O desenvolvimento de biossensores é um tema de pesquisa bastante promissor, uma vez que permite monitorar diversas classes de substâncias, que muitas vezes apresentam grande interesse nas mais diversas áreas da ciência. Biossensores são pequenos dispositivos que utilizam componentes biológicos como elementos de reconhecimento, ligados a um sistema dedetecção, transdução e amplificação do sinal gerado na reação com o analito-alvo. Podem ser utilizados diversos elementos, sendo os principais, atualmente, aqueles baseados em aptâmeros e nanomateriais, por sua alta especificidade e sensibilidade. Seu potencial de utilização varia desde a detecção e tratamento de doenças ou a medição de componentes nos fluidos biológicos, até o monitoramento ambiental e prevenção de contaminação e bioterrorismo. Neste projeto foi desenvolvido um biossensor eletroquímico cujo objetivo é identificar toxinas inoculadas em pacientes que sofreram acidentes com animais peçonhentos. Foram utilizados os anticorpos/imuniglobulinas comerciais e a peçonha bruta de jararaca (Bothrops) para fazer o estudo/desenvolvimento do biossensor. Neste trabalho foram apresentados os resultados da imobilização dos anticorpos (imunoglobulinas) sobre o eletrodo de trabalho, bem como sua resposta eletroquímica utilizando voltametria cíclica. As soluções utilizadas foram de NaCl 0,9% e tampão fosfato (0,1 mol.L-1) com pH=7,4 por ser bem próximo ao pH fisiológico, pois, posteriormente quer se investigar em plasma sanguíneo. Os voltamogramas cíclicos e a microscopia eletrônica de varredura mostraram a diferença do eletrodo com e sem a imobilização das imunoglobulinas, evidenciando que o biossensor é eficaz para o sistema analisado, sendo promissor aos estudos. Com o biossensor construído, foi investigada a resposta eletroquímica relativa à interação antígeno-anticorpo (veneno-soro) para analisar a interação específica entre eles, sendo o resultado positivamente o esperado. / The development of biosensors is a research topic very promising, since it allows you to monitor various classes of substances, which often exhibit great interest in several areas of science. Biosensors are small devices that use biological recognition elements and components, bound to a selfAdetecting system, transduction and amplification of the signal generated in the reaction with the target analyte it. Various elements, the main currently those based on aptamers and nanomaterials for their high specificity and sensitivity can be used. Their potential use varies from the detection and treatment of diseases or measurement of components in biological fluids to the environmental monitoring and contamination prevention and bioterrorism. In this project we developed an electrochemical biosensor whose objetico is inoculated identify toxins in patients who have suffered accidents with poisonous animals. Antibodies / commercial imuniglobulinas and the crude venom of pit viper (Bothrops) were used to study / development of the biosensor. In this work the results of immobilization of antibodies (immunoglobulins) on the working electrode and its electrochemical response using cyclic voltammetry were presented. The solutions used were 0.9% NaCl and phosphate buffer (0.1 mol L-1) of pH = 7.4 to be close to physiological pH and therefore further investigated whether in blood plasma. Cyclic voltammetry and scanning electron microscopy showed the difference of the electrode with and without immobilization of immunoglobulins, indicating that the biosensor is effective for the system analyzed, and promising to studies. With the biosensor constructed, we investigated the electrochemical response on the antigen-antibody (venom antiserum) interaction to analyze the specific interaction between them, the result being positively expected.

