third trimester of pregnancy. In relation to the mosaicism, the KvDMR1 methylation did not vary in respect to the size or position of the cotyledons, while H19DMR showed statistically significant difference in average methylation relative to the size of the cotyledons, to the position in quadrants, due to the hypomethylation in cotyledons from one studied placenta. There were no statistically significant differences in the mean methylation KvDMR1 and H19DMR among different tissues from the first trimester of pregnancy, however, the comparison between paired tissues from the same individual showed that the methylation is different between tissues. The data from this study showed that genomic imprinting is probably a dynamic process and evolved across human pregnancy. This process is probable connected to placenta formation and maturation. We observed different patterns of X chromosome inactivation in cotyledons from the same placenta. This difference could be explained by clonal expansion of a limited number of trophoblastic progenitor cells with either an inactive maternal or paternal X chromosome. Due to the epigenetic variability, placental tissue examinations must consider the differences intra-placental and differences between embryonic and extra-embryonic tissues.

ARAUJO, F. M. Ocorrência Familial e Associação de Polimorfismos dos Genes H19 e IGF2 com as Síndromes Hipertensivas Gestacionais. 2007. 118f. Disertação (Mestrado) Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007. As síndromes hipertensivas gestacionais [Pré-eclâmpsia/eclâmpsia (PE/E), hipertensão gestacional (HG) e hipertensão arterial crônica (HAC)] estão entre as maiores causas de morte materna e fetal. A PE é a mais prevalente dessas síndromes e o papel dos fatores genéticos na sua etiologia é bem aceito, embora o padrão de herança seja ainda assunto para debate. Os genes H19 e IGF2 sofrem imprinting (marcação) genômico e estão envolvidos na formação placentária e no desenvolvimento fetal. O objetivo do presente trabalho foi a pesquisa de ocorrência familial e da associação com os polimorfismos H19/RsaI e do IGF2/ApaI das síndromes hipertensivas gestacionais e do peso do recém-nascido. Todas as pacientes do estudo foram atendidas no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo e o projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética deste hospital e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa. Para a condução do estudo familial foram selecionadas 226 mulheres (75 apresentavam PE, 49 com HG e 102 do grupo controle). Os dados foram analisados pelos Testes Exato de Fisher e do Qui-quadrado, resultando em uma maior freqüência estatisticamente significativa (p <0,05) de parentes de primeiro-grau com PE/E entre o grupo de PE/E comparado aos outros grupos. Não foi observada influência da cor da pele na distribuição entre os grupos de pacientes. Para a pesquisa de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição H19/RsaI (alelos A e B) e IGF2/ApaI (alelos A e G) através da reação em cadeia da polimerase , foi extraído DNA de sangue periférico de 236 pacientes (55 apresentavam PE, 40 com HG, 34 com HAC e 107 do grupo controle). Os resultados, analisados através dos Testes do Qui-quadrado e G, não mostraram associação estatisticamente significativa entre os polimorfismos e as síndromes hipertensivas gestacionais ou HAC. Houve uma maior freqüência do alelo G na população estudada. Foi observado que em torno de 80% das pacientes dos quatro grupos estudados apresentou pelo menos uma cópia do alelo B e uma do alelo G, concomitantemente. A associação do peso do recém-nascido com os polimorfismos foi analisada utilizando-se os Testes Kolmogorov-Smirnov (a P<0,05) e os Não-paramétricos de Kruskal-Wallis (a P<0,05), não tendo sido evidenciadas diferenças estatisticamente significativas. No grupo da PE houve uma diminuição estatisticamente significativa do peso dos recém-nascidos quando não havia correção para a idade gestacional. Embora não tenha sido evidenciada correlação entre os polimorfismos e os fenótipos estudados, trabalhos futuros com um número amostral maior serão importantes para auxiliar no entendimento do envolvimento de fatores epigenéticos nas síndromes hipertensivas gestacionais e fornecer indícios para a prevenção, o tratamento e o aconselhamento genético. / ARAUJO, F. M. Familial Occurrence and H19 and IGF2 Polymorphism Association with Gestational Hypertensive Disorders. 2007. 118p. Dissertation (Master\'s degree) - University of Medicine, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2007. Gestational hypertensive disorders [preeclampsia/eclampsia (PE/E), gestational hypertension (GH) and chronic hypertension (CH)] are among the largest causes of maternal and fetal death. PE is the more prevalent of those syndromes and the role of the genetic factors in its etiology is well accepted, although the pattern of inheritance is still subject for debate. The imprinted genes H19 and IGF2 are involved in the placental formation and in the fetal development. The objective of the present study was to verify the familial occurrence of these disorders and the H19/RsaI and IGF2/ApaI polymorphism association with gestational hypertensive disorders and the weight of the newborn. All patients of the study were referred to the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, University of São Paulo, and the project was approved by the Hospital Ethic Committee and the National Commission of Ethics in Research. For the familial study, 226 women were selected (75 presented PE/E, 49 with GH and 102 from the control group). The data were analyzed by Exact of Fisher and Qui-square tests, and the frequency of families with at least one female first-degree relative (mothers and/or sisters) with PE/E was higher among the PE/E group compared to the other groups, and it was statistically significant (P<0.05). There was no statistically significant influence of the \"skin color\". Blood samples of 236 pregnant women (55 with PE/E, 40 with GH, 34 with CH and 107 from the control group) were obtained for DNA extraction, and PCR. Genotyping was carried out by enzymatic digestion with ApaI (IGF2) and RsaI (H19). The statistical analyses were performed by Qui-square and G tests. The genotypes were not significantly associated with the different groups. A higher frequency of the G allele (IGF2) was observed. Around 80% of the patients presented at least one copy of the allele B (H19) and G (IGF2), concomitantly. The association of the weight of the newborn with the polymorphisms was analyzed using the Kolmogorov-Smirnov (P <0.05) and the No-parametric Test of Kruskal-Wallis (P <0.05) tests, and statistically significant differences were not evidenced. In the group of the PE/E there was a statistically significant decrease of the weight of the newborn when the correction for the gestational age was not carried out. Although correlation has not been evidenced between the polymorphisms and the phenotypes, future studies with a higher number of patients and other imprinted genes will be important to elucidate the involvement of epigenetic factors for the prevention, treatment and genetic counseling of the gestational hypertensive disorders

O imprinting genômico é um processo regulado epigeneticamente que faz com que os alelos sejam expressos de acordo com a sua origem parental. No cromossomo 11 (11p15.5), existem duas regiões controladoras de imprinting (ICR1 e ICR2), que controlam a expressão de genes marcados (imprinted). Os padrões de metilação dessas regiões podem ser alterados pela dissomia uniparental (DUP), que ocorre quando parte de ou um cromossomo inteiro do mesmo par de homólogos é herdado de somente um genitor. Erros mitóticos podem gerar mosaicismo com uma linhagem de células com DUP e a outra biparental. As síndromes de Silver-Russell (SSR) e Beckwith-Wiedemann (SBW) são doenças de alterações do imprinting genômico, envolvendo os cromossomos 7 (SSR) e 11 (SSR e SBW). A Hemihiperplasia Isolada (HHI) parece corresponder a uma forma mais leve da SBW.. No presente trabalho, foi realizada uma varredura in silico para busca de novos microssatélites nos cromossomos 7 e 11, e selecionados seis do tipo tetra ou pentanucleotídeos, no cromossomo 7, e 12, no cromossomo 11. O perfil de metilação nas ICRs foi verificado por três técnicas distintas: MS-MLPA, DESM-RT e por uma nova estratégia desenvolvida neste trabalho denominada DESM-QFPCR. Foram avaliados 32 pacientes com SBW, 16 HHI, 20 com SSR e seus pais, quando disponíveis, além de um paciente com fenótipo aparentemente normal com cariótipo 46,XX/46,XY e cuja placenta apresentou displasia mesenquimal placentária (DMP) a qual está associada à SBW. Os novos marcadores apresentaram alta taxa de heterozigose (média de 70%), e ausência das características indesejáveis dos dinucleotídeos predominantemente utilizados para detecção de DUP. Seis marcadores estão entre genes controlados pelas ICRs 1 e 2. A DUP paterna do cromossomo 11 (DUPpat Cr11), sempre restrita a 11p15.5, foi responsável por 13% dos casos de HHI e 19% dos de SBW. As alterações estruturais foram confirmadas por minissequenciamento quantitativo de SNPs e por MS-MLPA. Um paciente apresentou duplicação paterna abrangendo ambas as ICRs. Uma deleção não descrita anteriormente no gene CDKN1C foi observada em uma paciente e sua mãe. Para os pacientes com DUPpat Cr11, foram investigados microssatélites em 13 autossomos e nos cromossomos sexuais para detecção de mosaicismo global. Apenas o paciente com DMP apresentou mosaicismo [células androgenéticas (25-30%) e biparentais], sugerindo evento de dupla fertilização. Nos pacientes com SSR, foi observada hipometilação na ICR1 em 25% dos casos. Para a SBW, foi observada hipermetilação na ICR1 e hipometilação na ICR2 em 6% e 42% dos casos, respectivamente. Os casos com DUPpat Cr11 apresentaram alteração de metilação em ambas as ICRs. As frequências de alterações (epi) genéticas encontradas foram semelhantes às previamente descritas na literatura para as SBW, SSR e HHI. Neste trabalho, foi desenvolvida uma nova técnica para estudo de metilação do DNA de ICRs e testados marcadores microssatélites inéditos na região 11p15, que quando comparados com metodologias mais tradicionais de avaliação, como DESM-RT e MS-MLPA, mostraram elevada correlação dos resultados. Os achados mostram a complexidade da etiologia das doenças estudadas no presente trabalho e os dados moleculares serão imprescindíveis para o aconselhamento