A dengue é uma doença negligenciada que carece de métodos diagnósticos rápidos nos primeiros dias de infecção. São quatro sorotipos diferentes, cuja monitoração é essencial para o controle da ocorrência de casos graves como a dengue hemorrágica. É urgente o desenvolvimento e disponibilização de um dispositivo capaz de suprir essa demanda, de modo que propomos a utilização de imunossensores potenciométricos, devido a facilidade de miniaturização e produção dos dispositivos e seu baixo custo, além da possibilidade de detecção direta (sem marcadores) e simplicidade de manuseio. Dispositivos sensores de pH, como o transistor de efeito de campo de porta estendida e separada (SEGFET) e amplificadores de instrumentação (AI) podem ser utilizados como transdutores de sinal para a reação antígeno-anticorpo, a partir da utilização de materiais não nernstianos, como o ouro, como plataforma sensível. A proteína NS1 do vírus da dengue é um excelente marcador da infecção, pois é secretada em altas concentrações pelo vírus no sangue de pessoas infectadas logo nos primeiros dias, de modo que o sistema preza pelo diagnóstico precoce da doença. Sua detecção é realizada através da imobilização de anticorpos anti-proteína NS1 na plataforma sensível, permitindo sua quantificação através da detecção da alteração local de carga. O eletrodo foi caracterizado por diversas técnicas de microscopia, entre elas de varredura, confocal e de força atômica, além da utilização de espectroscopia de impedância eletroquímica, permitindo um amplo conhecimento da superfície da membrana sensível. Os imunossensores desenvolvidos apresentaram alta sensibilidade, com capacidade de detecção da ordem de ng.mL-1. Na região linear da curva analítica, foram obtidos sensibilidade correspondente a (15.7 ± 4.4) .10-4 μA.μg.mL-1 para o SEGFET e (3.2 ± 0.3) mV.μg.mL-1 para o AI, sendo que este último apresenta uma maior estabilidade de sinal e dispensa a utilização de uma fonte variável de tensão, reduzindo o custo no desenvolvimento de um dispositivo diagnóstico comercial. Estes resultados levaram a um pedido de patente e o prosseguimento do projeto através da miniaturização do sistema e detecção em amostras reais. / Dengue is a neglected disease that lacks fast diagnosis methods in the first days of infection. There are four different serotypes, which monitoring is essential to the occurrence control of severe cases as dengue hemorrhagic fever. The development of a device capable of fulfilling this demand is urgent, so we propose the use of potentiometric immunosensors, since its ease of miniaturization, mass production, low cost and the possibility of direct detection (label-free). pH sensor devices, as the separated extended gate field effect transistors (SEGFET) and instrumentation amplifiers (AI) can be applied as transducers to the antibody-antigen reaction by using non-nernstian materials such as gold as sensitive membrane. The non-structural 1 (NS1) protein is an excellent marker of infection, since its secreted in high concentration in the blood of infected people by the dengue virus in the first days, prioritizing early diagnosis. Its detection is made by immobilization of anti-NS1 protein antibodies, allowing its quantification by local charge changes. The electrode was characterized by many microscopy methods, including scanning electron, confocal and atomic force, besides electrochemistry impedance spectroscopy, providing a wide knowledge of the membrane surface. The developed immunosensors showed high sensitivity with detection capacity in the order of ng.mL-1. In the linear range of the analytic curve, were obtained sensitivities of (15.7 ± 4.4) .10-4 μA.μg.mL-1 for the SEGFET and (3.2 ± 0.3) mV.μg.mL-1 for the AI, whereas the latter has high signal stability sparring the use of a variable voltage source, minimizing the costs in the development of a commercial diagnostic device. These results led to a patent and the project continues by working in miniaturizing and real samples detection.

Os rins desempenham um papel fundamental no sistema urinário e sua principal função é a filtração do sangue. Uma das causas que podem comprometer o funcionamento dos rins é a Insuficiência Renal Aguda (IRA) que é definida como a diminuição da taxa de filtração glomerular (TFG) de forma rápida e inesperada, causando a perda da função renal. Essa doença apresenta um número significativo de internações e também óbitos. O marcador padrão usado nos exames laboratoriais é a creatinina sérica, no entanto, a concentração da creatinina sérica pode variar dependendo de vários fatores, como idade, sexo, nutrição, entre outros. Além disso, sua concentração não varia consideravelmente nas primeiras indicações da lesão renal. Dessa forma, o diagnóstico é tardio e a função renal já pode estar comprometida. A proteína cistatina C (CST3) vem sendo indicada como um novo marcador para a doença, mostrando superioridade especialmente para detectar pequenas variações da TFG. A concentração da cistatina C não varia significativamente com a idade, sexo e massa muscular. Assim, foi desenvolvido um imunossensor para detectar a cistatina C, usando a configuração de transistor de efeito de campo de porta estendida e separada (SEGFET). Os eletrodos foram caracterizados por várias técnicas como MEV, microscopia de força atômica, técnicas eletroquímicas e também foi analisada a