genético adequado para cada caso em particular e suas famílias. / Genomic imprinting is a epigenetically regulated process where the alleles are expressed in terms of their parental origin. On chromosome 11 (11p15.5) there are two regions controlling imprinting (ICR1 and ICR2), which control imprinted gene expression. The methylation patterns in these regions may be altered by uniparental disomy (UPD), which occurs when part or whole chromose is inherited from only one parent. Mitotic errors can lead to mosaicism with a cell line with DUP and other, biparental. The Silver-Russell syndrome (SRS) and Beckwith-Wiedemann syndrome (BWS) are diseases of abnormal genomic imprinting, involving chromosomes 7 (SSR) and 11 (SRS and BWS). The Isolated Hemihiperplasia (IHH) seems to correspond to a milder form of the SBW. In the present study, we performed an in silico scan to search for new microsatellites on chromosomes 7 and 11, and selected six tetra- and/or pentanucleotides on chromosome 7, and 12 on chromosome 11. The pattern of methylation in ICRs was verified by three different techniques: MS-MLPA, DESM-RT and a new strategy developed in this work called DESM-QFPCR. We evaluated 32 patients with BWS, HHI 16, with 20 SSR and their parents, when available, and one patient with apparently normal phenotype with karyotype 46, XX/46, XY and whose placenta showed placental mesenchymal dysplasia (PMD) which is associated with SBW. The new markers showed a high heterozygosity rate (average 70%), and absence of undesirable characteristics of dinucleotides, predominantly used for detection of DUP. Six markers spans genes controlled by the ICRs 1 and 2. The paternal UPD for chromosome 11 (UPDpat Cr11), all restricted to 11p15.5, was responsible for 13% of cases of HHI and 19% of the SBW. Structural changes were confirmed by quantitative SNaPshot sequencing of SNPs and MS-MLPA. One patient had paternal duplication encompassing both ICRs. A not previously described deletion in the gene CDKN1C was observed in one patient and her mother. For patients with DUPpat Cr11, microsatellites were investigated in 13 autosomes and sex chromosomes to detect wide mosaicism. Only patients with DMP showed mosaicism [androgenetic cells (25-30%) and biparental], suggesting double fertilization. In patients with SRS, ICR1 hypomethylation was observed in 25% of cases. For BWS, ICR1 hypermethylation and in ICR2 hypomethylation were observed 6% and 42% of cases, respectively. All cases with UPDpat Cr11 presented abnormal methylation in both ICRs. The (epi) genetic change frequencies were similar to those previously described in the literature for BWS, SRR andIHH. In the present work, we developed a new technique to study DNA methylation of ICRs and tested novel microsatellite markers in the 11p15 region, which showed high correlation of results, when compared with more traditional methods such as RT-DESM and MS-MLPA. The results show the complex etiology of these diseases and the molecular data are essential for appropriate patient and families genetic counseling.

O imprinting genômico é um processo epigenético essencial para o desenvolvimento normal de mamíferos com placenta e refere-se à expressão gênica alelo-específica, de acordo com a origem parental. A expressão dos genes marcados por imprinting é controlada por regiões diferencialmente metiladas (DMRs), situadas em regiões controladoras de imprinting (ICRs). O cromossomo 29 de Bos taurus possui dois domínios cromossômicos semelhantes à região 11p15.5 de humanos, que são denominados KvDMR1 (na ICR2) e H19DMR (na ICR1). Essas ICRs controlam um cluster de genes importantes para o crescimento e desenvolvimento, sendo a KvDMR1 metilada no alelo materno e a e H19DMR metilada no alelo paterno. No presente trabalho, foi verificado o padrão de metilação da KvDMR1 e da H19DMR em oócitos não maturados (Vg) e maturados in vitro (MII) e nos blastocistos inicial (Bi) e expandido (Bx) bovinos e em placentas bovinas e humanas de primeiro trimestre. Foram coletados oócitos e embriões pré-implantação no estágio de blastocisto produzidos pela técnica de Fertilização in vitro. Também foram coletados o tecido placentário e de um feto bovino de 49 dias e de uma placenta humana, com idade gestacional de 12 semanas. O DNA genômico foi extraído e modificado com bissulfito de sódio. O padrão de metilação das regiões KvDMR1 e H19DMR foi verificado por meio de clonagem e seqüenciamento do DNA modificado com bissulfito de sódio. Para as análises de expressão gênica nos oócitos e blastocistos, foi realizada a extração do RNA e em seguida o cDNA foi produzido para a quantificação relativa da expressão gênica por meio da técnica de PCR em tempo real. Os resultados de metilação para a amostra controle de espermatozóide apresentaram um perfil hipometilado para a KvDMR1 e hipermetilado para a H19DMR. Os oócitos Vg e MII mostraram um perfil hipermetilado para a KvDMR1 e nos Bi e Bx foi observado um perfil hipermetilado e hipometilado, respectivamente. Para a H19DMR, foi observado um perfil hipermetilado para as amostras Vg e MII, sendo que para os Bi foi observado um perfil hipometilado e, para os Bx, um perfil monoalélico de expressão. A expressão dos genes LIT1 e IGF2 foi relativamente baixa nas amostras analisadas, sendo que o gene LIT1 foi expresso nos mesmos níveis para todas as amostras e o IGF2 não foi expresso nos Bi e Bx. Os oócitos MII apresentaram altos níveis de expressão do IGF2 quando comparados com os oócitos Vg. Nas placentas precoces de bovinos, a porcentagem de metilação para a KvDMR1 variou entre os cotilédones de 39,6%. e 88,9%. A porcentagem de metilação para a H19DMR nos cotilédones variou entre 35,0% e 57,0% , sendo que apenas uma amostra apresentava-se completamente demetilada para esta ICR. Nas análises das vilosidades humanas, foi observado um perfil hipermetilado em todas as amostras analisadas, em que as porcentagens de metilação para a KvDMR1 e H19DMR variaram entre 84,4% e 97,9%. Os resultados mostram um perfil alterado de metilação nos oóctios MII para as duas regiões analisadas, e uma alteração nas amostras de oócitos Vg para a H19DMR. Para os blastocistos, o esperado seria um perfil monoalélico para as duas regiões, no entanto, esse resultado só foi encontrado para os Bx na H19DMR. Em bovinos, as DMRs apresentaram um funcionamento antagônico, enquanto a KvDMR1 tende a uma hipermetilação a H19DMR tende a uma hipometilação. O resultado das análises comparativas das placentas bovina e humana não sugerem uma relação do padrão de metilação dessas regiões entre essas duas espécies, no entanto, servem de base para o conhecimento do imprinting na placenta. Os estudos nos oócitos e blastocistos realizados representam um passo inicial na investigação da influencia das tecnologias de reprodução assistida no desenvolvimento embrionário, sendo o primeiro relato do funcionamento dessas DMRs nas amostras de oócitos e embriões pré-implantação bovinos. / Genomic imprinting is an epigenetic process that plays an essential role in the development of placental mammals with a parent-of-origin-specific manner of gene expression, in which only one allele is expressed. The imprinted gene expression is controlled by differentially methylated regions (DMRs), located in imprinting control regions (ICRs). In Bos Taurus, chromosome 29 presents two imprinted domains similar to human 11p15.5 region which are named KDMR1 (in the ICR2) and H19DMR (in the ICR1). Several genes that play an essential role in growth and development are under the control of the ICRs, in which the KvDMR1 is methylated on the maternal allele and the H19DMR is methylated on the paternal allele. In this study, the DNA methylation status of the KvDMR1 and H19DMR was verified in bovine non-matured germinative vesicle (GV) in vitro matured (MII) oocytes, as well in early (EA) and expanded (EX) blastocysts, and in bovine and human early placenta. The oocytes and blastocysts were collected after in vitro fertilization (IVF) techniques. Tissues from bovine placenta and fetus with 49 days of gestational age and human placenta with 12 weeks of gestational age were also collected. The DNA was extracted and modified by sodium bisulfite. The methylation pattern of KvDMR1 e H19DMR was verified by cloning and bisulfite sequencing. RNA extraction and cDNA synthesis for the relative quantification of gene expression by real time PCR were performed for oocytes and blastocysts. The methylation profile for the control sample of sperm was hypomethylated for KvDMR1 and hypermethylated for H19DMR. The GV and MII oocytes showed a hypermethylated pattern for KvDMR1 and in the EA and EX was hypermethylated and hypomethylated, respectively. The H19DMR displayed a hypermethylated pattern for GV and MII oocytes. For EA was observed a hypomethylated profile and EX presented a monoallelic expression. The LIT1 and IGF2 gene expression were low for all samples, however the LIT1 had the same level of expression in all samples while the IGF2 was not expressed in EA and EX. The MII oocytes showed high levels of IGF2 gene expression when compared with GV oocytes. The methylation levels for KvDMR1 in bovine early placenta varied between the cotyledons (39,6% and 88,9%). The percentage of methylation for H19DMR in cotyledons varied between 57.0% to 35.0%. Only one sample was not methylated for this ICR1. In human villous, a hypermethylated profile was observed for all samples, and the percentage of methylation for KvDMR1 and H19DMR varied between 84.4% e 97.9%. The results show an altered methylation profile in MII oocytes for two analysed regions and an alteration of H19DMR in GV oocytes. The expected for blastocysts was a monoallelic profile for KvDMR1 and H19DMR, however these results were observed only in EX for H19DMR. In bovine, the methylation levels of KvDMR1 and H19DMR seems to work antagonistically. While the KvDMR1 tended to hypermethylation, the ICR1 tended to a hypomethylation. The comparative analysis of bovine and human early placentas does not suggest a relationship between the methylation patterns of these regions in these two species. However, these studies provide the basis for the understanding of imprinting in the placenta. The study in oocytes and blastocysts represent an initial investigation in understanding how the assisted reproductive technologies affect the embryo growth and development, and this is the first report on the methylation patterns of KvDMR1 and H19DMR in bovine oocytes and blastocysts.