sensibilidade do ouro. As etapas de construção do imunossensor, e a interação do anticorpo com concentrações crescentes da proteína foram verificadas através de técnicas eletroquímicas, na faixa de concentração de 3 a 100 ng.mL-1. Nas medidas no SEGFET observou-se uma mudança significativa da corrente após a adição da cistatina C e para as substâncias interferentes não. O imunossensor apresentou alta sensibilidade detectando concentrações bem baixas da proteína alvo. A curva analítica ΔIDS% x [CST3] obteve-se L.D. = 0,75 ng.mL-1, L.Q. = 2,27 ng.mL-1 e r = 0,98122. A curva analítica ΔVGS% x [CST3] obteve-se L.D. = 0,28 ng.mL-1, L.Q. = 0,87 ng.mL-1 e r = 0,99846. Embora tenha algumas limitações o imunossensor é inovador e apresenta muitas vantagens podendo ser aplicado futuramente para o diagnóstico da doença. / The kidneys play a key role in the urinary system and its main function is the filtration of blood. One of the causes that can compromise the functioning of the kidneys is the Acute Kidney Injury (AKI), which is defined as the quickly and unexpected decrease in Glomerular Filtration Rate (GFR), causing the loss of kidney function. This disease presents a significant number of hospitalizations and also deaths. The standard marker used in laboratory tests is serum creatinine, however, serum creatinine concentration may vary depending on a number of factors, such as age, sex, nutrition, and so on. In addition, its concentration does not vary considerably in the first indications of renal injury. Thus, the diagnosis is delayed and renal function may already be compromised. The cystatin C protein (CST3) has been indicated as a new marker for the disease, showing superiority especially for detecting small variations in GFR. The concentration of cystatin C does not vary significantly with age, sex and muscle mass. Thus, an immunosensor was developed to detect cystatin C using the extended and a separate gate field effect transistor (SEGFET) configuration. The electrodes were characterized by several techniques such as SEM, atomic force microscopy, electrochemical techniques and also the sensitivity of gold was analyzed. The construction of the immunosensor, and the interaction of the antibody with increasing concentrations of the protein were verified by electrochemical techniques, in the concentration range of 3 to 100 ng.mL-1. In the measurements in the SEGFET a significant change of the current was observed after the addition of cystatin C and for the interfering substances there was no difference. The immunosensor showed high sensitivity detecting very low concentrations of the target protein. The analytical curve ΔIDS% x [CST3] was obtained L.D. = 0,75 ng.mL-1, L.Q. = 2,27 ng.mL-1 and r = 0,98122. The analytical curve ΔVGS% x [CST3] was obtained L.D. = 0,28 ng.mL-1, L.Q. = 0,87 ng.mL-1 and r = 0,99846. Although it has some limitations the immunosensor is innovative and presents many advantages and can be applied in the future to diagnose the disease.

Orientador: Elenice Deffune / Resumo: A Hemorragia feto-materna (HFM) se dá pela transferência do sangue fetal para o compartimento intravascular materno, devido à ruptura na membrana vásculo-sincicial da placenta. A HFM pode ser responsável pela alosensibilização do sistema imune materno, levando a morbidade e mortalidade de gravidez corrente e/ou de futura, assim como também constitui a base da etiopatogenia de várias afecções, como se verifica na doença hemolítica perinatal que expõe a complicações fetais como, hidropsia, danos cerebrais hipóxicos e morte fetal. Detectar e quantificar hemácias fetais ajuda a prevenir as consequências devida a ocorrência da HFM. Entre os testes diagnósticos utilizados na detecção e quantificação têm - se os mais sensíveis o teste quantitativo de Kleihauer e Betke e o de Citometria de fluxo, sendo o primeiro considerado padrão ouro. Tendo em vista a importância do diagnóstico laboratorial da HFM foi desenvolvida a proposta da construção de imunossensor para detecção de amostras de sangue fetal na corrente sanguínea materna. Foi realizada a produção de anticorpo monoclonal com objetivo de produzir anticorpos contra antígenos de superfícies de hemácias fetais humana e também foram realizadas a construção de unidades sensoriais para detecção de sinal biológico de imunoafinidade entre anticorpos que detectam hemácias fetais e a hemoglobina fetal presente nestas células, a fim de se diagnosticar a ocorrência da HFM. Foram obtidos como resultados a produção de anticorpo monoclonal que... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Fetomaternal hemorrhage (FMH) occurs through the transfer of fetal blood into the maternal intravascular compartment, due to rupture in the placenta-syncytial membrane. FMH may be responsible for the alosensitization of the maternal immune system, leading to morbidity and mortality of current and / or future pregnancies, as well as being the basis of the etiopathogenesis of various conditions, as in perinatal haemolytic disease that exposes to fetal complications such as hydrops, hypoxic brain damage, and fetal death. Detecting and quantifying fetal erythrocytes helps to prevent the consequences due to the occurrence of FMH. Among the diagnostic tests used in the detection and quantification are the most sensitive the quantitative test of Kleihauer and Betke and the one of Flow cytometry, being the first considered gold standard. Considering the importance of the laboratory diagnosis of FMH, the proposal of the construction of immunosensor for the detection of fetal blood samples in the maternal blood was developed. The production of a monoclonal antibody was carried out with the objective of producing antibodies against antigens on human fetal red blood cells and also the construction of sensorial units for the detection of biological signal of immunoaffinity between antibodies that detect fetal red blood cells and the fetal hemoglobin present in these cells, in order to diagnose the occurrence of FMH. The results obtained are the production of monoclonal antibody that detec... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Vários estudos que tentam compreender a gênese da aterosclerose têm demonstrado evidências que a oxLDL é peça importante para o desenvolvimento da doença, tornando-a um importante marcador. Os objetivos deste trabalho foram propor um novo imunossensor empregando anticorpos monoclonais anti-oxLDL e desenvolver um processo inovador de obtenção de anticorpos plásticos anti-oxLDL. Para construção do imunossensor, a região Fc do anticorpo foi ligada ao eletrodo de trabalho do dispositivo AuSPE (Screen-Printed Gold Electrodes), utilizando cisteamina. Posteriormente, foi adicionado BSA como bloqueador de possíveis regiões livres. Após o bloqueio, o imunossensor foi testado com oxLDL e outros antígenos, como forma de garantir a especificidade. Em relação aos anticorpos plásticos, chamados MAPS, estes foram desenvolvidos contruindo uma camada impressa de forma invertida ao anticorpo plástico SPAN, referência deste trabalho. Após obtenção dos MAPSs, estes passaram por diversos testes, similar ao imunossensor. Os resultados demonstraram excelente sensibilidade e especificidade às moléculas de oxLDL com detecção em tempo real em ambas as metodologias. / Increased levels of plasma oxLDL are associated with atherosclerosis, and the subsequent development of severe cardiovascular diseases that are today a major cause of death in modern countries. It is therefore important to find a reliable and fast assay to determine oxLDL. A new Immunosensor employing three monoclonal antibodies against oxLDL and a backside protein-surface imprinting process are proposed in this work. To generate the Immunosensor the mAbs were set-up by cysteamine on a gold layer of a disposable screen-printed electrode. BSA was immobilized further as bloker. All steps were followed by various characterization techniques such as electrochemical impedance spectroscopy and square wave voltammetry. To generate specific synthetic antibody materials, called MAPS, these were developed with a backside protein-surface imprinting process of the plastic antibody SPAN, the reference of the work. The devices were successfully applied to determine the oxLDL fraction in real serum, without prior dilution or necessary chemical treatment. Overall, these were promising results with the possibility to apply on the practical use of clinical.

Vários estudos que tentam compreender a gênese da aterosclerose têm demonstrado evidências que a oxLDL é peça importante para o desenvolvimento da doença, tornando-a um importante marcador. Os objetivos deste trabalho foram propor um novo imunossensor empregando anticorpos monoclonais anti-oxLDL e desenvolver um processo inovador de obtenção de anticorpos plásticos anti-oxLDL. Para construção do imunossensor, a região Fc do anticorpo foi ligada ao eletrodo de trabalho do dispositivo AuSPE (Screen-Printed Gold Electrodes), utilizando cisteamina. Posteriormente, foi adicionado BSA como bloqueador de possíveis regiões livres. Após o bloqueio, o imunossensor foi testado com oxLDL e outros antígenos, como forma de garantir a especificidade. Em relação aos anticorpos plásticos, chamados MAPS, estes foram desenvolvidos contruindo uma camada impressa de forma invertida ao anticorpo plástico SPAN, referência deste trabalho. Após obtenção dos MAPSs, estes passaram por diversos testes, similar ao imunossensor. Os resultados demonstraram excelente sensibilidade e especificidade às moléculas de oxLDL com detecção em tempo real em ambas as metodologias. / Increased levels of plasma oxLDL are associated with atherosclerosis, and the subsequent development of severe cardiovascular diseases that are today a major cause of death in modern countries. It is therefore important to find a reliable and fast assay to determine oxLDL. A new Immunosensor employing three monoclonal antibodies against oxLDL and a backside protein-surface imprinting process are proposed in this work. To generate the Immunosensor the mAbs were set-up by cysteamine on a gold layer of a disposable screen-printed electrode. BSA was immobilized further as bloker. All steps were followed by various characterization techniques such as electrochemical impedance spectroscopy and square wave voltammetry. To generate specific synthetic antibody materials, called MAPS, these were developed with a backside protein-surface imprinting process of the plastic antibody SPAN, the reference of the work. The devices were successfully applied to determine the oxLDL fraction in real serum, without prior dilution or necessary chemical treatment. Overall, these were promising results with the possibility to apply on the practical use of clinical.