Síndrome de Angelman (AS - MIM 105830) é causada pela ausência de função do gene UBE3A que codifica uma proteína ubiquitina - ligase (E6-AP). Esse gene é expresso bialelicamente em vários tecidos exceto no cérebro, onde a expressão é preferencialmente materna. O RNA anti-senso de UBE3A é considerado o regulador dessa expressão diferencial entre os alelos, e faz parte de um transcrito grande que só o alelo paterno é expresso devido ao imprinting genômico; no cérebro, esse transcrito se entende até a região anti-senso de UBE3A, mas nos demais tecidos o transcrito é menor e não engloba a região anti-senso. Este trabalho visa obter um modelo para estudo da AS. Células-tronco da polpa do dente (SHEDs) de pacientes com deleção do segmento 15q11-q13 ou mutação no gene UBE3A foram caracterizadas e submetidas à diferenciação neuronal. A diferenciação foi analisada através do estudo de RNA e proteínas para marcadores neuronais e, também, por testes funcionais. As SHEDs são células-tronco mesenquimais e constituem uma população heterogênea. Essas células ou algumas dessas células já expressam algumas proteínas neuronais ou de células excitáveis como nestina, &beta;-tubulina III, MAP2 e proteína de canais dependentes de voltagem de sódio e potássio. Um ponto interessante é que as SHEDs apresentam baixa expressão do UBE3A anti-senso e a expressão do UBE3A nas células de pacientes é menor que 50% da expressão encontrada nas células de controles, que pode indicar a ocorrência de expressão preferencial materna desse gene em outros tipos celulares além de neurônios maduros. Quando induzidas à diferenciação neurogênica, a maioria das linhagens controles apresentou aumento da expressão de MAP2 e, principalmente, &beta;-tubulina III; e a maioria das linhagens de pacientes com AS não apresentou aumento notável na expressão dessas proteínas, exceto uma linhagem de paciente que aumentou a expressão de &beta;-tubulina III. As células induzidas à diferenciação apresentaram aumento estatisticamente significativo da condutância de sódio através de canais de sódio dependentes de voltagem. Com a análise de expressão de UBE3A e do UBE3A anti-senso é possível afirmar que a expressão deles não alterou com a diferenciação neuronal. Assim, é possível concluir que as células-tronco da polpa do dente, com o protocolo de diferenciação neurogênica, progrediram na via de diferenciação, mas a maioria das células não atingiu o estágio de maturação necessário para que ocorresse o imprinting do UBE3A ou a via de diferenciação não ia em direção a neurônios que apresentam imprinting do UBE3A. / Angelman syndrome (AS - MIN 105830) is caused by the loss of function of the maternal UBE3A gene, which encodes an ubiquitin protein ligase (E6-AP). UBE3A displays biallelic expression in most of tissues, but maternal predominant expression is observed in the brain. A RNA antisense that is paternally expressed in some regions in the brain is considered to be responsible for this tissue-specific imprinting; UBE3A antisense is part of a large transcript that starts at SNURF-SNRPN gene and is paternally expressed, and in the brain this transcript includes UBE3A antisense region however in other tissues this region is not included. The aim of the present study is to develop a new model for studying AS. Dental pulp stem cells (SHEDs) were characterized and differentiated by an already described protocol. SHEDs intrinsically express some neuronal proteins as nestin, &beta;-tubulin III, MAP2 and voltage-gated sodium channels and potassium channels. Interestingly, SHEDs also present a low expression of UBE3A antisense, and UBE3A expression in cells from patients with AS is lower than 50% of the cells from normal control, so it is possible that preferential maternal expression of this gene might occur in some cells beyond mature neurons. After the neuronal differentiation, most control lineages and one lineage of AS patients had an increase of MAP2 and &beta;-tubulin III expression. Two control lineages and most lineages from AS patients did not have a notable increase of expression of these proteins. Neuronal differentiated cells displayed an increase in conductance through voltage-gated sodium channels. Analysis of UBE3A and UBE3A antisense expression in SHEDs and cells induced to differentiate into neurons indicated no changes in their expression. Thus, after neuronal differentiation induction, dental pulp stem cells progressed through neuronal differentiation pathway. However, most cells did not reach the stage which UBE3A imprinting occurs or the neuronal differentiation is resulting in a cell that do not present UBE3A imprinting.

O imprinting genômico é um processo epigenético essencial para o desenvolvimento normal de mamíferos com placenta e refere-se à expressão gênica alelo-específica, de acordo com a origem parental. A expressão dos genes marcados por imprinting é controlada por regiões diferencialmente metiladas (DMRs), situadas em regiões controladoras de imprinting (ICRs). O cromossomo 29 de Bos taurus possui dois domínios cromossômicos semelhantes à região 11p15.5 de humanos, que são denominados KvDMR1 (na ICR2) e H19DMR (na ICR1). Essas ICRs controlam um cluster de genes importantes para o crescimento e desenvolvimento, sendo a KvDMR1 metilada no alelo materno e a e H19DMR metilada no alelo paterno. No presente trabalho, foi verificado o padrão de metilação da KvDMR1 e da H19DMR em oócitos não maturados (Vg) e maturados in vitro (MII) e nos blastocistos inicial (Bi) e expandido (Bx) bovinos e em placentas bovinas e humanas de primeiro trimestre. Foram coletados oócitos e embriões pré-implantação no estágio de blastocisto produzidos pela técnica de Fertilização in vitro. Também foram coletados o tecido placentário e de um feto bovino de 49 dias e de uma placenta humana, com idade gestacional de 12 semanas. O DNA genômico foi extraído e modificado com bissulfito de sódio. O padrão de metilação das regiões KvDMR1 e H19DMR foi verificado por meio de clonagem e seqüenciamento do DNA modificado com bissulfito de sódio. Para as análises de expressão gênica nos oócitos e blastocistos, foi realizada a extração do RNA e em seguida o cDNA foi produzido para a quantificação relativa da expressão gênica por meio da técnica de PCR em tempo real. Os resultados de metilação para a amostra controle de espermatozóide apresentaram um perfil hipometilado para a KvDMR1 e hipermetilado para a H19DMR. Os oócitos Vg e MII mostraram um perfil hipermetilado para a KvDMR1 e nos Bi e Bx foi observado um perfil hipermetilado e hipometilado, respectivamente. Para a H19DMR, foi observado um perfil hipermetilado para as amostras Vg e MII, sendo que para os Bi foi observado um perfil hipometilado e, para os Bx, um perfil monoalélico de expressão. A expressão dos genes LIT1 e IGF2 foi relativamente baixa nas amostras analisadas, sendo que o gene LIT1 foi expresso nos mesmos níveis para todas as amostras e o IGF2 não foi expresso nos Bi e Bx. Os oócitos MII apresentaram altos níveis de expressão do IGF2 quando comparados com os oócitos Vg. Nas placentas precoces de bovinos, a porcentagem de metilação para a KvDMR1 variou entre os cotilédones de 39,6%. e 88,9%. A porcentagem de metilação para a H19DMR nos cotilédones variou entre 35,0% e 57,0% , sendo que apenas uma amostra apresentava-se completamente demetilada para esta ICR. Nas análises das vilosidades humanas, foi observado um perfil hipermetilado em todas as amostras analisadas, em que as porcentagens de metilação para a KvDMR1 e H19DMR variaram entre 84,4% e 97,9%. Os resultados mostram um perfil alterado de metilação nos oóctios MII para as duas regiões analisadas, e uma alteração nas amostras de oócitos Vg para a H19DMR. Para os blastocistos, o esperado seria um perfil monoalélico para as duas regiões, no entanto, esse resultado só foi encontrado para os Bx na H19DMR. Em bovinos, as DMRs apresentaram um funcionamento antagônico, enquanto a KvDMR1 tende a uma hipermetilação a H19DMR tende a uma hipometilação. O resultado das análises comparativas das placentas bovina e humana não sugerem uma relação do padrão de metilação dessas regiões entre essas duas espécies, no entanto, servem de base para o conhecimento do imprinting na placenta. Os estudos nos oócitos e blastocistos realizados representam um passo inicial na investigação da influencia das tecnologias de reprodução assistida no desenvolvimento embrionário, sendo o primeiro relato do funcionamento dessas DMRs nas amostras de oócitos e embriões pré-implantação bovinos. / Genomic imprinting is an epigenetic process that plays an essential role in the development of placental mammals with a parent-of-origin-specific manner of gene expression, in which only one allele is expressed. The imprinted gene expression is controlled by differentially methylated regions (DMRs), located in imprinting control regions (ICRs). In Bos Taurus, chromosome 29 presents two imprinted domains similar to human 11p15.5 region which are named KDMR1 (in the ICR2) and H19DMR (in the ICR1). Several genes that play an essential role in growth and development are under the control of the ICRs, in which the KvDMR1 is methylated on the maternal allele and the H19DMR is methylated on the paternal