Submitted by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2017-07-31T19:16:12Z No. of bitstreams: 2 thiago_coimbra_pimenta.pdf: 3361101 bytes, checksum: 026e379b14e8e90fdfd54a1c94b5e25d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2017-08-14T15:21:20Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) thiago_coimbra_pimenta.pdf: 3361101 bytes, checksum: 026e379b14e8e90fdfd54a1c94b5e25d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-14T15:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) thiago_coimbra_pimenta.pdf: 3361101 bytes, checksum: 026e379b14e8e90fdfd54a1c94b5e25d (MD5) Previous issue date: 2017 / A Dengue ? uma doen?a infecciosa viral de transmiss?o vetorial pelo mosquito Aedes aegypti, cujo controle tem se mostrado de solu??o complexa. Al?m disso, o diagn?stico cl?nico ? dif?cil de ser realizado, principalmente na fase aguda da doen?a, em que os sintomas s?o muito similares aos de outras infec??es febris agudas, e por essa raz?o o desenvolvimento de m?todos de detec??o mais efetivos para o seu controle, ganha relev?ncia. M?todos moleculares est?o sendo cada vez mais utilizados para o diagn?stico precoce por serem mais r?pidos e sens?veis. Nesse sentido, o uso de biossensores ganha relev?ncia por serem dispositivos vers?teis, de f?cil constru??o e utiliza??o, sens?veis e seletivos. Combinado com o uso de pol?meros modificadores da superf?cie transdutora, o que favorece a etapa de imobiliza??o das biomol?culas, os biodispositivos assim constru?dos se mostram mais sens?veis devido ? compatibilidade das caracter?sticas do elemento biol?gico e do filme polim?rico. Desta forma, este trabalho visou desenvolver um imunossensor impedim?trico para diagn?stico de Dengue utilizando eletrodos impressos de grafite (EI) funcionalizados com filmes polim?ricos derivados do ?cido 4-aminofenilac?tico (4-AFA). O imunossensor baseou-se na intera??o espec?fica entre o ant?geno da Dengue, a prote?na NS1, e os anticorpos anti-NS1. No estudo de caracteriza??o por voltametria c?clica (VC) da plataforma funcionalizada, observou-se que o filme polim?rico formado apresentou dois picos de oxida??o em +0,17 e +0,35 V em meio de solu??o de ?cido sulf?rico 0,50 M, o que mostra sua adsor??o e eletroatividade na superf?cie do eletrodo. Medidas de espectroscopia de imped?ncia eletroqu?mica (EIE) mostraram maior resist?ncia ? transfer?ncia eletr?nica do EI modificado com o filme polim?rico quando comparado ao EI sem modifica??o, corroborando o estudo anterior. Para o estudo de melhor concentra??o de NS1 para imobiliza??o, verificou-se que 1,00 ng/mL apresentou melhor sinal anal?tico, devido ? diminui??o nas intera??es que ocorre entre os ant?genos. O tempo de imunorrea??o entre ant?geno (Ag) e anticorpo (Ac) tamb?m foi estudado, no qual observou-se que o tempo ideal para que ocorra a imunocomplexa??o foi de 20 minutos. Em seguida, foi realizado estudo de dilui??o dos soros positivos e negativos por EIE, no qual foi poss?vel observar, para o soro positivo, que quanto mais dilu?do o soro maior foi o valor de Rct encontrado. O soro negativo tamb?m apresentou sinal anal?tico, provavelmente devido ? presen?a de anticorpos n?o espec?ficos, por?m, o sinal gerado apresentou valores mais pr?ximos do sinal da NS1, mostrando a seletividade da plataforma proposta. O estudo foi repetido em eletrodo sem modifica??o a fim de verifica a import?ncia do filme polim?rico na constru??o do biossensor. Observou-se que quando a NS1 ? imobilizada ao eletrodo n?o modificado, o Rct aumento muito pouco quando comparado ao eletrodo modificado com o filme derivado do 4-AFA, o que mostra a efici?ncia e sensibilidade da plataforma proposta. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Qu?mica, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2017. / Dengue is a viral infectious disease transmitted by the Aedes aegypti mosquito, whose control has shown a complex solution. In addition, the clinical diagnosis is difficult to perform, especially in the acute phase of the disease, in which the symptoms are very similar to other acute febrile infections, and for this reason the development of more effective detection methods for its control gains relevance. Molecular methods are being increasingly used for early diagnosis because they are faster and more sensitive. In this sense, the use of biosensors gains relevance because they are versatile devices, of easy construction and use, sensitive and selective. Combined with the use of transducing surface modifying polymers, which favors a stage of immobilization of the biomolecules, the biodevices constructed in this way are more sensitive due to the compatibility of the biological element characteristics and the polymer film. Thus, this work aimed to develop an impedimetric immunosensor to Dengue diagnose using screen-printed electrode (SPE) functionalized with polymer films derived from 4-aminophenylacetic acid (4-APA). The immunosensor was based on the specific interaction between Dengue antigen, NS1 protein, and anti-NS1 antibodies, IgG e IgM. In characterization study by cyclic voltammetry (CV) of the functionalized platform, it has been observed that the polymer film shown two oxidation peaks in +0.17 and +0.35 V in 0,5 M sulfuric acid solution medium, which shows its adsorption and electroactivity at the SPE surface. Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) measurements has shown a higher charge transfer resistance to the polymer film modified SPE when compared to the non-modified SPE, corroborating the previous study. For the study of NS1 best concentration to immobilization, it has been verified that 1,00 ng/mL presented better analytical signal, due to the decrease of the interactions that occur between the antigens. Immunoreaction time between antigens (Ag) and antibody (Ab) has also been studied, in which it has been observed that the ideal time for immunocomplexation was 20 minutes. Afterwards, a positive and negative sera dilution study was carried out by EIE, in which it has been possible to observe, for the positive serum, that the more diluted the serum the greater the Rct found. The negative serum also presented analytical signal, probably due to the presence of non-specific antibodies, however, the generated signal presented values closer to the NS1 signal, showing the selectivity of the proposed platform. The study was repeated in electrode without modification in order to verify the importance of the polymeric film in the biosensor construction. It was observed that when NS1 is immobilized to the non-modified electrode, Rct increases very little when compared to the 4-AFA derived film modified electrode, which shows the efficiency and sensitivity of the proposed platform.

Submitted by Livia Mello (liviacmello@yahoo.com.br) on 2016-09-13T12:57:37Z No. of bitstreams: 1 DissCRP.pdf: 2172178 bytes, checksum: e99c43cd09be9ecf3e7b2348a45607e3 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-15T13:28:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissCRP.pdf: 2172178 bytes, checksum: e99c43cd09be9ecf3e7b2348a45607e3 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-15T13:28:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissCRP.pdf: 2172178 bytes, checksum: e99c43cd09be9ecf3e7b2348a45607e3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-15T13:28:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissCRP.pdf: 2172178 bytes, checksum: e99c43cd09be9ecf3e7b2348a45607e3 (MD5) Previous issue date: 2016-02-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Breast cancer is the most common type of cancer among women and results in 70% of cases of estrogen receptor alpha (ERα) overexpression, a tumor biomarker. In the present study we developed a sensitive and low cost disposable electrochemical immunosensor, coupled with a microfluidic system, as an alternative to determine ERα, since there are no reports on the determination of this compound in the literature using this method. The immunosensor was developed by the screen printing method, comprising a reference electrode, a counter electrode and an array of eight working electrodes, all disposable. The working electrodes were modified by layer-by-layer with poly(diallyldimethylammonium chloride) (PDDA) and gold nanoparticles decorated with glutathione (AuNP-GSH), in order to support, by covalent bond, a double-stranded DNA containing an estrogen response element (dsDNA-ERE). Also, we use magnetic particles containing thousands of antibodies and enzymes, wherein the enzymes are responsible for indirect response from the immunosensor and antibodies are used to capture the analyte in the sample. Once that the analyte is captured, it interacts with the dsDNA-ERE immobilized on the surface of the working electrode. In the linear range 16.6 to 513.3 fg mL-1 were obtained detection limit of 10.0 fg mL-1, quantification limit of 16.89 fg mL-1 and a sensitivity of 7.7 nA mL fg [ ERα]-1. Finally, it was possible to test the immunosensor front of a real sample lysate cells MCF-7, which showed that the device is a promising choice for use in the treatment and possible early diagnosis of breast cancer. / O câncer de mama é o tipo mais comum de câncer entre as mulheres e resulta, em 70% dos casos, na superexpressão do biomarcador tumoral receptor de estrógeno alfa (ERα). No presente trabalho, foi desenvolvido um imunossensor eletroquímico descartável, sensível e de baixo custo, acoplado a um sistema microfluídico, como uma alternativa para se determinar ERα, uma vez que, não há relatos sobre a determinação desse composto usando esse método na literatura. O imunossensor foi desenvolvido pelo método de serigrafia, compondo de um eletrodo de referência, um contra-eletrodo e um arranjo de oito eletrodos de trabalho, todos descartáveis. Os eletrodos de trabalho foram modificados por layer-by-layer com cloreto de poli(dialildimetilamônio) (PDDA) e nanopartículas de ouro decoradas com glutationa (AuNP-GSH), a fim de sustentar, por ligação covalente, uma dupla fita de DNA contendo um elemento de resposta de estrógeno (dsDNA-ERE). Ainda, utilizam-se partículas magnéticas contendo milhares de enzimas e anticorpos, no qual as enzimas foram responsáveis pela resposta indireta do imunossensor e os anticorpos capturaram o analito na amostra. Uma vez capturado o analito, estes interagiram com o dsDNA-ERE imobilizado na superfície dos eletrodos de trabalho. Em intervalo linear de 16,6 a 513,3 fg mL-1 foram obtidos limite de detecção de 10,0 fg mL-1, limite de quantificação de 16,89 fg mL-1 e sensibilidade de 7,7 nA mL fg [ERα] -1. Por fim, foi possível testar o imunossensor frente a uma amostra real de lisado de células MCF-7, o que evidenciou que o dispositivo é uma escolha promissora para uso no tratamento e possível diagnóstico precoce do câncer de mama.