allele. In this study, the DNA methylation status of the KvDMR1 and H19DMR was verified in bovine non-matured germinative vesicle (GV) in vitro matured (MII) oocytes, as well in early (EA) and expanded (EX) blastocysts, and in bovine and human early placenta. The oocytes and blastocysts were collected after in vitro fertilization (IVF) techniques. Tissues from bovine placenta and fetus with 49 days of gestational age and human placenta with 12 weeks of gestational age were also collected. The DNA was extracted and modified by sodium bisulfite. The methylation pattern of KvDMR1 e H19DMR was verified by cloning and bisulfite sequencing. RNA extraction and cDNA synthesis for the relative quantification of gene expression by real time PCR were performed for oocytes and blastocysts. The methylation profile for the control sample of sperm was hypomethylated for KvDMR1 and hypermethylated for H19DMR. The GV and MII oocytes showed a hypermethylated pattern for KvDMR1 and in the EA and EX was hypermethylated and hypomethylated, respectively. The H19DMR displayed a hypermethylated pattern for GV and MII oocytes. For EA was observed a hypomethylated profile and EX presented a monoallelic expression. The LIT1 and IGF2 gene expression were low for all samples, however the LIT1 had the same level of expression in all samples while the IGF2 was not expressed in EA and EX. The MII oocytes showed high levels of IGF2 gene expression when compared with GV oocytes. The methylation levels for KvDMR1 in bovine early placenta varied between the cotyledons (39,6% and 88,9%). The percentage of methylation for H19DMR in cotyledons varied between 57.0% to 35.0%. Only one sample was not methylated for this ICR1. In human villous, a hypermethylated profile was observed for all samples, and the percentage of methylation for KvDMR1 and H19DMR varied between 84.4% e 97.9%. The results show an altered methylation profile in MII oocytes for two analysed regions and an alteration of H19DMR in GV oocytes. The expected for blastocysts was a monoallelic profile for KvDMR1 and H19DMR, however these results were observed only in EX for H19DMR. In bovine, the methylation levels of KvDMR1 and H19DMR seems to work antagonistically. While the KvDMR1 tended to hypermethylation, the ICR1 tended to a hypomethylation. The comparative analysis of bovine and human early placentas does not suggest a relationship between the methylation patterns of these regions in these two species. However, these studies provide the basis for the understanding of imprinting in the placenta. The study in oocytes and blastocysts represent an initial investigation in understanding how the assisted reproductive technologies affect the embryo growth and development, and this is the first report on the methylation patterns of KvDMR1 and H19DMR in bovine oocytes and blastocysts.

O imprinting genômico é um processo regulado epigeneticamente que faz com que os alelos sejam expressos de acordo com a sua origem parental. No cromossomo 11 (11p15.5), existem duas regiões controladoras de imprinting (ICR1 e ICR2), que controlam a expressão de genes marcados (imprinted). Os padrões de metilação dessas regiões podem ser alterados pela dissomia uniparental (DUP), que ocorre quando parte de ou um cromossomo inteiro do mesmo par de homólogos é herdado de somente um genitor. Erros mitóticos podem gerar mosaicismo com uma linhagem de células com DUP e a outra biparental. As síndromes de Silver-Russell (SSR) e Beckwith-Wiedemann (SBW) são doenças de alterações do imprinting genômico, envolvendo os cromossomos 7 (SSR) e 11 (SSR e SBW). A Hemihiperplasia Isolada (HHI) parece corresponder a uma forma mais leve da SBW.. No presente trabalho, foi realizada uma varredura in silico para busca de novos microssatélites nos cromossomos 7 e 11, e selecionados seis do tipo tetra ou pentanucleotídeos, no cromossomo 7, e 12, no cromossomo 11. O perfil de metilação nas ICRs foi verificado por três técnicas distintas: MS-MLPA, DESM-RT e por uma nova estratégia desenvolvida neste trabalho denominada DESM-QFPCR. Foram avaliados 32 pacientes com SBW, 16 HHI, 20 com SSR e seus pais, quando disponíveis, além de um paciente com fenótipo aparentemente normal com cariótipo 46,XX/46,XY e cuja placenta apresentou displasia mesenquimal placentária (DMP) a qual está associada à SBW. Os novos marcadores apresentaram alta taxa de heterozigose (média de 70%), e ausência das características indesejáveis dos dinucleotídeos predominantemente utilizados para detecção de DUP. Seis marcadores estão entre genes controlados pelas ICRs 1 e 2. A DUP