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-09-01T12:21:37Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSETAÇAO_DEPOSITO.pdf: 1662534 bytes, checksum: 6bdb1ae293f1a65771c195438f64d3f0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T12:21:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSETAÇAO_DEPOSITO.pdf: 1662534 bytes, checksum: 6bdb1ae293f1a65771c195438f64d3f0 (MD5) Previous issue date: 2016-03-09 / CAPEs / A artrite reumatóide (AR) é uma doença crônico-degenerativa, sistêmica, auto-imune. Atualmente, o anticorpo antipeptídeo citrulinado cíclico (Anti-PCC) é considerado o marcador mais importante para o diagnóstico preditivo e prognóstico da AR. Neste trabalho, desenvolveu-se um imunossensor eletroquímico para detecção do Anti-PCC, a partir da modificação da superfície de um eletrodo de carbono vítreo com nanocompósito de óxido de grafeno reduzido-polissulfona (Gor-PSF) o qual apresenta boas características de aumento da área eletrocatalítica e imobilização de moléculas biológicas. Foram realizados capturas de imagens micrográficas por microscopia eletrônica de varredura da superfície do eletrodo de trabalho antes e após sua modificação, pelas quais foi possível comprovar uma superfície lisa não modificada sem estruturas adsorvidas após limpeza física, e que a superfície modificada com Gor-PSF apresentou um recobrimento ideal de toda a superfície com a presença de uma estrutura esponjosa comprovando a modificação da área de trabalho. Para captura do Anti-PCC, antígenos citrulina (CCP-Ag) foram imobilizados sobre a superfície eletródica do nanocompósito por provável ligação covalente entre os grupos amino e carboxilícos presentes no CCP-Ag e no óxido de grafeno reduzido, respectivamente. A técnica de voltametria de onda quadrada (VOQ) foi empregada para detecção do Anti-PCC, produzindo um imunossensor livre de marcação. Observou-se que o GOR-PSF foi capaz de aumentar a corrente de pico anódico (Ipa) 2,2 vezes mais, comparado com o controle (sem GOR-PSF) demonstrando que o filme proporcionou melhor capacidade eletrocatalítica, sendo também estável (coeficiente de variação da corrente < 1 %) avaliado por submeter o eletrodo a 20 ciclos consecutivos de voltametria cíclica. O imunossensor proposto apresentou uma boa linearidade com r=0,983 (p<0.003; n = 5) e limite de detecção de 0,004 ng/mL de Anti-PCC. A plataforma sensora demonstrou propriedades desejáveis de estabilidade, sensibilidade e reprodutibilidade na detecção de Anti-PCC com perspectivas de desenvolvimento de dispositivos “point-of-care”. / Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic degenerative disease, systemic, autoimmune. Currently, the cyclic citrullinated peptide (anti-CCP) is considered the most important predictive marker for the diagnosis and prognosis of RA. In this work, we developed an electrochemical immunosensor for the detection of anti-CCP, from the surface modification of a glassy carbon electrode with nanocomposite reduced-polysulfone graphene oxide (GOr-PSU) which has good rise characteristics of electrocatalytic area and immobilization of biological molecules. of micrographic images catches were performed by scanning electron microscopy of the surface of the working electrode before and after modification, by which it was possible to establish a smooth unmodified without adsorbed structures after physical cleaning, and that the modified surface with GOr-PSU presented an ideal coating the entire surface with the presence of a spongy structure confirming the modification of the work area. For capture of anti-CCP, citrulline antigens (Ag-CCP) were immobilized on the electrode surface of the nanocomposite probably due to covalent bond between the amino and carboxylic groups present in the CCP-Ag and the reduced graphene oxide, respectively. Square wave voltammetry technique (VOQ) was used for detection of anti-CCP producing a marking-free immunosensor. It was observed that the GOR-PSU was capable of increasing the anodic peak current (IPA) 2.2 times as compared with the control (without GOr-PSU) demonstrating that the electrocatalytic film provided better capacity also being stable (coefficient the variation of the current <1%) evaluated by subjecting the electrode 20 consecutive cycles of cyclic voltammetry. The proposed immunosensor exhibited good linearity with r = 0.983 (p <0.003; n = 5) and a detection limit of 0.004 ng / ml anti-CCP. The sensing platform demonstrated desirable properties of stability, sensitivity and reproducibility in the Anti-CCP detection with prospects of development of devices "point-of-care."

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-03-29T12:58:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação OK Priscila Mendonça.pdf: 4293178 bytes, checksum: abd6cd49376b8e172e0ce8adf3135b8d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-29T12:58:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação OK Priscila Mendonça.pdf: 4293178 bytes, checksum: abd6cd49376b8e172e0ce8adf3135b8d (MD5) Previous issue date: 2016-06-10 / CAPES / CNPQ / A dengue é uma doença viral considerada um dos maiores problemas de saúde pública nas regiões tropicais e sub-tropicais do mundo, sendo endemicamente prevalente em cerca de 112 países. Anualmente, afeta cerca de 50 a 100 milhões de pessoas, resultando em taxas de mortalidade entre 0,03% a 1,4%. É uma doença auto-limitante, caracterizada por febre, dor de cabeça, mialgia, entre outros sintomas. Na sua forma severa (síndrome do choque por dengue e febre hemorrágica), a doença pode levar ao óbito, principalmente em crianças. A proteína não estrutural 1 (NS1) do vírus dengue circula abundantemente no sangue durante toda a viremia, estando em níveis maiores na fase aguda; assim esta pode ser utilizada como marcador do estado agudo. Para o controle da infecção estão disponíveis testes diagnósticos baseados em ensaios sorológicos, testes imunocromatográficos e moleculares, entretanto estes apresentam limitações. O desenvolvimento de alternativas mais práticas, quantitativas e econômicas tem resultado na crescente busca por testes baseados em biossensores. Neste trabalho foi desenvolvido um imunossensor para detecção de NS1 baseado em uma plataforma nanoestruturada, constituída de nano-híbrido formado por nanotubos de carbono e filme polimérico de polietilenoimina montado sobre sistema eletroquímico constituído por microeletrodo de ouro. Os anticorpos monoclonais anti-NS1 foram imobilizados sobre a superfície eletródica por ligações covalentes com os nanotubos de carbono, permitindo um alta estabilidade durante as medidas. Todas as etapas de modificações da superfície eletródica foram caracterizadas eletroquimicamente, estrutural e morfologicamente através das técnicas de voltametria cíclica, espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FT-IR) e microscopia eletrônica de varredura, respectivamente. A espessura do filme nanoestruturado foi determinada por medidas piezoelétricas, em um sistema de microbalança de cristal de quartzo de acordo com a equação de Sauerbrey. A resposta analítica do imunossensor frente a proteína NS1 foi obtida por amperometria aplicando-se a técnica de voltametria de onda quadrada (VOC). O imunossensor apresentou resposta linear entre 0,1 a 0,6 µg.mL-1 de NS1. Os dados ajustados para a equação de regressão linear exibiu coeficiente de correlação de 0,996 (p << 0,01, n = 7) e um baixo erro relativo (aproximadamente 1%). O imunossensor apresentou limite de detecção de 0,038 µg.mL-1 e limite de quantificação de 0,1 µg.mL-1 de NS1, sendo similar aos obtidos na literatura, porém com a vantagem de não requerer antígenos ou anticorpos marcados (label-free) e utilizar técnica analítica mais simples (VOC). Os resultados indicam que o imunossensor apresenta sensibilidade compatível para detecção de NS1 em níveis sorológicos, permitindo ser uma ferramenta prática, rápida e econômica para o diagnóstico da dengue, sobretudo para detecção precoce da fase aguda. / Dengue is a viral disease considered as a major public health problems in tropical and sub-tropical world, endemically being prevalent in about 112 countries. Annually, it affects 50 to 100 million people, resulting in mortality rates of 0.03% to 1.4%. It is a self-limiting disease characterized by fever, headache, myalgia, among other symptoms. In its severe form (shock syndrome and dengue haemorrhagic fever), the disease can lead to death, especially in children. The nonstructural protein 1 (NS1) of the dengue virus circulates in blood abundantly throughout viremia, with higher levels in the acute phase; thus it can be used as a marker of the acute stage. For control of infection are available diagnostic testings based on serological assays, immunochromatographic and molecular assyas, however these have limitations. The development of more practical, quantitative and economic alternatives has resulted in growing demand for tests based on biosensors. In this work, it was developed an immunosensor for NS1 detection based on a nanostructured platform consisting of nanohybrid comprising carbon nanotubes and polymeric film polyethyleneimine mounted on electrochemical system consisting of gold microelectrode. The anti-NS1 monoclonal antibodies were immobilized on the electrode surface by covalent bonds with carbon nanotubes, allowing for a high stability during the measurements. All steps of electrode modifications were characterized by electrochemical, structural and morphologically techniques through cyclic voltammetry, infrared spectroscopy by Fourier transform (FT-IR) and scanning electron microscopy, respectively. The thickness of the nanostructured film was determined by piezoelectric system using a quartz crystal microbalance, according to the Sauerbrey equation. The analytical response of the immunosensor against NS1 protein was obtained by applying amperometry by square wave voltammetry (SWV). The immunosensor showed a linear response between 0.1 to 0.6 μg.mL-1 NS1. The data set into the linear regression equation showed a correlation coefficient of 0.996 (p << 0.01, n = 7) and a low relative error (about 1%). The immunosensor presented detection limit of 0.038 μg.mL-1 and a limit of quantification of 0.1 μg.mL-1 NS1, being similar to those obtained in literature, but with advantage of not requiring labeled antigen or antibody (label- free) and to require a more simple analytical technique (VOC). The results indicate that the achieved sensitivity was similar NS1 immunosensors, allowing it to be convenient, fast and economical tool for dengue diagnosis, particularly for early detection of acute phase.