paterna do cromossomo 11 (DUPpat Cr11), sempre restrita a 11p15.5, foi responsável por 13% dos casos de HHI e 19% dos de SBW. As alterações estruturais foram confirmadas por minissequenciamento quantitativo de SNPs e por MS-MLPA. Um paciente apresentou duplicação paterna abrangendo ambas as ICRs. Uma deleção não descrita anteriormente no gene CDKN1C foi observada em uma paciente e sua mãe. Para os pacientes com DUPpat Cr11, foram investigados microssatélites em 13 autossomos e nos cromossomos sexuais para detecção de mosaicismo global. Apenas o paciente com DMP apresentou mosaicismo [células androgenéticas (25-30%) e biparentais], sugerindo evento de dupla fertilização. Nos pacientes com SSR, foi observada hipometilação na ICR1 em 25% dos casos. Para a SBW, foi observada hipermetilação na ICR1 e hipometilação na ICR2 em 6% e 42% dos casos, respectivamente. Os casos com DUPpat Cr11 apresentaram alteração de metilação em ambas as ICRs. As frequências de alterações (epi) genéticas encontradas foram semelhantes às previamente descritas na literatura para as SBW, SSR e HHI. Neste trabalho, foi desenvolvida uma nova técnica para estudo de metilação do DNA de ICRs e testados marcadores microssatélites inéditos na região 11p15, que quando comparados com metodologias mais tradicionais de avaliação, como DESM-RT e MS-MLPA, mostraram elevada correlação dos resultados. Os achados mostram a complexidade da etiologia das doenças estudadas no presente trabalho e os dados moleculares serão imprescindíveis para o aconselhamento genético adequado para cada caso em particular e suas famílias. / Genomic imprinting is a epigenetically regulated process where the alleles are expressed in terms of their parental origin. On chromosome 11 (11p15.5) there are two regions controlling imprinting (ICR1 and ICR2), which control imprinted gene expression. The methylation patterns in these regions may be altered by uniparental disomy (UPD), which occurs when part or whole chromose is inherited from only one parent. Mitotic errors can lead to mosaicism with a cell line with DUP and other, biparental. The Silver-Russell syndrome (SRS) and Beckwith-Wiedemann syndrome (BWS) are diseases of abnormal genomic imprinting, involving chromosomes 7 (SSR) and 11 (SRS and BWS). The Isolated Hemihiperplasia (IHH) seems to correspond to a milder form of the SBW. In the present study, we performed an in silico scan to search for new microsatellites on chromosomes 7 and 11, and selected six tetra- and/or pentanucleotides on chromosome 7, and 12 on chromosome 11. The pattern of methylation in ICRs was verified by three different techniques: MS-MLPA, DESM-RT and a new strategy developed in this work called DESM-QFPCR. We evaluated 32 patients with BWS, HHI 16, with 20 SSR and their parents, when available, and one patient with apparently normal phenotype with karyotype 46, XX/46, XY and whose placenta showed placental mesenchymal dysplasia (PMD) which is associated with SBW. The new markers showed a high heterozygosity rate (average 70%), and absence of undesirable characteristics of dinucleotides, predominantly used for detection of DUP. Six markers spans genes controlled by the ICRs 1 and 2. The paternal UPD for chromosome 11 (UPDpat Cr11), all restricted to 11p15.5, was responsible for 13% of cases of HHI and 19% of the SBW. Structural changes were confirmed by quantitative SNaPshot sequencing of SNPs and MS-MLPA. One patient had paternal duplication encompassing both ICRs. A not previously described deletion in the gene CDKN1C was observed in one patient and her mother. For patients with DUPpat Cr11, microsatellites were investigated in 13 autosomes and sex chromosomes to detect wide mosaicism. Only patients with DMP showed mosaicism [androgenetic cells (25-30%) and biparental], suggesting double fertilization. In patients with SRS, ICR1 hypomethylation was observed in 25% of cases. For BWS, ICR1 hypermethylation and in ICR2 hypomethylation were observed 6% and 42% of cases, respectively. All cases with UPDpat Cr11 presented abnormal methylation in both ICRs. The (epi) genetic change frequencies were similar to those previously described in the literature for BWS, SRR andIHH. In the present work, we developed a new technique to study DNA methylation of ICRs and tested novel microsatellite markers in the 11p15 region, which showed high correlation of results, when compared with more traditional methods such as RT-DESM and MS-MLPA. The results show the complex etiology of these diseases and the molecular data are essential for appropriate patient and families genetic counseling.